專利名稱：一種毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
毛頭鬼傘(Coprinus comatus)是近年來(lái)人工開發(fā)生產(chǎn)的一種具有商業(yè)潛力的珍稀食用菌新品，其性平味甘，有益脾胃、清神寧智、增食欲及治療痔瘡等功效，還具有一定的降血糖、降血脂、提高免疫活性、抗腫瘤、抗病毒和抗菌等生物學(xué)功能，所以被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為集“天然、營(yíng)養(yǎng)、保健”三種功能為一體的16種珍稀食用菌之一。毛頭鬼傘多糖具有較高的免疫活性，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性和非特異性免疫。 毛頭鬼傘多糖也具有較高的抗腫瘤活性，能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，具有預(yù)防和治療癌癥的潛在價(jià)值。硒(Se)是人體必需的一種微量元素，具有多種重要的生理功能，硒的攝入量不足與克山病、大骨節(jié)病、心血管疾病、腫瘤等許多疾病的發(fā)生有關(guān)。人體獲取硒主要從食物中吸收，食物來(lái)自于農(nóng)產(chǎn)品，農(nóng)產(chǎn)品從土壤中吸收硒，而土壤缺硒是世界上廣泛存在的問題， 地球土壤的自然含硒量一般也只有0. 1 2. 0 μ g/g，平均為02 μ g/g。我國(guó)恰恰處在全球的缺硒帶。目前，補(bǔ)硒劑主要有兩類，一是無(wú)機(jī)硒，如亞硒酸鈉、硒酸鈉；二是有機(jī)硒，包括有機(jī)硒制劑、富硒地區(qū)出產(chǎn)的天然產(chǎn)物，以及人工生物轉(zhuǎn)化的各種動(dòng)、植物和微生物產(chǎn)品。目前，生物體內(nèi)主要的含硒物質(zhì)是含硒氨基酸構(gòu)成的硒蛋白，除此之外，硒還能與多糖和核酸結(jié)合，形成含硒多糖和含硒核酸，它們與硒蛋白一起構(gòu)成生物內(nèi)主要的含硒生物大分子物質(zhì)，其中硒多糖作為目前的一個(gè)廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)。而目前還沒有關(guān)于毛頭鬼傘硒多糖提取方面相關(guān)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的旨在提供一種毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其包括以下步驟(1)采用深層發(fā)酵法，制備新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體；(2)取步驟(1)中的新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體進(jìn)行勻漿后用微波處理破壁；(3)向所述步驟(2)中的勻漿液中加入2 3倍體積的水，進(jìn)行浸提；(4)浸提液經(jīng)去除殘?jiān)螅瑵饪s，去除蛋白；( 將去除蛋白后的溶液裝入透析袋中進(jìn)行透析，然后加入3 4倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，將醇沉物于干燥后，得毛頭鬼傘硒多糖。本發(fā)明所述步驟(1)推薦的具體方法是1)取毛頭鬼傘菌菌種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)得到毛頭鬼傘菌斜面菌種；2)取步驟1)中的毛頭鬼傘菌斜面菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)得到液體菌種；
3)取步驟幻中所得的液體菌種轉(zhuǎn)接入含硒鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵至發(fā)酵液透明，氣味清香，按濕重計(jì)算菌絲體生物量為20 30g/L，pH為5 7時(shí)，停止發(fā)酵，得到富硒毛頭鬼傘菌絲體。本發(fā)明推薦的所述步驟1)中的斜面培養(yǎng)基的配方為土豆150 300g，葡萄糖 15 30g，蛋白胨 1. 5 3g, KH2PO4I 3g, MgSO4 · 7Η20 0· 5 1. 5g, VB1O. 01 0. 03g，瓊脂15 30g，蒸餾水lOOOmL，pH自然；培養(yǎng)溫度為25 30°C。本發(fā)明所述步驟幻中的搖瓶培養(yǎng)基推薦的配方為土豆150 300g，葡萄糖15 30g,蛋白胨 2 4g，KH2PO4I 3g, MgSO4 · 7Η20 0· 5 1. 5g, VB1O. 01 0. 03g,蒸餾水 IOOOmL, pH自然。所述的斜面菌種的接種量為0. 5 1. Ocm2菌落面積的菌絲。本發(fā)明推薦的所述步驟2)的搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速100 150r/min， 溫度25 ^°C，裝液量與容器體積比為1 2 3，培養(yǎng)時(shí)間3 4d。本發(fā)明推薦的所述步驟幻中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20 30g，玉米粉 20 40g，花生粕 2 6g，KH2P042 4g，MgSO4 · 7H20 0· 5 1. 5g, VB1IO 20Xl(T3g， Na2Se034 6X 10_3g，蒸餾水lOOOmL，pH自然；所述的液體菌種接種量為3 5%。本發(fā)明中的斜面培養(yǎng)基、搖瓶培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在配制好后進(jìn)行滅菌處理，然后再接種菌種，以保證得到的得到的富硒毛頭鬼傘菌絲體無(wú)其他雜菌污染。所述的滅菌處理采用現(xiàn)有的常規(guī)滅菌方式進(jìn)行即可。本發(fā)明所述步驟幻的發(fā)酵培養(yǎng)推薦的培養(yǎng)條件為生物反應(yīng)器溫度25 ^°C， 通氣量6 lOL/min，培養(yǎng)時(shí)間5 6d。在此條件下，不僅適合于毛頭鬼傘菌自身的生長(zhǎng)， 而且能讓毛頭鬼傘菌處于良性生長(zhǎng)狀態(tài)中，可以充分地吸收元素硒，利于菌體富集微量元素硒，并且也不會(huì)傷害毛頭鬼傘菌菌體，使生物量保持在較高的水平范圍。本發(fā)明所述步驟幻中發(fā)酵的放罐質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)酵液透明，氣味清香，菌絲體生物量(濕重)為20 30g/L，富硒率為80 85%，pH 5 7，且無(wú)任何雜菌污染。本發(fā)明所述步驟O)中微波處理的時(shí)間為6 lOmin，采用常規(guī)微波設(shè)備進(jìn)行處理。本發(fā)明所述步驟(3)中所述的勻漿液加入水后在90 100°C溫度下浸提2 4h。本發(fā)明所述步驟中所述的浸提液于7000 9000r/min離心，去除殘?jiān)?，上清液濃縮至原來(lái)的1/3后，采用Sevag法去除蛋白，得到去除蛋白后的溶液。本發(fā)明所述步驟(5)中去除蛋白后的溶液透析的時(shí)間為M 48h ；所述的醇沉在 0 4°C溫度下進(jìn)行，醇沉的時(shí)間為M 36h ；所述的醇沉物于35 45°C鼓風(fēng)干燥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明利用毛頭鬼傘菌對(duì)微量元素硒的富集與轉(zhuǎn)化能力，將毛頭鬼傘多糖與硒相結(jié)合，所得毛頭鬼傘硒多糖，兼具二者的生物學(xué)功能。(2)本發(fā)明采用液態(tài)深層發(fā)酵法培養(yǎng)富硒毛頭鬼傘菌絲體，與固態(tài)發(fā)酵法相比，具有生產(chǎn)周期短，沒有雜菌感染，生物量和富硒率的相對(duì)穩(wěn)定，因而產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。本發(fā)明易于機(jī)械化生產(chǎn)，自動(dòng)化管理控制。


圖1是本發(fā)明毛頭鬼傘菌硒多糖的工藝流程方框圖。
圖2是實(shí)施例--的毛頭鬼傘硒多I害鑒定的紫外光譜圖。
圖3是實(shí)施例--的毛頭鬼傘硒多I害鑒定的紅外光譜圖。
圖4是實(shí)施例二二的毛頭鬼傘硒多I害鑒定的紫外光譜圖。
圖5是實(shí)施例二二的毛頭鬼傘硒多I害鑒定的紅外光譜圖。
圖6是實(shí)施例三Ξ的毛頭鬼傘硒多I害鑒定的紫外光譜圖。
圖7是實(shí)施例三Ξ的毛頭鬼傘硒多I害鑒定的紅外光譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例一(1)制備新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體1)按下述配方配制斜面培養(yǎng)基，滅菌后，接種經(jīng)活化的毛頭鬼傘菌種，在28V溫度下培養(yǎng)至斜面上長(zhǎng)滿新鮮的毛頭鬼傘菌。斜面培養(yǎng)基配方為土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2P042g, MgSO4 · 7H201g， VB1O. Olg，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。2)按下述配方配制搖瓶培養(yǎng)基，滅菌后，挑取0. 5cm2菌落面積的毛頭鬼傘斜面菌種的菌絲，接種到三角瓶搖瓶培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速lOOr/min，溫度25°C，裝液量 75mL/250mL，培養(yǎng)3d，得液體菌種；搖瓶培養(yǎng)基的配方為土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg，VB1O. 01g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。3)按下述配方，在生物反應(yīng)器中配制250L發(fā)酵培養(yǎng)基，然后進(jìn)行滅菌。滅菌完成后將所得的液體菌種按接種量3% (ymm/ymm+&mimm)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中于溫度 25°C，無(wú)菌空氣通氣量6L/min的條件下，培養(yǎng)時(shí)間5d，得富硒毛頭鬼傘菌絲體，按濕重計(jì)算菌絲體生物量為23. 5g/L，富硒率為80. 3%。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20g，玉米粉40g，花生粕4g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg，VB1IOXKT3g, Na2Se034X l(T3g，蒸餾水 1000ml，pH 自然。(2)將新鮮的菌絲體勻漿后用微波處理6min。(3)將勻漿液加入2倍體積的水，于90°C浸提4h。(4)將浸提液于7000r/min離心IOmin后，去除殘?jiān)?，上清液濃縮至原來(lái)的1/3后， 采用Sevag法去蛋白，得到去除蛋白后的溶液。(5)將去除蛋白后的溶液裝入透析袋中透析24h后，加入3倍體積無(wú)水乙醇于0°C 醇沉Mh，將醇沉物于35°C鼓風(fēng)干燥后，得毛頭鬼傘硒多糖。(6)通過紫外光譜和紅外光譜對(duì)所得毛頭鬼傘硒多糖進(jìn)行鑒定，結(jié)果參見圖2 3。實(shí)施例二(1)制備新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體1)按下述配方配制斜面培養(yǎng)基，滅菌后，接種經(jīng)活化的毛頭鬼傘菌種，在25V溫度下培養(yǎng)至斜面上長(zhǎng)滿新鮮的毛頭鬼傘菌。斜面培養(yǎng)基配方為土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2P042g, MgSO4 · 7H201g，VB1O. Olg，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。2)按下述配方配制搖瓶培養(yǎng)基，滅菌后，挑取0. 75cm2菌落面積的菌絲，接種到三角瓶搖瓶培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，溫度，裝液量IOOmLASOmL,培養(yǎng)3d，得液體菌種；搖瓶培養(yǎng)基的配方為土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg，VB1O. 01g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。3)按下述配方，在生物反應(yīng)器中配制250L發(fā)酵培養(yǎng)基，然后進(jìn)行滅菌。滅菌完成后將所得的液體菌種按接種量4% (ymm/ymm+&mimm)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中于溫度 ^°C，無(wú)菌空氣通氣量8L/min的條件下，培養(yǎng)時(shí)間5d，得富硒毛頭鬼傘菌絲體，按濕重計(jì)算菌絲體生物量為Mg/L，富硒率為85%。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20g，玉米粉40g，花生粕4g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg, VB1IOXlO^g, Na2Se034. 5Xl(T3g，蒸餾水 1000ml, pH 自然。(2)將新鮮的菌絲體勻漿后用微波處理8min。(3)將勻漿液加入3倍體積的水，于100°C浸提濁。(4)將浸提液于9000r/min離心IOmin后，去除殘?jiān)?，上清液濃縮至原來(lái)的1/3后， 采用Sevag法去蛋白，得到去除蛋白后的溶液。(5)將去除蛋白后的溶液裝入透析袋中透析4 后，加入3倍體積無(wú)水乙醇于4°C 醇沉36h，將醇沉物于40°C鼓風(fēng)干燥后，得毛頭鬼傘硒多糖。(6)通過紫外光譜和紅外光譜對(duì)所得毛頭鬼傘硒多糖進(jìn)行鑒定，結(jié)果參見圖4 5。實(shí)施例三(1)制備新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體1)按下述配方配制斜面培養(yǎng)基，滅菌后，接種經(jīng)活化的毛頭鬼傘菌種，在30°C溫度下培養(yǎng)至斜面上長(zhǎng)滿新鮮的毛頭鬼傘菌。斜面培養(yǎng)基配方為土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，KH2P042g, MgSO4 · 7H201g， VB1O. 01g，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。2)按下述配方配制搖瓶培養(yǎng)基，滅菌后，挑取1. Ocm2菌落面積的菌絲，接種到三角瓶搖瓶培養(yǎng)基中，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，溫度25°C，裝液量75πι ν250ιΛ，培養(yǎng)4d，得液體菌種；搖瓶培養(yǎng)基的配方為土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH2P042g, MgSO4 · 7H20 lg, VB1O. 01g，蒸餾水lOOOmL，pH自然。其中，土豆采用的是土豆水提液。3)按下述配方，在生物反應(yīng)器中配制250L發(fā)酵培養(yǎng)基，然后進(jìn)行滅菌。滅菌完成后將所得的液體菌種按接種量5% (ymm/ymm+&mimm)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中于溫度 25°C，無(wú)菌空氣通氣量lOL/min的條件下，培養(yǎng)時(shí)間5d，得富硒毛頭鬼傘菌絲體，按濕重計(jì)算菌絲體生物量為24. 8g/L，富硒率為83.9%。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20g，玉米粉40g，花生粕4g，KH2P042g, MgSO4 ·7Η20 lg，VB1IOXKT3g, Na2Se035X l(T3g，蒸餾水 1000ml，pH 自然。(2)將新鮮的菌絲體高速勻漿后用微波處理lOmin。(3)將勻漿液加入3倍體積的水，于95°C浸提池。
(4)將浸提液于8000r/min離心IOmin后，去除殘?jiān)?，上清液濃縮至原來(lái)的1/3后， 采用Sevag法去蛋白，得到去除蛋白后的溶液。(5)將去除蛋白后的溶液裝入透析袋中透析3 后，加入3倍體積無(wú)水乙醇于4°C 醇沉30h，將醇沉物于45°C鼓風(fēng)干燥后，得毛頭鬼傘硒多糖。(6)通過紫外光譜和紅外光譜對(duì)所得毛頭鬼傘硒多糖進(jìn)行鑒定，結(jié)果參見圖6 7。上述實(shí)施并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，所有在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做修改和改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟(1)采用深層發(fā)酵法，制備新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體；(2)取步驟(1)中的新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體進(jìn)行勻漿后用微波處理破壁；(3)向所述步驟(2)中的勻漿液中加入2 3倍體積的水，進(jìn)行浸提；(4)浸提液經(jīng)去除殘?jiān)?，濃縮，去除蛋白；(5)將去除蛋白后的溶液裝入透析袋中進(jìn)行透析，然后加入3 4倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，將醇沉物于干燥后，得毛頭鬼傘硒多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)深層發(fā)酵法的具體方法是1)取毛頭鬼傘菌菌種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)得到毛頭鬼傘菌斜面菌種；2)取步驟1)中的毛頭鬼傘菌斜面菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)得到液體菌種；3)取步驟幻中所得的液體菌種轉(zhuǎn)接入含硒鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵至發(fā)酵液透明，氣味清香，按濕重計(jì)算菌絲體生物量為20 30g/L，pH為5 7時(shí)，停止發(fā)酵，得到富硒毛頭鬼傘菌絲體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，本發(fā)明推薦的所述步驟幻中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20 30g，玉米粉20 40g，花生粕2 6g， KH2P042 4g, MgSO4 · 7H20 0· 5 1. 5g, VB1IO 20X 10、，Na2Se034 6X l(T3g，蒸餾水 IOOOmL, pH自然；所述的液體菌種接種量為3 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，本發(fā)明所述步驟3)的發(fā)酵培養(yǎng)推薦的培養(yǎng)條件為生物反應(yīng)器溫度25 ^°C，通氣量6 lOL/min，培養(yǎng)時(shí)間5 6d。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中微波處理的時(shí)間為6 lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中所述的勻漿液加入水后在90 100°C溫度下浸提2 4h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中浸提液于7000 9000R/min離心，去除殘?jiān)?，上清液濃縮至原來(lái)的1/3后，采用Sevag法去除蛋白，得到去除蛋白后的溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中去除蛋白后的溶液透析的時(shí)間為M 48h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述的醇沉在 0 4°C溫度下進(jìn)行，醇沉的時(shí)間為M 36h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其特征在于，所述的醇沉物于；35 45 °C鼓風(fēng)干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毛頭鬼傘菌硒多糖的制備方法，其包括以下步驟(1)采用深層發(fā)酵法，制備新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體；(2)取步驟(1)中的新鮮的富硒毛頭鬼傘菌絲體進(jìn)行勻漿后用微波處理破壁；(3)向所述步驟(2)中的勻漿液中加入2～3倍體積的水，進(jìn)行浸提；(4)浸提液經(jīng)去除殘?jiān)?，濃縮，去除蛋白；(5)將去除蛋白后的溶液裝入透析袋中進(jìn)行透析，然后加入3～4倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，將醇沉物于干燥后，得毛頭鬼傘硒多糖。本發(fā)明利用毛頭鬼傘菌對(duì)微量元素硒的富集與轉(zhuǎn)化能力，將毛頭鬼傘多糖與硒相結(jié)合，所得毛頭鬼傘硒多糖，兼具二者的生物學(xué)功能。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102286568SQ20111019410
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者余杰, 崔鵬舉, 楊明泉, 覃煥達(dá), 賈愛娟 申請(qǐng)人:廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司