專利名稱：一種使單態(tài)性ssr標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于棉花分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種使單態(tài)性SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
SSR標(biāo)記多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、標(biāo)記多呈共顯性、在基因組中分散分布且以PCR 為基礎(chǔ)，而且又被證明存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中，因此已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)及目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選等領(lǐng)域。 有研究者利用半配合生殖獲得了 TM-lXHai7124的雜交后代所產(chǎn)生的58個(gè)單倍體及其雙倍體，最終構(gòu)建了第一張由以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記的遺傳圖譜，該圖譜首次將SSR標(biāo)記用于遺傳圖譜的構(gòu)建；也有人利用(E22X3-79) XE22的含有141個(gè)單株的BCl群體，構(gòu)建了一張完全基于SSR標(biāo)記的海陸種間遺傳連鎖圖。傳統(tǒng)的利用SSR標(biāo)記的方法是對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分析。具體原理是用一對(duì)特異的PCR引物(根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)的保守區(qū)域而設(shè)計(jì))，擴(kuò)增其中的微衛(wèi)星序列，通過聚丙酰胺凝膠電泳，即可顯示出個(gè)體間在此位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性。因?yàn)槲⑿l(wèi)星序列兩側(cè)區(qū)域在種間保守性往往較低，所以，微衛(wèi)星標(biāo)記存在的一個(gè)重要的局限性就是種間擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記就僅僅局限于同一個(gè)屬或相近屬的不同物種間的擴(kuò)增，這大大限制了 SSR 標(biāo)記在其他物種中的運(yùn)用，這無疑增加了 SSR標(biāo)記的開發(fā)成本?，F(xiàn)在雖然有一些從微衛(wèi)星序列衍生而來的其他分子標(biāo)記，不用分離單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)而獲得多個(gè)位點(diǎn)指紋圖譜，如 ISSRs、RAMP、cop ia_SSR、SAMPL等。但由于多位點(diǎn)微衛(wèi)星指紋圖譜帶型復(fù)雜，難以確定等位基因，大多為顯性標(biāo)記，這限制了它們的運(yùn)用的范圍。所以分離單個(gè)位點(diǎn)微衛(wèi)星序列，從而獲得共顯性SSR分子標(biāo)記仍是許多研究工作者的目標(biāo)。隨著ESTs數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展壯大，大量增加的ESTs為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了充足豐富的資源；棉花中的ESTs也隨著棉屬dbEST數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)大而不斷豐富，棉花 EST-SSR標(biāo)記相應(yīng)地大量涌現(xiàn)。但是EST-SSR標(biāo)記與基因組SSR標(biāo)記相比，多態(tài)性率更低。 所以，我們應(yīng)盡可能地提高所開發(fā)SSR標(biāo)記的利用效率，以相應(yīng)地降低SSR標(biāo)記的開發(fā)成本。溫度梯度凝膠電泳是最近出現(xiàn)的一種電泳方法，與傳統(tǒng)電泳分離方法(基于分子的大小和帶電荷數(shù)的多少)不同之處在于TGGE增加了一個(gè)新的分離參數(shù)，即分子構(gòu)象。穩(wěn)定的構(gòu)象由氫鍵和范德華力共同維系，并受環(huán)境溫度、鹽離子濃度、PH值等因素影響。如果環(huán)境溫度升高到某一限定點(diǎn)就可以破壞氫鍵和范德華力，這時(shí)分子即處于變性狀態(tài)，此過程就稱為熱變性。TGGE就是利用不同構(gòu)象的分子具有不同的變性溫度(Tm)來進(jìn)行分離的。 在正常情況下，DNA分子呈雙鏈結(jié)構(gòu)狀態(tài)；當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，DNA雙鏈開始解開，由完整的雙鏈變?yōu)榉植骐p鏈；如果溫度繼續(xù)升高，DNA雙鏈完全解開，變?yōu)閱捂淒NA。這種分子構(gòu)象的改變會(huì)影響分子在電泳時(shí)的遷移行為，因?yàn)镈NA雙鏈的打開直接導(dǎo)致遷移率下降。這種影響在兩條鏈即將完全解開時(shí)最大，此時(shí)分子的電泳速度最慢；而當(dāng)全部形成單鏈時(shí)，泳動(dòng)速度又會(huì)變快。Riesner等(1989)最先將這種技術(shù)應(yīng)用到DNA/RNA的分子構(gòu)象分析、序列變異分析和核酸-蛋白質(zhì)的相互作用研究中。雖然TGGE具有高分辨能力(能夠100%檢出只存在單堿基差異的突變個(gè)體)、電泳條件易于控制、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，但是TGGE需要專門的實(shí)驗(yàn)裝置(如德國(guó)Biomet ra公司的專利產(chǎn)品TGGE-System)。變性梯度凝膠電泳技術(shù)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離的主要原理是，在含有濃度線性遞增變性劑(尿素和甲酰胺的混合物)的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，部分解鏈的DNA雙鏈分子的電泳遷移率降低，而序列不同的DNA分子有著不同的解鏈行為，它們?cè)谀z的不同位置停止遷移，從而使長(zhǎng)度相同而序列不同的DNA片段分離。其基本原理與TGGE相似，都是基于變性臨界值的不同而使構(gòu)象在不同時(shí)間發(fā)生變化而在電泳中分離開。雖然DGGE不需要配備專門的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，而且同樣具有高分辨能力等優(yōu)點(diǎn)。但是變性劑濃度線性遞增的凝膠的人工操作比較困難。Bl^jifil^7^ ^5^iJ (cleavage amplified polymorphic sequence, CAPS) 類以PCR為基礎(chǔ)的共顯性的分子標(biāo)記。其基本原理是，先用已知位點(diǎn)的DNA序列去設(shè)計(jì)一套特異性的PCR引物(19-27bp)，然后用它去擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一 DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得的擴(kuò)增帶并進(jìn)行RFLP分析。CAPS標(biāo)記作為PCR和酶切技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，實(shí)際上是一些特異引物PCR標(biāo)記的一種延伸。當(dāng)這些特異引物的特異擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時(shí)，就用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性。它揭示的是特異PCR產(chǎn)物DNA序列限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)差異的信息，可以從單個(gè)堿基的差異進(jìn)行多態(tài)性分析。Ayse Gul Ince 等Q010)將CAPS標(biāo)記與SSR標(biāo)記相結(jié)合，將單態(tài)性的SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)變成了多態(tài)性SSR標(biāo)記， 但是只能局限于EST-SSR標(biāo)記，對(duì)基因組SSR標(biāo)記并不適用。單鏈構(gòu)象多態(tài)性目前廣泛用于分析分子種群生物學(xué)特征、遺傳性疾病檢測(cè)及特定功能基因或片段的分型等，是一種有效的分子標(biāo)記方法，是SNP的一種篩查方法。其基本原理是，在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，經(jīng)過使雙鏈DNA變性為單鏈，而單鏈DNA在凝膠中的遷移率除了與其長(zhǎng)短有關(guān)外，更主要的是取決于DNA單鏈間所形成的構(gòu)象。在非變性條件下，DNA單鏈內(nèi)部可以折疊形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，這種構(gòu)象由DNA單鏈的堿基排列順序所決定，其穩(wěn)定性依靠分子內(nèi)部的相互作用(主要為氫鍵)來維持。所以即便是相同長(zhǎng)度的DNA單鏈都會(huì)因其堿基順序不同，甚至單個(gè)堿基的改變?cè)斐蓡捂溈臻g構(gòu)象產(chǎn)生變化，引起單鏈在凝膠中電泳遷移率的差異，從而表現(xiàn)出多態(tài)性。因?yàn)镾SCP電泳技術(shù)無需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，常規(guī)電泳裝置即可；凝膠的制備也簡(jiǎn)單易行；對(duì)基因組SSR標(biāo)記和EST-SSR標(biāo)記同樣適用。所以我們使用了 SSCP電泳方法，實(shí)現(xiàn)了常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR標(biāo)記向多態(tài)性的轉(zhuǎn)變，并將親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記用于海陸種間遺傳連鎖圖的加密。目前尚未見利用SSCP電泳方法將單態(tài)性SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于將單態(tài)性的SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記，以提高已開發(fā)SSR標(biāo)記的多態(tài)性率，相應(yīng)地降低所開發(fā)SSR標(biāo)記的開發(fā)成本。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)它包括以下步驟
(1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 25-30 LlOx TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至IL ；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(IOul)為DNA 模板 25ng，Ix Buffer, 2. Ommol L_lMgC12，0. 25mmolL_ldNTPs，0· 2 μ mol L-lprimer,0. 8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 預(yù)變性5min ；94°C變性50sec、56°C復(fù)性45sec、72°C延伸60sec，34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 5min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，常溫條件下15W恒功率電泳 3-5h ；(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。本發(fā)明較好的技術(shù)方案是它包括以下步驟(1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 29 LlOx TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至IL ；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(IOul)為DNA模板 25ng，Ix Buffer, 2. Ommol L_lMgC12，0. 25mmolL_l dNTPs, 0. 2 μ mol L-lprimer,0. 8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；94°C變性50sec、56°C復(fù)性45sec、72°C延伸60sec，;34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 5min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，常溫條件下15W恒功率電泳 4h ；(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。本發(fā)明首次用SSCP電泳技術(shù)將單態(tài)性SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)為多態(tài)性標(biāo)記并將其應(yīng)用到棉花遺傳圖譜的構(gòu)建中。與現(xiàn)有使單態(tài)性標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記的方法相比，本發(fā)明的方法費(fèi)用低廉、操作簡(jiǎn)捷、適用范圍廣泛，是有效使單態(tài)性SSR標(biāo)記產(chǎn)生多態(tài)性的方法，極大地提高了 SSR標(biāo)記的利用效率。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述實(shí)施例1本發(fā)明包括以下步驟(1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 25 LlOx TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至IL ；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 (IOul)為DNA 模板 25ng，Ix Buffer, 2. Ommol L-I MgC12，0. 25mmolL_l dNTPs, 0. 2 μ mol L-I primer, 0. 8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 預(yù)變性5min ；94°C變性50sec、56°C復(fù)性45sec、72°C延伸60sec，34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 5min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，常溫條件下15W恒功率電泳 3h ；
(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。實(shí)施例2本發(fā)明包括以下步驟(1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 30 LlOx TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至IL ；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 (IOul)為DNA 模板 25ng，Ix Buffer, 2. Ommol L-I MgC12，0. 25mmolL_l dNTPs, 0. 2 μ mol L-I primer, 0. 8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 預(yù)變性5min ；94°C變性50sec、56°C復(fù)性45sec、72°C延伸60sec，34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 5min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，常溫條件下15W恒功率電泳 5h ；(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。實(shí)施例3本發(fā)明包括以下步驟(1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 29 LlOx TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至IL ；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 (IOul)為DNA 模板 25ng，Ix Buffer, 2. Ommol L-I MgC12，0. 25mmolL_l dNTPs, 0. 2 μ mol L-I primer, 0. 8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 預(yù)變性5min ；94°C變性50sec、56°C復(fù)性45sec、72°C延伸60sec，34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 5min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，常溫條件下15W恒功率電泳 4h ；(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。
權(quán)利要求
1. 一種使單態(tài)性SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記的方法，它包括以下步驟(1)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 25-30 LlOx TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至IL ；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系 (IOul)為DNA 模板 25ng，Ix Buffer, 2. Ommol L-I MgC12，0. 25mmolL_l dNTPs, 0. 2 μ mol L-lprimer,0. 8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min ；94°C變性50sec、56°C復(fù)性45sec、72°C延伸60sec，;34個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸 5min ；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，常溫條件下15W恒功率電泳 3-5h ；(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。
全文摘要
本發(fā)明屬于棉花分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種使單態(tài)性SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄳B(tài)性標(biāo)記的方法。它包括以下步驟(1)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為25-30∶1，10x TBE 100ml，然后用蒸餾水定容至1L；(2)常規(guī)電泳條件下單態(tài)性SSR引物對(duì)作圖群體兩親本的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(10ul)為DNA模板25ng，1x Buffer，2.0mmol L-1 MgCl2，0.25mmolL-1 dNTPs，0.2μmol L-1 primer，0.8U Taq DNA聚合酶，不足部分用無菌的雙蒸水補(bǔ)齊；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳；(4)產(chǎn)生多態(tài)性的SSR引物。本發(fā)明的方法費(fèi)用低廉、操作簡(jiǎn)捷、適用范圍廣泛，是有效使單態(tài)性SSR標(biāo)記產(chǎn)生多態(tài)性的方法，極大地提高了SSR標(biāo)記的利用效率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102304507SQ20111018618
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者張獻(xiàn)龍, 李夕梅, 林忠旭 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)