專利名稱：Str分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法醫(yī)DNA檢驗(yàn)分析領(lǐng)域中一種STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
背景技術(shù)：
短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)，是人類基因組中分布較為廣泛的一類遺傳標(biāo)記，其核心序列一般由2 6個(gè)堿基組成，核心序列的重復(fù)單位數(shù)目不同導(dǎo)致同一基因座中存在不同的等位基因。STR序列絕大多數(shù)分布于基因組非編碼區(qū)，核心重復(fù)序列呈串聯(lián)排列，擴(kuò)增片段一般在400bp以下，目前在法醫(yī)個(gè)人識(shí)別及親子鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。隨著法醫(yī)DNA檢驗(yàn)分析技術(shù)的發(fā)展，其檢驗(yàn)技術(shù)經(jīng)歷了限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)等三個(gè)主要階段。與此同時(shí)，檢驗(yàn)過程中所用到的法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也在不斷發(fā)展。法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不僅可以用來進(jìn)行儀器的檢驗(yàn)和校準(zhǔn)、評(píng)價(jià)DNA檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性、研究新的DNA檢驗(yàn)方法，而且在實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的培訓(xùn)及能力考核中也發(fā)揮著重要作用。美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NationalInstitute of Standards and Technology,NIST)作為美國的商業(yè)部門，負(fù)責(zé)開發(fā)國家及國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在NIST提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，有多種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于法醫(yī)DNA的分型檢測(cè)。NIST在1992年即推出了基于RFLP 分型技術(shù)的SRM2390，以后隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，NIST又于1995年推出了基于VNTR分型的 SRM2391。自此以后，法醫(yī)DNA檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，尤其是STR基因座廣泛應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別中，能夠?qū)崿F(xiàn)數(shù)字化記錄檢驗(yàn)結(jié)果，檢驗(yàn)靈敏度大大提高。另外結(jié)合利用用復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)對(duì)基因座進(jìn)行擴(kuò)增，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了個(gè)體識(shí)別率，因而STR技術(shù)迅速取代原來的VNTR技術(shù)，成為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中最重要的技術(shù)手段。與此同時(shí)，針對(duì)STR技術(shù)的法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也成為研究重點(diǎn)，原來的SRM2391只有四個(gè)STR(TH01，F(xiàn)13A01，vWA和FES/ FPS)基因座的信息，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足法醫(yī)DNA檢中對(duì)STR基因座的信息要求，法醫(yī)DNA檢驗(yàn)要求SRM2391應(yīng)包括所提供的全部DNA樣本的STR信息，這些STR信息至少應(yīng)包括FBI實(shí)驗(yàn)室CODIS中的13個(gè)核心基因座。1998年6月NIST對(duì)SRM2391各個(gè)組分的25個(gè)基因座分型信息重新進(jìn)行了分型檢測(cè)，基因座包括FBI實(shí)驗(yàn)室CODIS中的13個(gè)核心基因座以及其它8個(gè)STR基因座，分別為 CSF1P0、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、 D21S11、F13A01、F13B、FES/FPS、FGA、LPL、Penta D、Penta Ε、THOl、TPOX, vWA、HLA-DQAU PolyMarker、DlS80和Amelogenin基因座。經(jīng)過分型檢測(cè)之后，NIST發(fā)布了 SRM2391的STR 基因分型值，新推出了針對(duì)STR檢測(cè)的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM2391b，SRM2391b包括SRM2391的細(xì)胞組分和基因組DNA組分，而去除了擴(kuò)增產(chǎn)物、D1S80等位基因分型混合物和DNA Marker。 只含有點(diǎn)樣于直徑6mm濾紙上的9947A和9948細(xì)胞，以及分別從9947A和9948兩種細(xì)胞系和其它八個(gè)個(gè)體所提取的基因組DNA。目前在STR分型檢驗(yàn)過程中，SRM2391b使用最為頻繁。在日常法醫(yī)DNA檢驗(yàn)過程中，一般使用9947A或9948的基因組DNA作為陽性對(duì)照來進(jìn)行質(zhì)量控制，每次擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果可以首先參考陽性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果，以此判斷檢測(cè)過程和結(jié)果分析是否準(zhǔn)確可靠。在實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可以及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員能力考核過程中也大量使用該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的組分進(jìn)行操作考核，這些應(yīng)用使SRM2391b成為目前最為常用的法醫(yī)DNA檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)之一。同時(shí)，法醫(yī)DNA分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)是DNA檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化過程中必不可少的環(huán)節(jié)，美國在法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究方面保持國際領(lǐng)先，其發(fā)展是隨著DNA檢測(cè)技術(shù)和檢驗(yàn)方法的不斷創(chuàng)新而不斷深入的，NIST提供的法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于法醫(yī)各種分析技術(shù)的質(zhì)量控制，例如線粒體DNA檢測(cè)所用的SRM2392和SRM2392-I、用于Y染色體DNA分型所用的SRM2395等。然而，對(duì)于我國法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常使用9947A和9948基因組DNA作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然而上述兩種基因組皆源自特定匿名供體的細(xì)胞所建立細(xì)胞系，通過后續(xù)的基因組DNA 提取及定量，最后完成定值并作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而使用的。上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有一些不足之處，一是基因型為自然人所具有；二是需進(jìn)行細(xì)胞系的建立，獲取難度大，工作量大，程序復(fù)雜，成本高。本發(fā)明所提供一種人工合成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，基因型組合不一定為自然人所具有，可按照一定的原則設(shè)計(jì)出特有的基因型組合，具有獨(dú)特的基因組合，可用作多種商業(yè)試劑盒所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種作為STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DNA混合物。上述DNA混合物包括如下1) -31)的31個(gè)DNA片段1)核苷酸序列至少為序列表中序列1的第271-318位所示的DNA片段、2)核苷酸序列至少為序列表中序列2第190-261所示的DNA片段、3)核苷酸序列至少為序列表中序列3第190-265所示的DNA片段、4)核苷酸序列至少為序列表中序列4第65-1 所示的 DNA片段、5)核苷酸序列至少為序列表中序列5第65-132所示的DNA片段、6)核苷酸序列至少為序列表中序列6第96-139所示的DNA片段、7)核苷酸序列至少為序列表中序列7第 44-103所示的DNA片段、8)核苷酸序列至少為序列表中序列8第44-115所示的DNA片段、 9)核苷酸序列至少為序列表中序列9第216-255所示的DNA片段、10)核苷酸序列至少為序列表中序列10第196-259所示的DNA片段、11)核苷酸序列至少為序列表中序列11第 105-144所示的DNA片段、12)核苷酸序列至少為序列表中序列12第105-148所示的DNA 片段、13)核苷酸序列至少為序列表中序列13第232-275所示的DNA片段、14)核苷酸序列至少為序列表中序列14第232-279所示的DNA片段、15)核苷酸序列至少為序列表中序列 15第230-285所示的DNA片段、16)核苷酸序列至少為序列表中序列16第230-281所示的 DNA片段、17)核苷酸序列至少為序列表中序列17第89-140所示的DNA片段、18)核苷酸序列至少為序列表中序列18第89-144所示的DNA片段、19)核苷酸序列至少為序列表中序列19第74-208所示的DNA片段、20)核苷酸序列至少為序列表中序列20第240-311所示的DNA片段、21)核苷酸序列至少為序列表中序列21第240-323所示的DNA片段、22)核苷酸序列至少為序列表中序列22第91-155所示的DNA片段、23)核苷酸序列至少為序列表中序列23第91-135所示的DNA片段、24)核苷酸序列至少為序列表中序列M第321-380所示的DNA片段、25)核苷酸序列至少為序列表中序列25第321-410所示的DNA片段、26)核苷酸序列至少為列表中序列26第170-197所示的DNA片段、27)核苷酸序列至少為序列表中序列27第170-201所示的DNA片段、28)核苷酸序列至少為序列表中序列觀第143-214 所示的DNA片段、29)核苷酸序列至少為序列表中序列四第143-198所示的DNA片段、30) 核苷酸序列至少為序列表中序列30第沈3-294所示的DNA片段和31)核苷酸序列至少為序列表中序列31第22-191所示的DNA片段。進(jìn)一步講，上述DNA混合物是由所述1)-31)的31個(gè)DNA片段組成。具體地講，所述1)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示、所述2)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列2的所示、所述3)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3 所示、所述4) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列4所示、所述5) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示、所述6) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示、所述7)DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列7所示、所述8) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列8 所示、所述9)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列9所示、所述10)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列10所示、所述11)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列11所示、所述 12)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列12所示、所述13)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列13所示、所述14) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列14所示、所述15) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列15所示、所述16)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列 16所示、所述17)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列17所示、所述18)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列18所示、所述19)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列19所示、 所述20) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列20所示、所述21) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列21所示、所述22)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列22所示、所述23) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列23所示、所述M) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列M所示、所述25) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列25所示、所述^ODNA片段的核苷酸序列如序列表中序列26所示、所述27) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列27所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列觀所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列四所示、所述30)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列30所示、所述 31)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列31所示。所述1) DNA 片段、2) DNA 片段、3) DNA 片段、4) DNA 片段、5) DNA 片段、6) DNA 片段、7) DNA 片段、8) DNA 片段、9) DNA 片段、10) DNA 片段、11) DNA 片段、1 DNA 片段、1 DNA 片段、14) DNA 片段、1 DNA 片段、16) DNA 片段、17) DNA 片段、1 DNA 片段、1 DNA 片段、20) DNA 片段、 21) DNA 片段、22) DNA 片段、23) DNA 片段、24) DNA 片段、25) DNA 片段、26) DNA 片段、27) DNA 片段、28) DNA片段、29) DNA片段、30) DNA片段和31) DNA片段的摩爾比是(1.8-2. 2) (0.8-1 .2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8—2 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8—2· 2) (1.8—2· 2)(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0 8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2)；優(yōu)選摩爾比是 2:1:1:1:1:2:1:1:2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:1:1:1:1 1 1 1 2 2。本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組質(zhì)粒混合物。本發(fā)明提供的重組質(zhì)?；旌衔锿ㄟ^如下方法制備將上述的1)-31)的31個(gè)DNA片段分別插入到31個(gè)載體中，得到分別含有1)_31)的31個(gè)DNA片段的31個(gè)重組載體；將所述31個(gè)重組載體混合，得到重組質(zhì)粒混合物。分別含有1)-31)的31個(gè)DNA片段的31個(gè)重組載體的摩爾比為(1.8-2.2) (0. 8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) ((1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2)(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1. 8-2. 2) (1. 8-2. 2)；優(yōu)選摩爾比是2 1 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1:1:1:1:2:2。上述31個(gè)載體可以是克隆載體。進(jìn)一步可以是相同的克隆載體，也可以是不同的克隆載體。這些載體具體可以是T載體。上述的DNA混合物或上述的重組質(zhì)粒混合物在STR分型擴(kuò)增中作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述STR分型擴(kuò)增的體系中，每IOul體系中，上述的1)-31)的31個(gè)DNA片段的摩爾數(shù)是 1. 01Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、
0.505X 10_9pmol>l· 01 X 10_9pmol >0. 505 X 10力pmol、0. 505 X K^pmol、1. 01 X 10力pmo 1、
1.OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
0.505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
1.01Xl(T9pmol、l. 01Xl(T9pmol。1上述STR分型擴(kuò)增的體系中，每IOul體系中，上述的分別含有1)-31)的31個(gè) DNA 片段的 31 個(gè)重組載體的摩爾數(shù)是 1. 01 X 10_9pmol>0. 505X l(T9pmol、0. 505X l(T9pmol、
0.505X10_9pmol>0. 505X K^pmol、1· 01 X 10力pmol、0· 505X K^pmol、0· 505X 10_9pmol>
1.OlX 10_9pmol>l. 01 X 10_9pmol>0. 505 X 10_9pmol >0. 505 X 10力pmol、0. 505 X 10力pmol、
0.505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
1.OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、l. 01 X l(T9pmol、1. 01Xl(T9pmol。本發(fā)明圍繞目前法醫(yī)分子遺傳學(xué)中業(yè)已發(fā)現(xiàn)的STR基因座位點(diǎn)，調(diào)查研究中國人群在上述位點(diǎn)中存在的全部等位基因，并利用生物統(tǒng)計(jì)技術(shù)研究每個(gè)等位基因的基因頻率分布。在此基礎(chǔ)上綜合利用分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，首次研發(fā)建立等位基因DNA信息庫，包含STR基因座位點(diǎn)全部等位基因DNA片段，進(jìn)而建立我國自主研發(fā)的法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物體系，形成特有的人工合成的STR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。


圖1為TyperTM15熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的STR分型圖譜。圖2為Identifilier 試劑盒的STR分型圖譜。圖3為PowerPlexl6擴(kuò)增試劑盒STR分型圖譜。圖4為Sinofiler 的STR分型圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。對(duì)現(xiàn)有的STR基因座進(jìn)行分析研究，首先選擇FBI實(shí)驗(yàn)室CODIS中的13個(gè)核心基因座以及目前商業(yè)化的美國ABI公司的AmpFISTR Identifiler 、Promega公司的 PowerPlexs 16以及公安部物證鑒定中心研制的DNATyperTM15商業(yè)化試劑盒所包含的其它 STR 基因座，這些基因座包括 CSF1P0、FGA、THOl、TPOX, vWA、D3S1358、D5S818、D7S820、 D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D2S1338、D19S433、Penta D、Penta Ε、 D6S1043、Amel。其次還可選擇其它業(yè)已發(fā)現(xiàn)但尚未包含在上述試劑盒中的STR基因座位點(diǎn)，例如 D19S253、D12S391、D1S1612、D9S302、D18S535、D15S816 等?？傊瑯?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含19 個(gè)基因座=CSFlPO, D2S1138、D3S1358、D5S818、D6S1043、 D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta E、 THOU VffA, TPOX 禾口 AmeL實(shí)施例1、19個(gè)基因座等位基因的獲得一、基因座CSFlPO等位基因(N = 12 (TAGA) 12)的獲得1、引物的設(shè)計(jì)在確定CSFlPO基因座位側(cè)翼序列的基礎(chǔ)上，引物設(shè)計(jì)如下forward primer TGGCAGAAGCCGGAGGTAA ；Reverse primer CCGATGAGCTGCTGCCTTG2、PCR 擴(kuò)增用上述引物對(duì)，以提取的人唾液的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中PCR體系及反應(yīng)參數(shù)如下a. PCR 擴(kuò)增體系(10 μ L)
5χ反應(yīng)液(含dNTP、Mg2+)2.0nL
正反向引物(ΙΟμΜ)0.2*2=0.4.nL
TaqDNA 聚合酶(5u/nL)0.2nL
DNA 模板(0.5ng/nL)l+OpL
去離子水_6.4nL_
總反應(yīng)體積10.0^b. PCR熱循環(huán)參數(shù)950C Ilmin ；94°C Imin, 60 °C Imin, 72°C lmin, 30cycles ；60°C 60min ；25°C Hold。 (其中退火溫度依據(jù)不同基因座的Tm值而有所變化。)經(jīng)過電泳、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段直接插入載體T載體(購自!Iomega公司， 名稱為pGEM-T Vector貨號(hào)為A3600)，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TAGA)12，重復(fù)次數(shù)N為12，位于序列表中序列1的第271-318位。3、根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將連接正確的重組克隆載體(命名為V-CSF1)保存?zhèn)溆?。二、基因?D2S1138 等位基因(N = 18 (TGCC) 7 (TTCC) (TGCC) (TTCC)9 ；N =
9Forward primer :ATATTGGGGAGCTGTTTCAGAReverse primer GTTCATTTCTTCCTAGCACTTAGAAC按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TGCC)7(TTCC) (TGCC) (TTCC)9，重復(fù)次數(shù)N為18，位于序列表中序列2的第190-261位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(TGCC)7(TTCC) (TGCC) (TTCC)ltl，重復(fù)次數(shù)N為19，位于序列表中序列3 的第190-265位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1338-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1338-2)保存?zhèn)溆?。三、基因座D3S1358 等位基因(N = 17 (AGAT) 13 (AGAC) 2 (AGAT) 2 ；N = 15 (AGAT) n (AGAC) 2 (AGAT) 2)的獲得Forward Primer TGTGTATTCCCTGTGCCTTTReverse Primer CCCAGGAGTTTGAGGCTGTA按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AGAT)13 (AGAC)2 (AGAT)2，重復(fù)次數(shù)N為17，位于序列表中序列4的第65-1 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(AGAT) n (AGAC)2 (AGAT)2，重復(fù)次數(shù)N為15，位于序列表中序列5的第 65-132 位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1358-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1358-2)保存?zhèn)溆?。四、基因座D5S818等位基因(N=Il (AGAT)11)的獲得Forward Primer TGTCCCAGATAATCTGTACReverse Primer :GGAATGCTTTAGTGCTTTT按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AGAT)11，重復(fù)次數(shù)N為11，位于序列表中序列6的第96-139位。將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-818)保存?zhèn)溆谩Ｎ?、基因座D6S1043 等位基因(N = 15 (AGAT) 15 ；N = 18 (AGAT) 18)的獲得Forward Primer GCAATAGTGTGCAAGGATGGReverse Primer TTGTATGAGCCACTTCCCAT按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列7所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AGAT)15，重復(fù)次數(shù)N為15，位于序列表中序列7的第44-103 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列8所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(AGAT)18，重復(fù)次數(shù)N為18，位于序列表中序列8的第44-115位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1043-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1043-幻保存?zhèn)溆?。六、基因座D7S820等位基因(N = IO(GATA)ltl)的獲得Forward Primer :ACTGCAACCTCCGCTTCTTReverse Primer GCATCAGTTTTCACACCAGAA按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(GATA)ltl，重復(fù)次數(shù)N為10，位于序列表中序列9的第216-255位。將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-820)保存?zhèn)溆?。七、基因座D8S1179等位基因(N = 16 (TCTA)16)的獲得Forward Primer TTAGGTAAAGCTGAGTCTGAAGTAAGReverse Primer CGTATGTATTCTTGTTTCCAGTTTCT按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列10所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TCTA)16，重復(fù)次數(shù)N為16，位于序列表中序列10的第196-259 位。將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-1179)保存?zhèn)溆?。八、基因座D13S317 等位基因(N = IO(TATC) 10 ；N = Il(TATC)11)的獲得Forward Primer :ATCACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA
Reverse Primer :ATATTCAGAGAGCTTGAATTGTTGG按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列11所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TATC)ltl，重復(fù)次數(shù)N為10，位于序列表中序列11的第 105-144 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列12所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(TATC)11,重復(fù)次數(shù)N為11，位于序列表中序列12的第105-148位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-317-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-317-幻保存?zhèn)溆?。九、基因座D16S539 等位基因(N = 11 (GATA) η ；N = 12 (GATA) 12 的獲得Forward Primer :ACTCTCAGTCCTGCCGAGGTReverse Primer CAAGCGAAAGTGATGCCATA按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列13所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(GATA)11，重復(fù)次數(shù)N為11，位于序列表中序列13的第 232-275 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列14所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(GATA)12，重復(fù)次數(shù)N為12，位于序列表中序列14的第232-279位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為v-539-l)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為ν-539-2)保存?zhèn)溆?。十、基因座D18S51 等位基因(N = 14 (AGAA) 14 ；N = 13 (AGAA) 13)的獲得Forward Primer GTGGATCAATTGAGCTCAGGAReverse Primer CAGAAGAAATCCTTGTGCGTA按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列15所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AGAA)14，重復(fù)次數(shù)N為14，位于序列表中序列15的第 230-285 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列16所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(AGAA)13，重復(fù)次數(shù)N為13，位于序列表中序列16的第230-281位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-51-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-51-幻保存?zhèn)溆谩Ｊ?、基因?D19S433 等位基因(N = 13 (AAGG)13 ；N = H(AAGG)14)的獲得Forward Primer GAGGTTGAGGCTGCAAAAAGReverse Primer GATAACCAGACCCCAGAGCA按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列17所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AAGG)13，重復(fù)次數(shù)N為13，位于序列表中序列17的第 89-140 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列18所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(AAGG)143，重復(fù)次數(shù)N為14，位于序列表中序列18的第89-144位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-433-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-433-幻保存?zhèn)溆?。十二、基因座D21S11等位基因(N = 29 (TCTA) 4 (TCTG) 6 (TCTA) 3TA (TCTA) 3TCA (TCTA) 2TCCATA (TCTA) n)的獲得Forward Primer :TTGTAGATGGTCTGTTATGGGACTReverse Primer :AGATGTTGTATTAGTCAATGTTCTCCA按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列19所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TCTA)4(TCTG)6(TCTA)3TA(TCTA)3TCA(TCTA)2TCCATA(TCTA)11，重復(fù)次數(shù)N為四，位于序列表中序列19的第74-208位。將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-11)保存?zhèn)溆?。十三、基因座FGA 等位基因(N = 21 (TTTC)3TTTT TTCT(CTTT) 13CTCC(TTCC)2 ；N = 18 (TTTC)3TTTT TTCT (CTTT) 10CTCC (TTCC) 2)的獲得Forward Primer :ATAAAATAATTGAAATGCAATCAAACCReverse Primer :GACCACAGCCACATACTTACCT按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列20所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TTTC)3TTTT TTCT (CTTT)13CTCC (TTCC)2，重復(fù)次數(shù)N為21， 位于序列表中序列20的第Μ0-311位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列21所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(TTTC)3TTTT TTCT (CTTT)iqCTCC (TTCC)2，重復(fù)次數(shù)N為18，位于序列表中序列21的第240-323位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-FGA-1)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-FGA-2)保存?zhèn)溆?。十四、基因座Penta D 等位基因(N = 9 (AAAGA)9 ；N = 13 (AAAGA) 13)的獲得Forward Primer :GAAGGTCGAAGCTGA AGTGReverse Primer :AGAATTCTTTAATCTGGACACAAG按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列22所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AAAGA)9，重復(fù)次數(shù)N為9，位于序列表中序列22的第 91-155 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列23所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(AAAGA) 13，重復(fù)次數(shù)N為13，位于序列表中序列23的第91-135位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-PentaD-I)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-PentaD-幻保存?zhèn)溆?。十五、基因座Penta E 等位基因(N = 12 (AAAGA) 12 ；N = 18 (AAAGA) 18)的獲得Forward Primer TTACCAACATGAAAGGGTACCAATAReverse Primer :TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTT按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列M所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(AAAGA)12，重復(fù)次數(shù)N為12，位于序列表中序列M的第 321-380 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列25所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(AAAGA)18，重復(fù)次數(shù)N為18，位于序列表中序列25的第321-410位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-PentaE-I)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-PentaE-幻保存?zhèn)溆?。十六、基因座THOl等位基因(N = 9 (CATT)9 ；N = 7 (CATT)7)的獲得Forward Primer CTAGTCAGCACCCCAACCAGReverse Primer CAGGGAGCCCAAGGTTCT按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。
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測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列洲所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(CATT)9，重復(fù)次數(shù)N為9，位于序列表中序列沈的第 170-197 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列27所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是(CATT)7，重復(fù)次數(shù)N為7，位于序列表中序列27的第170-201位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-ThOl-I)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為v-Thoi-幻保存?zhèn)溆谩Ｊ?、基因座VWA 等位基因(N = 14TCTA (TCTG)4 (TCTA) 9 ；N = 18TCTA (TCTG) 4 (TCTA) 13)的獲得Forward Primer TGTGAACTCCTCAGACTGATCCReverse Primer CAGATGATAAATACATAGGATGGATG按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果得到兩種PCR產(chǎn)物，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段分別插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列28所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是TCTA (TCTG)4 (TCTA)9，重復(fù)次數(shù)N為14，位于序列表中序列 28 的第 143-214 位。第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列四所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)的核心序列是TCTA(TCTG)4(TCTA)13，重復(fù)次數(shù)N為18，位于序列表中序列29的第 143-198 位。將含有第一種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-Vwa-Ι)和含有第二種擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為為V-Vwa-2))保存?zhèn)溆谩Ｊ恕⒒蜃鵗POX等位基因(N = 8 (GAAT)8)的獲得Forward Primer :CTCATGTTCCCACTGCTGACReverse Primer :GCTCAAACGTGAGGTTGACTC按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列30所示，其中短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的核心序列是(GAAT)8，重復(fù)次數(shù)N為8，位于序列表中序列30的第沈3-四4位。將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-TP0X)保存?zhèn)溆?。十九、基因座Amel等位基因的獲得Forward Primer :ACCTCATCCTGGGCACCCTGGReverse Primer :AGGCTTGAGGCCAACCATCAG按照步驟一中的方法，用本步驟引物對(duì)，從提取的人唾液的基因組DNA中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)跑膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T，重組后的克隆載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5 α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行PCR片段的測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列31所示，其中第1-21位與第192-212位是引物序列。將含有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆載體(命名為V-Amel)。實(shí)施例2、STR分型的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備將實(shí)施例1中步驟一至步驟十九制備得到的31個(gè)重組克隆載體逐步混合，隨著等位基因DNA片段的增加，由于DNA分子內(nèi)部存在競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，各個(gè)等位基因片段的相對(duì)平衡控制存在一定的難度，需不斷調(diào)整帶有不同等位基因DNA片段的重組質(zhì)粒至最適比例，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)最終建立多個(gè)DNA片段間的相對(duì)平衡狀態(tài)，最終形成滿足要求的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。其中31個(gè)重組克隆載體中的重組克隆載體V-CSFl 重組克隆載體V-1338-1 重組克隆載體V-1338-2 重組克隆載體V-1358-1 重組克隆載體V-1358-2 重組克隆載體V-818 重組克隆載體V-1043-1 重組克隆載體V-1043-2 重組克隆載體V-820 重組克隆載體V-1179 重組克隆載體V-317-1 重組克隆載體V-317-2 重組克隆載體V-539-1 重組克隆載體V-539-2 重組克隆載體V-51-1 重組克隆載體V_51_2 重組克隆載體 V-433-1 重組克隆載體V-433-2 重組克隆載體V-Il 重組克隆載體V-FGA-I 重組克隆載體V-FGA-2 重組克隆載體V-PentaD-I 重組克隆載體V-PentaD_2 重組克隆載體V-PentaE-I 重組克隆載體V-PentaE_2 重組克隆載體V-ThOl-I 重組克隆載體 V-ThO 1-2 重組克隆載體V-Vwa-I 重組克隆載體V-Vwa_2 重組克隆載體V-TPOX 重組克隆載體 V-Amel 的摩爾比為 2 :1:1:1:1:2:1:1:2:2:1:1:1:1:1:1:11 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)際制備過程中，上述順序的31個(gè)重組克隆載體是分別以 1. OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0· 505X 10力pmol、0· 505X K^pmol、0· 505X 10_9pmol> 1. OlX l(TViol、0. 505 X I(TiW)I、0· 505 X K^pmol、1· 01 X 10_9pmol > 1· OlX 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505X KTi3Pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、1. 01 X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>
0.505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol>
1.OlX 10_9pmol保存在小于IOul的TE或水中。實(shí)施例3、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的驗(yàn)證步驟一至步驟四的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中的擴(kuò)增體系均是10ul。一、Typer 15 試劑盒擴(kuò)增以實(shí)施例2實(shí)際制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為DNA模板，采用TyperTM15熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒(公安部物證鑒定中心)進(jìn)行按照操作說明書進(jìn)行擴(kuò)增。其DNA檢驗(yàn)圖譜如圖1所示， 其中圖譜清晰、峰型尖銳與預(yù)先設(shè)定的結(jié)果一致。二、Identifilier 試劑盒擴(kuò)增以實(shí)施例2實(shí)際制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為DNA模板，采用Identifilier 熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒(美國ABI公司)進(jìn)行按照操作說明書進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)設(shè)定為95°C，5min ； 940C lmin, 59°C lmin,72°C Imin ( 個(gè)循環(huán))；60°C 60min ;4°C永久保存。其 DNA 檢驗(yàn)圖譜如圖2所示，其中圖譜清晰、峰型尖銳與預(yù)先設(shè)定的結(jié)果一致。三、PowerPlex16 試劑盒擴(kuò)增
以實(shí)施例2實(shí)際制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為DNA模板，采用PowerPlex 16 熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒(美國Promega公司)進(jìn)行按照操作說明書進(jìn)行擴(kuò)增。其DNA檢驗(yàn)圖譜如圖3所示，其中圖譜清晰、峰型尖銳與預(yù)先設(shè)定的結(jié)果一致。四、Sinofiler 試劑盒擴(kuò)增以實(shí)施例2實(shí)際制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為DNA模板，采用Sinofiler 熒光復(fù)合擴(kuò)增試劑盒(美國ABI公司)進(jìn)行按照操作說明書進(jìn)行擴(kuò)增。其DNA檢驗(yàn)圖譜如圖4所示，其中圖譜清晰、峰型尖銳與預(yù)先設(shè)定的結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種作為STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DNA混合物，包括如下1) -31)的31個(gè)DNA片段1)核苷酸序列至少為序列表中序列1的第271-318位所示的DNA片段、2)核苷酸序列至少為序列表中序列2第190-261所示的DNA片段、3)核苷酸序列至少為序列表中序列 3第190-265所示的DNA片段、4)核苷酸序列至少為序列表中序列4第65-1 所示的DNA 片段、5)核苷酸序列至少為序列表中序列5第65-132所示的DNA片段、6)核苷酸序列至少為序列表中序列6第96-139所示的DNA片段、7)核苷酸序列至少為序列表中序列7第 44-103所示的DNA片段、8)核苷酸序列至少為序列表中序列8第44-115所示的DNA片段、 9)核苷酸序列至少為序列表中序列9第216-255所示的DNA片段、10)核苷酸序列至少為序列表中序列10第196-259所示的DNA片段、11)核苷酸序列至少為序列表中序列11第 105-144所示的DNA片段、12)核苷酸序列至少為序列表中序列12第105-148所示的DNA 片段、13)核苷酸序列至少為序列表中序列13第232-275所示的DNA片段、14)核苷酸序列至少為序列表中序列14第232-279所示的DNA片段、15)核苷酸序列至少為序列表中序列 15第230-285所示的DNA片段、16)核苷酸序列至少為序列表中序列16第230-281所示的 DNA片段、17)核苷酸序列至少為序列表中序列17第89-140所示的DNA片段、18)核苷酸序列至少為序列表中序列18第89-144所示的DNA片段、19)核苷酸序列至少為序列表中序列19第74-208所示的DNA片段、20)核苷酸序列至少為序列表中序列20第240-311所示的DNA片段、21)核苷酸序列至少為序列表中序列21第240-323所示的DNA片段、22)核苷酸序列至少為序列表中序列22第91-155所示的DNA片段、23)核苷酸序列至少為序列表中序列23第91-135所示的DNA片段、24)核苷酸序列至少為序列表中序列M第321-380所示的DNA片段、25)核苷酸序列至少為序列表中序列25第321-410所示的DNA片段、26)核苷酸序列至少為列表中序列26第170-197所示的DNA片段、27)核苷酸序列至少為序列表中序列27第170-201所示的DNA片段、28)核苷酸序列至少為序列表中序列觀第143-214 所示的DNA片段、29)核苷酸序列至少為序列表中序列四第143-198所示的DNA片段、30) 核苷酸序列至少為序列表中序列30第沈3-294所示的DNA片段和31)核苷酸序列至少為序列表中序列31第22-191所示的DNA片段。2.如權(quán)利要求1所述的DNA混合物，其特征在于它是由所述1)-31)的31個(gè)DNA片段組成。3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA混合物，其特征在于所述1)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示、所述2)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列2的所示、所述3)DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示、所述4) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列4 所示、所述5) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示、所述6) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示、所述7) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列7所示、所述8) DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列8所示、所述9) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列 9所示、所述10)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列10所示、所述11)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列11所示、所述12)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列12所示、 所述13) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列13所示、所述14) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列14所示、所述15)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列15所示、所述16) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列16所示、所述17) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列17所示、所述18) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列18所示、所述19) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列19所示、所述20) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列20所示、所述21) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列21所示、所述22) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列22所示、所述23)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列23所示、所述 24) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列M所示、所述25) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列25所示、所述沈)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列沈所示、所述27) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列27所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列 28所示、所述片段的核苷酸序列如序列表中序列四所示、所述30) DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列30所示、所述31)DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列31所示。4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的DNA混合物，其特征在于所述1)DNA片段、2)DNA片段、3)DNA片段、4)DNA片段、5)DNA片段、6)DNA片段、7)DNA片段、8)DNA片段、9)DNA片段、 10) DNA 片段、11) DNA 片段、1 DNA 片段、1 DNA 片段、14) DNA 片段、1 DNA 片段、16) DNA 片段、17) DNA 片段、18) DNA 片段、19) DNA 片段、20) DNA 片段、21) DNA 片段、22) DNA 片段、23) DNA 片段、24)DNA 片段、25)DNA 片段、26)DNA 片段、27)DNA 片段、28)DNA 片段、29)DNA 片段、30) DNA片段和31)DNA片段的摩爾比是(1. 8-2. 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0 .8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8—2· 2) (1.8—2· 2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2)(0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2)；優(yōu)選摩爾比是 2 :1:1:1:1:2:1:1:2:2: 1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2。5.一種重組質(zhì)粒混合物，其特征在于它是通過如下方法制備將權(quán)利要求1-4中任一所述的1)-31)的31個(gè)DNA片段分別插入到31個(gè)載體中，得到分別含有1)-31)的31個(gè)DNA片段的31個(gè)重組載體；將所述31個(gè)重組載體混合，得到重組質(zhì)?；旌衔?。6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)?；旌衔?，其特征在于分別含有1)-31)的31個(gè)DNA片段的 31 個(gè)重組載體的摩爾比為(1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1 .2) ((1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2 )(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (1.8-2.2) (0.8-1.2)(0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0.8-1.2) (0 8-1.2) (1.8-2.2) (1.8-2.2)；優(yōu)選摩爾比是2 :1:1:1:1:2:1:1:2:2:+1: 1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:2。7.如權(quán)利要求5或6所述的重組質(zhì)粒混合物，其特征在于所述載體為克隆載體，優(yōu)選為T載體。8.權(quán)利要求1-4中任一所述的DNA混合物或權(quán)利要求5-7中任一所述的重組質(zhì)粒混合物在STR分型擴(kuò)增中作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述STR分型擴(kuò)增的體系中，每IOul體系中，權(quán)利要求1-4中任一所述的1)-31)的31個(gè)DNA片段的摩爾數(shù)是1. 01 X l(T9pm0l、 0. 505X10_9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0· 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol> 0. 505Χ 10_9pmol>0. 505 X 10力pmol、1· 01 X 10力pmol、1· 01 X 10力pmol、0· 505 X 10力pmol、 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、1. 01 X 10力pmol、0· 505X K^pmol、0· 505X 10_9pmol> 0. 505X 10-9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 1 (^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X l(T9pmol、 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X l(T9pmol、0. 505X l(T9pmol、l. 01 X l(T9pmol、1. 01Xl(T9pmol。10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述STR分型擴(kuò)增的體系中，每IOul 體系中，權(quán)利要求5-7中任一所述的分別含有1)-31)的31個(gè)DNA片段的31個(gè)重組載體的摩爾數(shù)是 1. 01Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0. 505Xl(T9pmol、0.505X 10_9pmol>l· 01 X 10_9pmol >0. 505 X 10力pmol、0. 505 X K^pmol、1. 01 X 10力pmo 1、1.OlX 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol> 0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10_9pmol>0. 505X 10力pmol、0. 505X K^pmol、1. OlX 10_9pmol> 0. 505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>0.505Xl(T9pmol、0. 505X 10_9pmol>0. 505X K^pmol、0. 505X K^pmol、0. 505X 10_9pmol>1.01Xl(T9pmol、l. 01Xl(T9pmol。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該STR分型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是DNA混合物，包括核苷酸序列分別如1)-31)的31個(gè)DNA片段。本發(fā)明圍繞目前法醫(yī)分子遺傳學(xué)中業(yè)已發(fā)現(xiàn)的STR基因座位點(diǎn)，調(diào)查研究中國人群在上述位點(diǎn)中存在的全部等位基因，并利用生物統(tǒng)計(jì)技術(shù)研究每個(gè)等位基因的基因頻率分布。在此基礎(chǔ)上綜合利用分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，首次研發(fā)建立等位基因DNA信息庫，包含STR基因座位點(diǎn)全部等位基因DNA片段，進(jìn)而建立我國自主研發(fā)的法醫(yī)DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物體系，形成特有的人工合成的STR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102286476SQ20111019423
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者葉健, 趙興春 申請(qǐng)人:公安部物證鑒定中心