專利名稱：蛋白質(zhì)多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定提高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)的方法以及適用于所述方法的探針、引物、多肽或多核苷酸。
背景技術(shù)：
在西方世界，心血管疾病是兩種性別的首要死亡原因，而冠心病(特別是冠狀動(dòng)脈疾病)是心血管疾病的主要原因。絞痛(又稱為心絞痛)是心肌沒(méi)有接收到足夠氧時(shí)發(fā)生的暫時(shí)性胸痛或壓力感。當(dāng)動(dòng)脈變窄或被阻塞使得流向肌肉的血不能提高以滿足更多氧需求的時(shí)候，可發(fā)生局部缺血，引起疼痛(即絞痛)。
心絞痛通常由冠狀動(dòng)脈疾病引起，但其也可由其他冠心病引起。并非每個(gè)局部缺血患者都經(jīng)歷心絞痛。無(wú)絞痛的局部缺血稱為無(wú)癥狀心肌缺血。無(wú)癥狀心肌缺血的危險(xiǎn)在于心臟組織經(jīng)受損傷時(shí)患者不會(huì)注意。因此，對(duì)心臟的可能損傷通常直到最終引起心肌梗塞時(shí)才被患者或醫(yī)師識(shí)別。因此，非常需要用于識(shí)別血管和(特別是)冠狀動(dòng)脈退化(下文中稱為冠心病)的診斷原則使(人們)能夠進(jìn)行早期診斷并從而采取早期治療措施或預(yù)防措施。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的為提供用于診斷和治療冠心病的改進(jìn)的方法。
這通過(guò)鑒定個(gè)體中提高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)的方法完成，其中在樣品中確定Kir6.2蛋白質(zhì)位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸的存在。
在下文中，核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫(xiě)(例如氨基酸的三字母或單字母密碼)等同于全長(zhǎng)術(shù)語(yǔ)使用。
Kir6.2蛋白質(zhì)序列中多態(tài)性的鑒定可用于預(yù)測(cè)提高的或正常的冠心病(優(yōu)選冠狀動(dòng)脈疾病和/或心絞痛)風(fēng)險(xiǎn)，所述多態(tài)性包含Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23上的氨基酸改變(特別是從谷氨酸到賴氨酸)和/或位置337上的氨基酸改變(特別是從纈氨酸到異亮氨酸)。其可用于例如1)基于測(cè)序目的蛋白質(zhì)區(qū)域的方法(例如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)降解、質(zhì)譜法分析蛋白質(zhì)序列片段)；2)基于使用針對(duì)目的區(qū)域的抗Kir6.2抗體的方法(例如ELISA)；3)基于使用例如人、動(dòng)物、細(xì)菌或酵母細(xì)胞在體外測(cè)定中分析Kir6.2功能活性的方法。
本發(fā)明還涉及鑒定個(gè)體中提高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中在樣品中確定Kir6.2基因的一個(gè)或兩個(gè)(優(yōu)選兩個(gè))等位基因核苷酸序列上存在變異化，所述變異在Kir6.2蛋白質(zhì)中產(chǎn)生含有23位非谷氨酸的其他氨基酸和/或337位非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列。
Kir6.2基因一個(gè)或兩個(gè)等位基因核苷酸序列上多態(tài)性的鑒定可用于預(yù)測(cè)正常個(gè)體中(優(yōu)選糖尿病患者中)提高的冠心病(優(yōu)選冠狀動(dòng)脈疾病，更優(yōu)選心絞痛)風(fēng)險(xiǎn)，所述多態(tài)性引起Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23上的氨基酸改變(特別是從谷氨酸到賴氨酸)和/或位置337上的氨基酸改變(特別是從纈氨酸到異亮氨酸)。其可用于例如1)基于測(cè)序目的核苷酸區(qū)域的方法(例如焦磷酸測(cè)序、使用放射性標(biāo)記核苷酸或用熒光染料標(biāo)記的核苷酸的測(cè)序方法、用質(zhì)譜法分析序列片段)；2)基于核苷酸序列與目的區(qū)域雜交的方法(例如DNA微陣列)；3)基于分析目的核苷酸區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(例如TaqManTM分析)。
K+內(nèi)向整流通道Kir6.2(KCNJ11或Bir)是胰島ATP敏感鉀通道(IKATP)的一個(gè)亞單位。Kir6.2基因已被繪制于染色體11p15.1，而Kir6.2蛋白質(zhì)由390個(gè)氨基酸組成。由于其在葡萄糖刺激的胰島素分泌中的關(guān)鍵作用，Kir6.2被假定為涉及II型糖尿病發(fā)作的遺傳缺陷的候選基因(Yamada等(2001)Diabetes Metab Res Rev 17213-216)。
Kir6.2的若干蛋白質(zhì)、基因組多核苷酸序列和編碼多核苷酸序列為本領(lǐng)域知識(shí)水平公知。例如，若干個(gè)人蛋白質(zhì)/基因組DNA/編碼序列可從NCBI(國(guó)家生物技術(shù)信息中心；國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館，38A樓，Bethesda，MD20894，USA；www.ncbi.nhm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)以登錄號(hào)XP006398(Seq.IDNo.3)、(Seq.ID No.5)(蛋白質(zhì)序列)XM006398(Seq.ID No.4)、(Seq.ID No.6)(編碼序列)公開(kāi)獲得。一個(gè)基因組Kir6.2序列可從以NCBI登錄號(hào)NT 009307(人類染色體11基因組連續(xù)序列；大小8665930 bp)公布的基因組連續(xù)序列公開(kāi)獲得。mRNA/編碼/基因組Kir6.2序列的比對(duì)可使用下列因特網(wǎng)鏈接公開(kāi)獲得http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？SendTo＝on&db＝nucleotide&dispmax＝1&extrafeat＝-1&list_uids＝NT_009307.12&showndispmax＝1&view＝graph&_from＝5656500&_to＝565 9500&_sfrom＝5657000&_font＝default&_llen＝60&_slen＝4000。
如可從這樣的比對(duì)獲得的那樣，從位置5656500到5659500的序列串(SEQ ID No.13)包含基因組Kir6.2基因座。如圖2和圖3所示，不同的Kir6.2序列在蛋白質(zhì)序列位置23和/或337以及編碼序列的相應(yīng)位置上(分別為67/68/69和1009/1010/1011)不同。由于編碼序列由基因組DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生，就位置5657106/107/108和5657478/79/80而言的基因組序列的若干個(gè)不同變體也一定存在。
術(shù)語(yǔ)Kir6.2是指Kir6.2蛋白質(zhì)和核酸。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)包含多肽和由多于一條多態(tài)性鏈組成的蛋白質(zhì)，例如通過(guò)已知鍵(例如S-S橋)相互連接形成一個(gè)蛋白質(zhì)單元的多肽。術(shù)語(yǔ)Kir6.2蛋白質(zhì)可指任何Kir6.2蛋白質(zhì)或多肽或其功能性片段。Kir6.2片段可以是例如比Kir6.2蛋白質(zhì)或具有根據(jù)SEQID 1到8或13之一序列的核酸短的任何Kir6.2蛋白質(zhì)或核酸。Kir6.2片段優(yōu)選為Kir6.2的功能性片段。Kir6.2蛋白質(zhì)的功能性片段為具有至少一種Kir6.2功能(見(jiàn)例如上文)的蛋白質(zhì)片段。Kir6.2功能性核酸是例如編碼Kir6.2蛋白質(zhì)或其功能性片段的Kir6.2核酸片段，或其能夠與Kir6.2核酸特異性雜交。
術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)序列、氨基酸序列和多肽序列在本申請(qǐng)上下文中同義使用。
令人驚奇的是，發(fā)明者的研究揭示Kir6.2多肽位置23的最常見(jiàn)變體為Glu(谷氨酸，E)。另外，他們揭示位置337的最常見(jiàn)變體為Val(纈氨酸，V)。因此，在本申請(qǐng)范圍內(nèi)將各個(gè)位置上的這些氨基酸視為Kir6.2“野生型”。因此，如果在本申請(qǐng)上下文中涉及氨基酸序列中的改變或突變或較不常見(jiàn)變體，是指從該“野生型”位置23和/或337的野生型氨基酸衍生。
根據(jù)SEQ ID No.1(NCBI登錄號(hào)D50582；見(jiàn)圖1A)和2(NCBI登錄號(hào)D50582；見(jiàn)圖1B)的序列代表多肽序列位置23和337(分別為編碼序列的位置67/68/69或位置1009/1010/1011和基因組序列的位置5657106/07/08和5657478/79/80)的Kir6.2野生型。序列SEQ ID No.3(NCBI登錄號(hào)XP006398；圖2A)、SEQ ID No.4(NCBI登錄號(hào)XM006398，圖2B)來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，另一方面，新序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6在多肽序列的位置23或位置337各含有一個(gè)較不常見(jiàn)的氨基酸(以及核苷酸序列分別在位置67或位置1009的序列變異)。新序列SEQ ID No.7(圖4A)和8(圖4B)在氨基酸鏈的位置23和337均含有較不常見(jiàn)的變體氨基酸序列位置23的賴氨酸(編碼序列位置67/68/69為AAG)和位置337的異亮氨酸(編碼序列位置1009/1010/1011為ATC)。
單核苷酸多態(tài)性性(SNP)代表在單一核苷酸位置含有改變的給定核苷酸序列的變體；SNP為本領(lǐng)域公知的。
一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)已在Kir6.2基因中得到鑒定，其導(dǎo)致翻譯蛋白質(zhì)中氨基酸發(fā)生改變，例如E23K(蛋白質(zhì)位置23從谷氨酸交換為賴氨酸)、L270V(位置270從亮氨酸改變?yōu)槔i氨酸)和V377I。
在最近的研究中，Kir6.2變體E23K與高加索人種群中II型糖尿病連鎖(Hani等(1998)Diabetologia 411511-1515)。
然而，到目前為止，沒(méi)有獲得關(guān)于Kir6.2變體在患有心血管病癥的人中臨床效應(yīng)的數(shù)據(jù)。令人驚奇的是，發(fā)明者的研究第一次鑒定了Kir6.2蛋白質(zhì)氨基酸序列中位置23和/或337上突變的存在與冠心病素因的密切關(guān)系。
通過(guò)分析人DNA或Kir6.2蛋白質(zhì)檢測(cè)Kir6.2基因中遺傳多態(tài)性[特別是Kir6.2-23-KK(在Kir6.2基因兩個(gè)等位基因上相應(yīng)位置作為多態(tài)性結(jié)果在蛋白質(zhì)位置23具有賴氨酸(K)的Kir6.2變體)和Kir6.2-337-II(在Kir6.2基因兩個(gè)等位基因上相應(yīng)位置作為多態(tài)性結(jié)果在蛋白質(zhì)位置337具有異亮氨酸(I)的Kir6.2變體)]可用作例如(a)預(yù)防治療(特別是糖尿病患者中)冠心病(特別是冠狀動(dòng)脈疾病并且尤其是心絞痛)的遺傳標(biāo)記；(b)用于適應(yīng)藥物劑量的遺傳標(biāo)記；(c)用于藥物篩選建立適應(yīng)的遺傳標(biāo)記和(d)在階段/臨床研究中用于患者選擇的遺傳標(biāo)記。
通過(guò)能夠進(jìn)行冠心病素因的早期鑒定，本發(fā)明的方法能夠在諸如絞痛癥狀或?qū)π呐K組織損傷發(fā)生之前對(duì)患者進(jìn)行早期預(yù)防或治療對(duì)一個(gè)或兩個(gè)上述氨基酸改變或它們?cè)趍RNA或基因組水平上的潛在核苷酸的鑒定給予治療醫(yī)師明確的指示，以篩選對(duì)冠心組織或血管已經(jīng)持續(xù)的損傷或甚至在損傷和/或疼痛發(fā)生前開(kāi)出預(yù)防性藥物處方。
另外，所述氨基酸改變和冠心病發(fā)病之間令人驚奇的關(guān)聯(lián)通過(guò)與未顯示所述Kir6.2氨基酸改變的冠心病患者相比暗示需要更高劑量的某些藥物或指出某些/不同類型藥物療法的必要性，能夠更為有效地治療冠心病。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及調(diào)適用于治療和/或預(yù)防冠心病的藥物劑量的方法，其中確定個(gè)體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因一個(gè)或兩個(gè)等位基因上核苷酸序列的變異，其產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案還涉及選擇應(yīng)答冠心病藥物個(gè)體的方法，其中確定個(gè)體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a) Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因一個(gè)或兩個(gè)等位基因上核苷酸序列的變異，其產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
選擇個(gè)體優(yōu)選地涉及糖尿病患者藥物優(yōu)選用于預(yù)防或治療冠狀動(dòng)脈疾病，且最優(yōu)選用于心絞痛的藥物。優(yōu)選的，位置23的氨基酸改變?yōu)閺墓劝彼岬劫嚢彼岷?或位置337的氨基酸改變?yōu)閺睦i氨酸到異亮氨酸。樣品優(yōu)選為分離的蛋白質(zhì)或核酸、生物樣品(如組織學(xué)樣品)、細(xì)胞提取物或組織提取物或細(xì)胞。
用于治療或預(yù)防冠心病或心絞痛的大范圍藥物為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知。
由于本研究第一次鑒定了Kir6.2涉及冠心病潛在的或相關(guān)的過(guò)程，本發(fā)明另一方面涉及使用Kir6.2用于鑒定適用于治療和/或預(yù)防冠心病的藥物。
術(shù)語(yǔ)“藥物”是指能夠用于治療或預(yù)防個(gè)體疾病狀態(tài)的任何物質(zhì)或物質(zhì)的組合。物質(zhì)可以是任何生物的或化學(xué)的物質(zhì)或天然產(chǎn)物的提取物，其可以是純化的、部分純化的、合成的或通過(guò)生物化學(xué)或分子生物學(xué)方法制備的。
被認(rèn)為在預(yù)防或治療本發(fā)明不同方面含義的冠心病中有用或有活性的藥物可以是任何物質(zhì)或物質(zhì)的組合，所述物質(zhì)或物質(zhì)的組合對(duì)Kir6.2的功能之一或細(xì)胞中Kir6.2(蛋白質(zhì)或核酸)的量或Kir6.2的表達(dá)有影響。
為此，物質(zhì)可以調(diào)節(jié)Kir6.2的任何功能(例如上述功能)。物質(zhì)可例如通過(guò)直接相互作用和干擾Kir6.2多肽/蛋白質(zhì)或其片段調(diào)節(jié)Kir6.2蛋白活性。物質(zhì)還可在例如轉(zhuǎn)錄(起始、延伸、加工等)、轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性、翻譯水平調(diào)節(jié)Kir6.2表達(dá)。此外。其可以調(diào)節(jié)Kir6.2的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊等。物質(zhì)可直接或間接(間接是指通過(guò)(正或負(fù))干預(yù)影響Kir6.2功能/蛋白質(zhì)活性/表達(dá)等的天然信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián))行使上述效應(yīng)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及篩選適用于治療和/或預(yù)防冠心病的藥物的方法，包括步驟為a.提供含有Kir6.2的兩個(gè)樣品；b.將一個(gè)樣品與潛在的藥物接觸；c.測(cè)定存在或不存在潛在藥物時(shí)的Kir6.2活性或Kir6.2結(jié)構(gòu)；d.比較存在和不存在潛在藥物時(shí)的Kir6.2活性。
還可以將存在可能藥物物質(zhì)時(shí)的活性或結(jié)構(gòu)(即Kir6.2蛋白質(zhì)的折疊)與野生型Kir6.2蛋白質(zhì)的活性或結(jié)構(gòu)相比較。
優(yōu)選的，樣品含有或?yàn)榉蛛x的Kir6.2蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或分離的Kir6.2核酸或核酸片段。
在本發(fā)明上下文中，關(guān)于“分離的蛋白質(zhì)”、“分離的核酸”等的術(shù)語(yǔ)“分離的”是指從天然來(lái)源純化的蛋白質(zhì)/核酸以及重組的蛋白質(zhì)/核酸(當(dāng)然其也可是純化的)。
由于鑒定與冠心病相關(guān)聯(lián)的Kir6.2中氨基酸改變非?？赡苡绊懝谛牟≈委熀?或預(yù)防，用于上述用途或方法之一的Kir6.2可以是例如a)Kir6.2蛋白質(zhì)或其片段，其在Kir6.2蛋白質(zhì)中含有位置23上的非谷氨酸氨基酸和/或位置337上的非纈氨酸氨基酸；b)Kir6.2核酸或其片段，其在Kir6.2基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因核苷酸序列中含有變異，所述變異產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23上的非谷氨酸氨基酸和/或位置337上的非纈氨酸氨基酸；或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
可通過(guò)篩選潛在藥物能夠修復(fù)Kir6.2的蛋白質(zhì)功能和/或折疊的能力鑒定用于治療和/或預(yù)防冠心病的藥物活性物質(zhì)，所述Kir6.2相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)含有一個(gè)或兩個(gè)所述氨基酸改變。
藥物篩選方法和體系，尤其是使用分離的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段、表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞等以高通量形式使用的藥物篩選方法和體系為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知的。
合適的分析方法或分析體系、用于測(cè)量確定的靶分子活性或濃度的所謂測(cè)定法、在本發(fā)明上下文中作為潛在藥物化合物效應(yīng)參數(shù)的Kir6.2(所謂的靶標(biāo)，主要是蛋白質(zhì)或核酸)的活性或折疊為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知。測(cè)定可以是例如使用分離的或部分分離的組分的生物化學(xué)分析方法或系統(tǒng)，其中可檢測(cè)潛在藥物化合物的效應(yīng)，所述組分在確定的空間和時(shí)間中匯總為反應(yīng)混合物。測(cè)定的另一實(shí)例包括生物化學(xué)分析方法或系統(tǒng)，其中靶分子的活性和可能影響該活性的效應(yīng)可在細(xì)胞內(nèi)確定。
測(cè)定為監(jiān)測(cè)生物學(xué)過(guò)程的任何類型的分析方法或系統(tǒng)。代表生理學(xué)代謝途徑和病理學(xué)條件的分子級(jí)聯(lián)和機(jī)制在細(xì)胞或生物化學(xué)(體外)系統(tǒng)中被適當(dāng)?shù)貜?fù)制。因此可根據(jù)潛在藥物化合物干預(yù)或調(diào)節(jié)這些級(jí)聯(lián)或機(jī)制的能力確定其藥物學(xué)活性。
為了用于藥物篩選(特別是新藥物化合物的高通量篩選)，測(cè)定需要是可重復(fù)的并優(yōu)選還是可規(guī)?；头€(wěn)定的。測(cè)定優(yōu)選適用于高通量篩選能夠調(diào)節(jié)所研究靶分子活性的化學(xué)物質(zhì)。測(cè)定的類型取決于使用的靶分子(例如多肽或多核苷酸)類型和“讀出”(即參數(shù))，根據(jù)所述參數(shù)確定靶分子活性(見(jiàn)下文)。
不同類型的這類測(cè)定通常為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知并可從供應(yīng)商處購(gòu)得。
用于不同目的的合適測(cè)定法包括放射性同位素或熒光測(cè)定法，例如用于測(cè)量標(biāo)記成員與未標(biāo)記成員間相互作用(例如標(biāo)記的蛋白質(zhì)受體與它們的未標(biāo)記配體間的相互作用)的熒光偏振測(cè)定法(例如由Panvera商業(yè)提供的那些)或Packard BioScience(HTRF；ALPHAScreenTM)更多的實(shí)例包括基于細(xì)胞的測(cè)定法，其中細(xì)胞系穩(wěn)定(可誘導(dǎo)的或非可誘導(dǎo)的；染色體或附加體的)或瞬時(shí)表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)。這些測(cè)定法包括例如報(bào)告基因測(cè)定法，其中根據(jù)報(bào)道酶的活性測(cè)量某啟動(dòng)子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，所述酶的表達(dá)處于所述某啟動(dòng)子的控制下。對(duì)于該類型的測(cè)定法，必須構(gòu)建含有處于確定啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因的重組細(xì)胞系，所述啟動(dòng)子自身被研究或其被研究的信號(hào)級(jí)聯(lián)所調(diào)節(jié)。合適的報(bào)道酶通常為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知并包括螢火蟲(chóng)熒光素酶、海腎(renilla)熒光素酶(例如可從Packard reagents商購(gòu)的)、β-半乳糖苷酶。合適的細(xì)胞系依賴于測(cè)定的目的，但包括大多數(shù)容易轉(zhuǎn)染并容易培養(yǎng)的細(xì)胞系，例如HeLA、COS、CHO、NIH-3T3等。
測(cè)量細(xì)胞內(nèi)離子水平的測(cè)定法包括例如FLIPR(熒光成像板讀數(shù)器，可從Molecular Devices商購(gòu))測(cè)定法，其中氬激光器光源與冷CCD照相機(jī)組合使得能夠平行測(cè)量384孔板中細(xì)胞(例如神經(jīng)元細(xì)胞或其他細(xì)胞(例如重組或天然表達(dá)某些離子通道的細(xì)胞))內(nèi)的瞬間離子信號(hào)(例如Ca2+等)。FLIPR測(cè)定法使得能夠使用某些熒光染料(例如Fluo-3、Fluo-4)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣，或使用BCECF或BCPCF或特定FLIPR測(cè)定試劑盒監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH，或使用例如DiBAC或特定FLIPR測(cè)定試劑盒檢測(cè)膜電位改變，或監(jiān)測(cè)膜極性化?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)水平公知的其他染料監(jiān)測(cè)其他細(xì)胞內(nèi)離子，如鋅或鈉。其他類型的測(cè)定法和其他類型的讀出器通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
為了確定離子通道活性如Kir6.2(其控制細(xì)胞內(nèi)的離子濃度并因此可以用于測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的離子濃度)活性，可使用如膜電位敏感測(cè)定法和染料，例如DiBAC或基于FLIPR技術(shù)的Molecular Devices的膜電位測(cè)定試劑盒；使用FLIPR技術(shù)測(cè)量線粒體膜極化的JC-1染料；離子敏感染料等。基于膜片鉗的測(cè)定法或基于原子吸收光譜的銣離子流出測(cè)量特別適用于確定細(xì)胞內(nèi)鉀濃度等。其他的自動(dòng)設(shè)備和用于探測(cè)細(xì)胞內(nèi)某些變化和狀態(tài)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并包括例如ACUMEN bioscience的Acumen檢測(cè)器(允許三維重建適當(dāng)標(biāo)記物質(zhì)分布的基于熒光的激光掃描讀數(shù)器)。其他類型的測(cè)定法和其他類型的“讀出器”為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知。
就上述篩選方法或用途而言，優(yōu)選Kir6.2蛋白質(zhì)包含或具有根據(jù)SEQID No.3、5或7的序列。還優(yōu)選根據(jù)上述方法或用途的蛋白質(zhì)片段包含或具有根據(jù)SEQ ID No.3、5或7的序列。根據(jù)上述篩選方法的核酸優(yōu)選包含或具有根據(jù)SEQ ID No.4、6或8的序列。根據(jù)所述篩選方法的核酸片段優(yōu)選包含或具有根據(jù)SEQ ID No.4、6或8的序列。
非?？赡躃ir6.2位置23上野生型變體谷氨酸和/或位置337上野生型變體纈氨酸的所有的氨基酸改變影響冠心病的素因。因此，野生型的氨基酸改變基本上可以是任何類型。優(yōu)選位置23和/或337的氨基酸改變涉及分別具有與野生型氨基酸Glu23和Val337性質(zhì)不同的氨基酸摻入。因此，優(yōu)選將非極性或堿性氨基酸置于位置23代替酸性谷氨酸。甚至更優(yōu)選堿性氨基酸，特別是賴氨酸(Lys，K)。至于在野生型多肽中帶有非極性氨基酸纈氨酸(Val，V)的位置337，優(yōu)選將帶有比纈氨酸側(cè)鏈更大側(cè)鏈的非極性氨基酸、堿性或酸性氨基酸置于位置337。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，更優(yōu)選將帶有比纈氨酸側(cè)鏈更大側(cè)鏈的非極性氨基酸置于位置337。上述方法的最優(yōu)選的實(shí)施方案包括Kir6.2的位置23帶有賴氨酸和/或Kir6.2的位置337帶有異亮氨酸的變體。
由于遺傳密碼的不穩(wěn)定，存在若干種可能的引起上述氨基酸改變的核苷酸改變。遺傳密碼是公知的(作為參考，還參閱Alberts等MolecularBiology of the Cell，第三版)。就多肽中氨基酸位置23而言，可由根據(jù)SEQ.ID No.1的編碼序列位置67/68/69的一個(gè)或多個(gè)突變引起從谷氨酸到其他氨基酸的改變。就氨基酸位置337而言，可由根據(jù)SEQ.ID No.1的DNA序列位置1009或1010的一個(gè)或兩個(gè)突變引起從纈氨酸到其他氨基酸的改變。由于，如上所述，某些類型的氨基酸改變是優(yōu)選的，關(guān)于核苷酸序列優(yōu)選的也是引起所述優(yōu)選氨基酸改變的那些核苷酸改變。更優(yōu)選的為引起E23K(多肽序列位置23從谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?和/或V337I改變(位置337從纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔灰矃㈤唸D7)的核苷酸改變。最優(yōu)選的SNP為G67A(編碼序列位置67從G變?yōu)锳)和/或G1009A(編碼序列位置1009從G變?yōu)锳)。優(yōu)選的實(shí)施方案還包括影響Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23和/或337氨基酸序列的基因組序列內(nèi)的相應(yīng)核苷酸改變。
根據(jù)本發(fā)明不同方面優(yōu)選的實(shí)施方案，個(gè)體為糖尿病患者；更優(yōu)選糖尿病為II型糖尿病(糖尿病diabetes mullitus)。還優(yōu)選冠心病為心絞痛。
位置23的氨基酸改變?yōu)閺墓劝彼岬劫嚢彼岷?或位置337的氨基酸改變?yōu)閺睦i氨酸到異亮氨酸是有利的。樣品優(yōu)選為分離的蛋白質(zhì)或核酸、組織學(xué)樣品、細(xì)胞提取物或組織提取物或細(xì)胞。還優(yōu)選樣品從人體中分離。
本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及上述方法之一，其中確定樣品中Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II的存在。樣品可以是例如生物學(xué)(如組織學(xué))樣品、細(xì)胞提取物或組織提取物或細(xì)胞，并且樣品還優(yōu)選從人體中分離。
生物材料和生物樣品包括例如細(xì)胞、組織和器官(例如腦、血、肝、脾、腎、心、血管等)制品或部分，優(yōu)選來(lái)自脊椎動(dòng)物，更優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物包括人。還包括來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞，優(yōu)選包括來(lái)自多細(xì)胞生物和組織(如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3)或單細(xì)胞生物如酵母(例如裂殖酵母(s.pombe)或釀酒酵母(s.cerevisiae))細(xì)胞的真核細(xì)胞培養(yǎng)物，或原核細(xì)胞培養(yǎng)物，優(yōu)選畢赤酵母(Pichia)或大腸桿菌。來(lái)自組織的細(xì)胞和樣品可通過(guò)公知的技術(shù)獲得，例如抽血、組織穿刺或外科技術(shù)。重組分子的制備和從細(xì)胞或組織中純化天然存在分子如DNA或蛋白質(zhì)，以及細(xì)胞或組織提取物的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(參閱例如下文所列標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))。
氨基酸改變的存在可例如通過(guò)分析個(gè)體基因組DNA確定。合適的技術(shù)為本領(lǐng)域公知并包括例如不同的PCR技術(shù)、芯片雜交、狹線/斑點(diǎn)或Southern印跡。
PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為能夠特異擴(kuò)增序列串的體外技術(shù)，所述序列串在其5’和3’鄰近處有已知序列的核苷酸串。為了擴(kuò)增給定序列，待擴(kuò)增序列5’區(qū)域的序列已知便足夠了。在該情況下，應(yīng)首先產(chǎn)生待擴(kuò)增多核苷酸的片段(這可通過(guò)已知技術(shù)如用限制性內(nèi)切酶消化完成)。然后通過(guò)連接酶(例如可從不同供貨商處購(gòu)得的T4 DNA連接酶)將已知序列的DNA分子(接頭)偶聯(lián)到產(chǎn)生的多核苷酸片段3’端。因此產(chǎn)生的序列被兩個(gè)已知序列包圍——已知的5’序列和3’已知接頭序列，使能夠通過(guò)PCR特異擴(kuò)增(在該情況下為接頭介導(dǎo)的PCR＂ImPCR＂)。
為了擴(kuò)增選擇的序列，使用短的單鏈DNA分子(引物)，其與組成待擴(kuò)增多核苷酸序列的序列串互補(bǔ)。多核苷酸模板可以是DNA或RNA。然后將引物與標(biāo)準(zhǔn)單鏈模板退火并在確定和公知的條件下通過(guò)特異酶——所謂的聚合酶(識(shí)別DNA作為模板并產(chǎn)生互補(bǔ)DNA多核苷酸的DNA聚合酶或識(shí)別RNA作為模板并產(chǎn)生互補(bǔ)DNA多核苷酸的反轉(zhuǎn)錄酶)延伸，從而產(chǎn)生與模板鏈序列互補(bǔ)的新DNA鏈。通過(guò)選擇確定序列在確定溫度和確定時(shí)間間隔下周期性重復(fù)的溫育步驟，產(chǎn)生變性/退火/聚合步驟的序列，其最后引起目的多核苷酸的指數(shù)式擴(kuò)增。為了能夠應(yīng)用必須的退火溫度而不破壞聚合酶，使用良好耐受高達(dá)95℃和更高溫度的熱穩(wěn)定酶，例如Taq-DNA聚合酶(來(lái)自嗜熱水生菌(thermus aquaticus)的DNA聚合酶)、PFU等，二者均可從不同的供應(yīng)商處購(gòu)得。合適的聚合酶選擇取決于使用目的(例如用于通過(guò)PCR克隆時(shí)，優(yōu)選選擇有校對(duì)能力的聚合酶如PFU)并屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)。
典型的PCR反應(yīng)包含多核苷酸模板(例如0.01到20ng)、兩種合適的引物(濃度例如各0.2到2μM)、dNTP(濃度例如各200μM)、1到2mMMgCl2和1到10單位熱穩(wěn)定聚合酶如Taq。典型的組分和緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并通常可通過(guò)商業(yè)供貨商獲得。
合適的引物可通過(guò)根據(jù)公知方案的化學(xué)合成產(chǎn)生。這類引物也可通過(guò)不同的供應(yīng)商如MWG Biotech等商業(yè)獲得。
DNA和RNA模板以及cDNA模板可通過(guò)公知的標(biāo)準(zhǔn)操作(參閱例如下文標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn))產(chǎn)生并且還可從如Promega和Stratagene等商業(yè)供應(yīng)商處購(gòu)得。
含有基因組DNA(和/或RNA和/或蛋白質(zhì))的生物樣品的制備方法為本領(lǐng)域公知。作為參考參閱例如Sambrook等，或Current Protocols inMolecular Biology或Protein Science。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在e.從個(gè)體制備含有基因組DNA的生物樣品。
F.如果不用原位方法直接分析靶序列，來(lái)自根據(jù)a)的樣品的基因組DNA必須是分離的或至少部分純化的，所述原位方法例如原位PCR或直接使用上述樣品(例如組織樣品或細(xì)胞)的直接基因組測(cè)序；g.使用能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物通過(guò)使用PCR反應(yīng)擴(kuò)增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含對(duì)應(yīng)于編碼序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的基因組kir6.2序列的核苷酸位置，h.測(cè)序根據(jù)c)的多核苷酸片段。
就根據(jù)SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列而言，上述基因組序列內(nèi)的“相應(yīng)位置”分別為5657106/5657107/5657108和5657978/5657979/5657980(見(jiàn)圖8)。
基因組序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的存在引起蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)上述氨基酸改變，可隨后根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定(例如使用標(biāo)記的測(cè)序引物并進(jìn)行放射自顯影或熒光檢測(cè)信號(hào))。
用于擴(kuò)增上述多核苷酸片段的合適引物的選擇和設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)。作為參考，參閱例如Sambrook等或Current Protocols inMolecular Biology。這同樣適用于制備所述引物，其也可從供應(yīng)商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處定購(gòu)。優(yōu)選地，至少使用根據(jù)SEQ.IDNo.9、10、11或12的引物之一(見(jiàn)圖5)用于測(cè)序和/或擴(kuò)增。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.制備含有染色體/基因組DNA的生物樣品。
b.從根據(jù)a)的樣品中分離染色體DNA。
c.將其固定在載體上。
d.用一個(gè)或多個(gè)探針與固定的DNA雜交，所述探針在嚴(yán)格條件下能夠與含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的Kir6.2序列以與野生型Kir6.2序列相比更高的親和力雜交，所述核苷酸改變引起一個(gè)或兩個(gè)所述氨基酸改變。
雜交可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法如放射自顯影法或熒光使用相應(yīng)標(biāo)記的探針成像。
基因組Kir6.2序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改變的核苷酸改變的存在或不存在可隨后通過(guò)將來(lái)自患者樣品的雜交模式和/或強(qiáng)度與含有野生型基因組DNA的對(duì)照樣品的雜交模式和/或強(qiáng)度比較來(lái)確定。
分離的多核苷酸和寡核苷酸可用于在不同嚴(yán)格度條件下雜交。
嚴(yán)格度描述了影響兩個(gè)單鏈核酸分子雜交或退火特異性的反應(yīng)條件。嚴(yán)格度和由此的反應(yīng)特異性取決于(特別是)用于反應(yīng)的溫度和緩沖液條件可通過(guò)例如提高反應(yīng)溫度和/或降低反應(yīng)緩沖液離子強(qiáng)度來(lái)提高嚴(yán)格度和由此的特異性。低嚴(yán)格度條件(以及由此的低反應(yīng)特異性和雜交特異性)存在于例如在室溫2×SSC溶液中進(jìn)行雜交。高嚴(yán)格度條件包括例如在68℃0.1×SSC和0.1％SDS溶液中的雜交反應(yīng)。
本發(fā)明不同方面中嚴(yán)格條件下雜交優(yōu)選理解為1)在65℃將標(biāo)記的探針與待分析的核酸樣品雜交，或在寡核苷酸探針情況下在比由寡核苷酸和樣品組成的雙鏈體退火或解鏈溫度(退火和解鏈溫度在下文中理解為同義)低5℃，于50mM Tris pH7.5、1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、0.5mg/ml變性的鮭魚(yú)精DNA或鯡魚(yú)精DNA中過(guò)夜。
2)室溫在2×SSC中洗滌10分鐘。
3)65℃(或在寡核苷酸情況下低于退火溫度5℃)在1×SSC/0.1％SDS中洗滌30分鐘。
4)65℃(或在寡核苷酸情況下低于退火溫度5℃)在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌30分鐘。
寡核苷酸為多核苷酸并優(yōu)選具有15到30，優(yōu)選20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的DNA片段。退火溫度根據(jù)公式Tm＝2×(A+T的數(shù)目)+4×(G+C的數(shù)目)℃確定。
為了制備2×SSC或0.1×SSC(或任何其他種類SSC稀釋液)，相應(yīng)地稀釋例如20×SSC溶液。20×SSC包括3M NaCl/0.3M檸檬酸鈉×2H2O。
進(jìn)行雜交反應(yīng)前，(如果需要)在進(jìn)行電泳分離后(然后Southern印跡(DNA)或Northern印跡(RNA))或不進(jìn)行電泳分離(然后狹線或斑點(diǎn)印跡)將多核苷酸轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)哪ど?，例如尼龍膜或硝酸纖維素膜。使用適當(dāng)標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。合適的標(biāo)記技術(shù)為例如放射標(biāo)記或使用熒光染料標(biāo)記。探針為單鏈的聚核糖核苷酸或聚脫氧核糖核苷酸，其為天然單鏈的或通常是雙鏈并已通過(guò)變性成為單鏈的。該探針通過(guò)堿基配對(duì)與DNA或RNA樣品(其也為單鏈狀態(tài))結(jié)合。
DNA可例如直接固定在芯片基質(zhì)上(例如Affymetrix Chips等)或于適當(dāng)?shù)哪ど?例如硝酸纖維素、尼龍或其他適用于斑點(diǎn)或狹線印跡的)，或其可轉(zhuǎn)移至凝膠基質(zhì)上、電泳分離并印跡在合適的膜上(例如硝酸纖維素、尼龍或其他適用于Southern印跡的)。合適的芯片或膜以及相應(yīng)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知。上述方法如芯片雜交、斑點(diǎn)/狹線或Southern印跡為本領(lǐng)域公知(作為參考涉及例如下文所列文獻(xiàn))。
合適探針的選擇和設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域公知(參閱例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。這同樣適用于所述探針的制備，其也可從供應(yīng)商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處獲得。合適的為例如與基因組Kir6.2序列部分有更高親和力的任何探針，所述序列部分包含對(duì)應(yīng)于編碼序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的那些核苷酸位置，所述編碼序列含有至少一個(gè)引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23和/或位置337的至少一個(gè)上述氨基酸改變的核苷酸改變。合適的探針為例如可能覆蓋根據(jù)圖6的基因組核苷酸三聯(lián)體的探針。
氨基酸交換的存在還可通過(guò)分析個(gè)體RNA確定。合適的技術(shù)為本領(lǐng)域公知并包括例如RT PCR技術(shù)、芯片雜交或Northern印跡。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.提供來(lái)自個(gè)體的含有RNA的生物樣品。
b.如果不直接分析RNA(例如通過(guò)原位PCR)，該RNA是從根據(jù)a)的樣品中分離的或至少部分純化的。
c.使用能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物通過(guò)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含Kir6.2 cDNA序列的位置67和/或1009。
d.測(cè)序根據(jù)c)的多核苷酸片段。
測(cè)序可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。產(chǎn)生的序列梯的成像可通過(guò)例如使用熒光或放射性標(biāo)記的引物或核苷酸進(jìn)行。
Kir6.2編碼序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改變的一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的存在或不存在可隨后通過(guò)分析獲得的序列并將其與野生型Kir6.2序列比較確定。
合適引物的選擇和設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域公知(參閱例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。這同樣適用于所述引物的制備，其也可從供應(yīng)商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處獲得。合適的為例如能夠擴(kuò)增至少包含Kir6.2編碼序列部分的多核苷酸的任何引物集合，所述部分跨越位置67到69和/或位置1009到1011。優(yōu)選的引物為例如根據(jù)SEQ ID No9到12的引物。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.從個(gè)體制備含有RNA的生物樣品。
b.從根據(jù)a)的樣品中分離RNA。
c.將RNA固定在載體上。
d.用一個(gè)或多個(gè)探針與固定的RNA雜交，所述探針在嚴(yán)格條件下能夠與編碼在位置23上含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337上含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA以與編碼在位置23上含谷氨酸和/或在位置337上含纈氨酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA相比更高的親和力雜交。
雜交可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法如放射自顯影法或熒光使用相應(yīng)標(biāo)記的探針成像。
Kir6.2編碼序列中引起Kir6.2蛋白位置337和/或23氨基酸改變的核苷酸改變的存在或不存在可隨后通過(guò)分析雜交模式和/或信號(hào)強(qiáng)度并與含有Kir6.2野生型RNA的對(duì)照樣品的雜交模式和/或信號(hào)強(qiáng)度比較確定。RNA可在雜交前例如直接固定在芯片基質(zhì)上或合適的膜上，或其可以置于凝膠基質(zhì)上并在進(jìn)行凝膠電泳后印跡在合適的膜上(Northern印跡)。作為參考參閱例如下文所列文獻(xiàn)。
合適探針的選擇和設(shè)計(jì)為本領(lǐng)域公知(參閱例如Sambrook等或Current Protocols in Molecular Biology)。這同樣適用于所述探針的制備，其也可從供應(yīng)商(例如MetaBion，Martinsried，Germany)處獲得。合適的為例如與包含位置67到69和/或1009到1011的Kir6.2 RNA序列部分有更高親和力的任何探針，所述部分含有至少一個(gè)引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23和/或位置337的至少一個(gè)上述氨基酸改變的核苷酸改變。
氨基酸改變的存在還可通過(guò)分析個(gè)體的蛋白質(zhì)組(即個(gè)體中表達(dá)的蛋白質(zhì))確定。合適的技術(shù)為本領(lǐng)域公知并包括例如蛋白質(zhì)組學(xué)芯片分析、來(lái)自蛋白質(zhì)、細(xì)胞或組織樣品的免疫組織學(xué)或免疫化學(xué)技術(shù)或Western印跡分析。作為參考例如參考下文所列文獻(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.從個(gè)體制備含有蛋白質(zhì)的生物樣品。
b.從根據(jù)a)的樣品中分離蛋白質(zhì)。
c.將其固定在載體上。
d.使用能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比與其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結(jié)合的抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)(在不允許與野生型蛋白質(zhì)結(jié)合或以更小親和力結(jié)合的條件下)；e.使抗體對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合成像(例如通過(guò)標(biāo)記的第一抗體或標(biāo)記的第二抗體等)。
蛋白質(zhì)可例如直接固定在芯片基質(zhì)上或合適的膜上或其他類型載體如ELISA板上。還可將蛋白質(zhì)置于凝膠上并在進(jìn)行凝膠電泳后轉(zhuǎn)移并固定在載體(如合適的膜)上(Western印跡)。
根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)包括或由下列步驟組成的方法確定氨基酸改變的存在a.從個(gè)體制備組織學(xué)樣品。
b.使用能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或在位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比與其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結(jié)合的抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)(在不允許與野生型Kir6.2蛋白質(zhì)結(jié)合或以更小親和力結(jié)合的條件下)；c.使得抗體對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合成像(例如通過(guò)標(biāo)記的第一抗體或標(biāo)記的第二抗體)。
突變的存在或不存在可通過(guò)分析標(biāo)記的組織學(xué)樣品并將信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)照樣品(例如來(lái)自用假的第一抗體或抗血清(即第一抗體或抗血清不與含有突變的Kir6.2反應(yīng)，或與含有突變的Kir6.2以與特異的第一抗體或抗血清相比小得多的程度反應(yīng))或特意于野生型Kir6.2蛋白質(zhì)的第一抗體處理的相同患者的樣品和/或已知僅含有野生型Kir6.2蛋白質(zhì)的對(duì)照樣品)的比較來(lái)確定。
檢測(cè)結(jié)合優(yōu)選通過(guò)免疫組織化學(xué)或免疫放射測(cè)定方法進(jìn)行。
根據(jù)上述方法優(yōu)選的實(shí)施方案，位置23的氨基酸改變?yōu)閺墓劝彼?野生型)到賴氨酸；也優(yōu)選位置337的氨基酸改變?yōu)閺睦i氨酸(野生型)到異亮氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的不同方面，冠心病優(yōu)選冠狀動(dòng)脈疾病，并還更優(yōu)選其為心絞痛。
根據(jù)本發(fā)明不同方面的另一優(yōu)選的實(shí)施方案，在樣品中確定Kir6.2-23-KK(在Kir6.2基因兩個(gè)等位基因上作為核苷酸多態(tài)性結(jié)果蛋白質(zhì)的位置23中具有賴氨酸(K)的Kir6.2變體)和/或Kir6.2-337-II(在Kir6.2基因兩個(gè)等位基因上作為核苷酸多態(tài)性結(jié)果蛋白質(zhì)的位置337中具有異亮氨酸(I)的Kir6.2變體)的存在。
樣品可以是含有包括相應(yīng)多態(tài)性的Kir6.2的任何樣品。以允許容易檢測(cè)相應(yīng)多態(tài)性的方式制備樣品是有利的。適當(dāng)?shù)膶?shí)例取決于應(yīng)用的檢測(cè)方法并且是例如組織學(xué)樣品、細(xì)胞提取物或組織提取物或細(xì)胞，優(yōu)選分離自人體。適當(dāng)?shù)挠糜阼b定各多態(tài)性的技術(shù)例如PCR、以核酸或蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的陣列技術(shù)、使用適當(dāng)抗體的免疫組織學(xué)或免疫化學(xué)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。這同樣適用于合適的引物集合和抗體或抗血清的選擇和制備。這類技術(shù)參考例如下列文獻(xiàn)。
本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)Kir6.2蛋白質(zhì)、Kir6.2-23-KK或Kir6.2-337-II中位置23非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337非纈氨酸的其他氨基酸的存在的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種用于在蛋白質(zhì)中檢測(cè)所述存在的工具。在本發(fā)明上下文中，試劑盒部件(簡(jiǎn)稱試劑盒)應(yīng)理解為本申請(qǐng)中鑒定的組分的任何組合，其空間地共存組合為功能單元，其中所述試劑盒可包含其他組分。
所述工具可以是例如對(duì)位置23含谷氨酸和/或位置337含纈氨酸的Kir6.2與位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2之間的結(jié)合特征有區(qū)別的抗體。特異抗體的制備為本領(lǐng)域公知。作為參考例如參考下文所列文獻(xiàn)。另外，優(yōu)選試劑盒含有標(biāo)記的第二抗體。試劑盒還可含有合適的試劑、緩沖液等用于進(jìn)行結(jié)合和/或標(biāo)記反應(yīng)等。如果包括使用說(shuō)明(例如公開(kāi)優(yōu)選的反應(yīng)條件、緩沖液組分等的手冊(cè)或紙張)也是合適的。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，所述工具為對(duì)野生型Kir6.2和位置23和/或337所含氨基酸改變的Kir6.2之間結(jié)合性質(zhì)有區(qū)別的抗體(即單克隆抗體、多克隆抗血清或重組抗體)。這類抗體可以例如與位置23和/或337為野生型的Kir6.2蛋白質(zhì)以更高親和力結(jié)合，或與位置23和/或337的一個(gè)或多個(gè)較不常見(jiàn)變體以更高親和力結(jié)合。檢測(cè)試劑盒中包含一組抗體也是有利的，其中各抗體能夠特異地檢測(cè)一種多態(tài)性；實(shí)踐中也包括僅識(shí)別野生型蛋白質(zhì)的對(duì)照抗體(還可能是用于確定背景信號(hào)的假抗體或抗血清)，也可包含用于進(jìn)行所選檢測(cè)技術(shù)(例如蛋白質(zhì)印跡、陣列技術(shù)或其他免疫或免疫組織化學(xué)技術(shù))有用的或必須的其他試劑。合適抗體的使用或制備和用于組裝檢測(cè)試劑盒的有用或必須試劑為本領(lǐng)域公知。另外具有期望的結(jié)合特性的抗體的制備由不同的供貨商如BioTrend，Cologne，Germany商業(yè)進(jìn)行。
本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)Kir6.2核苷酸序列中一個(gè)或兩個(gè)Kir6.2基因的等位基因上存在改變的檢測(cè)試劑盒，所述改變產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列，其中所述試劑盒包括用于檢測(cè)核苷酸序列中所述變異的至少一種工具。
其他工具為例如合適的測(cè)序引物，或僅用于特異擴(kuò)增野生型Kir6.2的DNA或RNA的引物集合，和/或僅用于擴(kuò)增含有位置23和/或337突變的Kir6.2的DNA或RNA的引物集合。選擇和使用合適引物，能夠用于特異性測(cè)序或擴(kuò)增某些序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力(參閱例如根據(jù)實(shí)施例2的引物和條件)。檢測(cè)試劑盒中也可包括用于進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)或擴(kuò)增的有用和必須試劑，如聚合酶、緩沖液、核苷酸等(參閱例如根據(jù)實(shí)施例2的引物和條件)。如果試劑盒包含組裝的對(duì)不同Kir6.2多態(tài)性特異的不同測(cè)序引物和PCR引物集合從而可以確定Kir6.2中不同類型多態(tài)性的存在，是非常有利的。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，所述工具為識(shí)別野生型Kir6.2和/或在位置23和/或337含有突變的Kir6.2的核酸探針。用于進(jìn)行所選檢測(cè)技術(shù)的有用探針的使用和選擇(例如所有種類的核酸印跡、陣列技術(shù)或其他種類的芯片技術(shù))也在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍之內(nèi)。也可包括在檢測(cè)試劑盒中的合適試劑的選擇也是如此。優(yōu)選地，一組識(shí)別不同多態(tài)性的不同探針也包括在測(cè)試試劑盒中。
位置23的氨基酸優(yōu)選為賴氨酸而位置337的氨基酸優(yōu)選為異亮氨酸。
優(yōu)選Kir6.2的核苷酸序列在編碼序列的位置67帶有G。還優(yōu)選Kir6.2的核苷酸序列在編碼序列的位置1009帶有A。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，檢測(cè)試劑盒含有能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物集合，所述片段含有Kir6.2編碼序列的位置67和/或1009。優(yōu)選的引物為例如根據(jù)SEQ ID No.9到12的引物。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，檢測(cè)試劑盒含有能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的至少一種引物集合，所述片段包含根據(jù)SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列的位置5657106/7/8和/或5657978/79/80。優(yōu)選的引物為例如根據(jù)SEQ IDNo.9到12的引物。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，檢測(cè)試劑盒包含在嚴(yán)格條件下特異性識(shí)別Kir6.2基因組DNA或RNA的一種或多種核酸探針，所述基因組DNA或RNA帶有編碼位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一方面涉及帶有多肽序列位置23的賴氨酸和位置337的異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及分離的根據(jù)SEQ ID No.7的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和/或337的氨基酸。
本發(fā)明的另一方面還涉及分離的多核苷酸，其編碼上述K23/I337-Kir6.2多肽或其包含位置23和337的片段之一。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及分離的根據(jù)SEQ ID No.8的Kir6.2多核苷酸或其片段，或分離的與上述DNA序列或它們的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)格度條件下雜交的多核苷酸，所述片段包括核苷酸位置67和1009(還優(yōu)選包括位置68、69、1010和1011)。
本發(fā)明的另一方面涉及含有多肽序列位置23的谷氨酸和位置337的異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及分離的根據(jù)SEQ ID No.5的Kir6.2多肽或其包括氨基酸位置23和/或337的片段。
本發(fā)明的另一方面還涉及分離的多核苷酸，其編碼上述E23/I337Kir6.2多肽或其包括位置23和337的片段之一。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案涉及分離的根據(jù)SEQ ID No.6的Kir6.2多核苷酸或其片段，或分離的與上述DNA序列或它們的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)格度條件下雜交的多核苷酸，所述片段包括核苷酸位置67和1009(還優(yōu)選包括位置68、69、1010和1011)。
本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測(cè)Kir6.2基因或RNA內(nèi)核苷酸變異的探針，所述探針包含或由Kir6.2序列的至少17個(gè)，優(yōu)選19到100個(gè)連續(xù)核苷酸組成，所述連續(xù)核苷酸跨越Kir6.2編碼序列位置67和/或1009或跨越基因組Kir6.2序列位置5657106/07/08和/或5657978/79/80。
本發(fā)明的另一方面涉及用于擴(kuò)增Kir6.2多核苷酸的引物或引物集合，其中擴(kuò)增的多核苷酸至少包含編碼Kir6.2序列的位置67和/或1009和/或基因組Kir6.2序列的位置5657106/07/08和/或5657978/79/80。
在下文中，通過(guò)若干實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例并非旨在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例在患有I和II型糖尿病的患者群(主要為II型，即糖尿病)中分析Kir6.2蛋白質(zhì)位置23和位置337的Kir6.2多態(tài)性(野生型蛋白質(zhì)序列NCBI登錄號(hào)D 50582(SEQ.ID No1；圖1A)；編碼序列的NCBI登錄號(hào)D 05852(SEQ.ID No.2；圖1B))。
實(shí)施例1研究受試者(研究人群)篩選335位患者基因組DNA在產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體Kir6.2-E23K和Kir6.2-V337I的Kir6.2基因中的SNP(單核苷酸多態(tài)性)。納入標(biāo)準(zhǔn)為德國(guó)祖先的高加索人個(gè)體，穩(wěn)定的臨床狀況和冠狀動(dòng)脈造影照片。排除標(biāo)準(zhǔn)為除ACS外的急性病、慢性非心臟性疾病(即風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和過(guò)去五年間有惡性病史。該患者群的基本特征在表2中概述。所有的患者簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。
實(shí)施例2通過(guò)測(cè)序和分析檢測(cè)SNP2.1擴(kuò)增具有目的多態(tài)性的基因組區(qū)域擴(kuò)增引物A用于檢測(cè)登錄號(hào)NT 009307的Kir6.2基因序列位置5657978/79/80上的核苷酸改變。
正向引物M675’-AGGTGGAGGTAAGGAAGAG-3’(SEQ ID.No.9)反向引物M675’-GGTGAAGATGAGCAATGTG-3’(SEQ ID.No.10)B用于檢測(cè)登錄號(hào)NT 009307的Kir6.2基因序列位置5657106/07/08上的核苷酸改變。
正向引物M10095’-GGGTGGCAACAGCATCTTC-3’(SEQ ID.No.11)反向引物M10095’-TGGCTCAGGACAGGGAATC-3’(SEQ ID.No.12)引物也可用于擴(kuò)增Kir6.2編碼序列。
用于擴(kuò)增的PCR方案所有的試劑均來(lái)自Applied Biosystems(Foster City，USA)20ng基因組DNA、1單位TaqGold聚合酶、1×Taq聚合酶緩沖液、500μM dNTP、2.5mM MgCl2、200nM各種擴(kuò)增引物對(duì)(序列參閱上文的擴(kuò)增引物對(duì)1.A和1.B)、加H2O至5μl。
用于PCR/基因型分型的擴(kuò)增程序95℃×10分鐘×1循環(huán)95℃×30秒70℃×30秒×2循環(huán)；95℃×30秒65℃×30秒×2循環(huán)；95℃×30秒60℃×30秒×2循環(huán)；95℃×30秒56℃×30秒72℃×30秒×40循環(huán)；72℃×10分鐘4℃×30秒×1循環(huán)；2.2鑒定目的多態(tài)性多態(tài)性的微測(cè)序和檢測(cè)方案所有的試劑來(lái)自Applied Biosystems(Foster City，USA)。2μl純化的PCR產(chǎn)物、1.5μl BigDye終止子試劑盒、200nM一種測(cè)序引物(序列參閱上文的正向或反向擴(kuò)增引物1.A和1.B)、加H2O至10μl。
用于測(cè)序的擴(kuò)增程序96℃×2分鐘×1循環(huán)；96℃×10秒55℃×10秒65℃×4分鐘×30循環(huán)；72℃×7分鐘4℃×30秒×1循環(huán)；分析測(cè)序產(chǎn)物
首先用測(cè)序分析軟件(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，USA)進(jìn)行原始數(shù)據(jù)提取并用Phred(堿基調(diào)用)、Phrap(匯編)、Polyphred(SNP調(diào)用)和Consed(結(jié)果評(píng)價(jià))進(jìn)行加工來(lái)分析序列。Phred、Phrap、Polyphred和Consed是在WashU由Phil Green設(shè)計(jì)的軟件(http://www.genome.washington.edu)。
PCR反應(yīng)導(dǎo)致鑒定編碼序列位置67從G到A的改變和位置1009從A到G的改變。
2.3Kir6.2蛋白質(zhì)中氨基酸改變與冠心病的關(guān)聯(lián)為了分析Kir6.2多態(tài)性對(duì)患有心血管疾病和代謝性疾病患者臨床結(jié)果的影響，發(fā)明者在335個(gè)患有I型或II型糖尿病個(gè)體的患者群內(nèi)進(jìn)行了Kir6.2多態(tài)性E23K、L270V和I337V的相關(guān)分析。在350個(gè)臨床參數(shù)中，心絞痛與Kir6.2蛋白質(zhì)位置23賴氨酸(K)和/或位置337纈氨酸(V)純合的患者顯著相關(guān)。
Kir6.2-23-EE(位置23為野生型)定義了這樣的個(gè)體群，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23谷氨酸(Glu或E)的Kir6.2基因變體，該組對(duì)Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的該Kir6.2多態(tài)性是純合的。
Kir6.2-23-EK定義了這樣的個(gè)體群，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因之一編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23谷氨酸(Glu或E)的Kir6.2基因變體，而另一Kir6.2等位基因編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23賴氨酸(Lys或K)的Kir6.2基因變體，該組對(duì)Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的Kir6.2多態(tài)性是雜合的。
Kir6.2-23-KK定義了這樣的個(gè)體群，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23賴氨酸(Lys或K)的Kir6.2基因變體，該組對(duì)Kir6.2蛋白質(zhì)位置23的該Kir6.2多態(tài)性是純合的。Kir6.2-23-KK還定義了患者這樣的生物樣品，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置23賴氨酸(賴氨酸或K)的Kir6.2基因變體。
Kir6.2-337-II定義了這樣的個(gè)體群，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置337異亮氨酸(Ile或I)的Kir6.2基因變體，該組對(duì)Kir6.2蛋白質(zhì)位置337的該Kir6.2多態(tài)性是純合的。Kir6.2-337-II還定義了患者這樣的生物樣品，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置337異亮氨酸(異亮氨酸或I)的Kir6.2基因變體。
Kir6.2-337-IV定義了這樣的個(gè)體群，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因之一編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置337異亮氨酸(Ile或I)的Kir6.2基因變體，而另一Kir6.2等位基因編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置337纈氨酸(Val或V)的Kir6.2基因變體，該組對(duì)Kir6.2蛋白質(zhì)位置337的Kir6.2多態(tài)性是雜合的。
Kir6.2-337-VV(位置337為野生型)定義了這樣的個(gè)體群，其中兩個(gè)Kir6.2等位基因均編碼引起Kir6.2蛋白質(zhì)位置337纈氨酸(Val或V)的Kir6.2基因變體，該組對(duì)Kir6.2蛋白質(zhì)位置337的該Kir6.2多態(tài)性是純合的。
基因型/表型關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)學(xué)途徑所有的分析都用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包(6.12版，SAS Institute GmbH，Heidelberg/Germany)完成。為了檢測(cè)遺傳多態(tài)性和大量臨床相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，計(jì)算描述統(tǒng)計(jì)學(xué)(中位數(shù)，四分位數(shù))并進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)用于比較兩個(gè)獨(dú)立的樣本。測(cè)試統(tǒng)計(jì)值的計(jì)算基于匯合樣本的等級(jí)。以類似方式搜索SNP和風(fēng)險(xiǎn)因子以及疾病之間的關(guān)聯(lián)。進(jìn)行卡方檢驗(yàn)并計(jì)算數(shù)字和百分比以描述數(shù)據(jù)?？ǚ綑z驗(yàn)為計(jì)算兩個(gè)變量依賴性的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。變量值包含于兩個(gè)或更多組中。為了分析那些變量的關(guān)聯(lián)，使用列聯(lián)表。該列聯(lián)表包含與第一變量的實(shí)現(xiàn)值數(shù)量一樣多的行和與第二變量的實(shí)現(xiàn)值數(shù)量一樣多的列。每個(gè)單元含有特定的患者特征。為了構(gòu)建檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值，計(jì)算出計(jì)算頻率和觀察頻率的差異。檢查結(jié)果后選擇相關(guān)的變量?？紤]到混雜的共變量，使用邏輯斯特回歸(logistic regression)驗(yàn)證結(jié)果。使用邏輯斯特回歸方法分析若干說(shuō)明變量對(duì)某一應(yīng)答變量的影響。關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)給出p值。該p值解釋為對(duì)關(guān)聯(lián)的說(shuō)明變量有顯著影響。
對(duì)于二元變量，計(jì)算比值比。比值比是事件在一個(gè)集合中發(fā)生的比值與事件在另一集合中發(fā)生的比值的比。
實(shí)施例3分析表2中顯示了Kir6.2變體E23K和V337I在335個(gè)個(gè)體中的分布。如表3到8中所列的，可以看到Kir6.2-23-KK與Kir6.2-337-II、Kir6.2-23-EK與Kir6.2-337-VI以及Kir6.2-23-EE與Kir6.2-337-VV之間的強(qiáng)連鎖。因此，對(duì)例如Kir6.2-23-KK獲得的所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)與Kir6.2-337-II的那些類似。
帶有Kir6.2-23-KK和Kir6.2-337-II的糖尿病患者顯示與心絞痛的提高關(guān)聯(lián)。使用卡方檢驗(yàn)對(duì)糖尿病患者中Kir6.2-23-KK基因型與心絞痛關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性計(jì)算為p值＝0.015，而糖尿病患者中Kir6.2-337-II基因型與心絞痛關(guān)聯(lián)為p值＝0.012(圖2A和圖3A)。
用于分析致混雜因素(例如心肌梗塞和高血壓)影響的邏輯斯特回歸，產(chǎn)生糖尿病患者中Kir6.2-23-KK基因型與心絞痛關(guān)聯(lián)的p值＝0.0088，而糖尿病患者中Kir6.2-337-II基因型與心絞痛關(guān)聯(lián)的p值＝0.0072(圖2B和圖3B)。
糖尿病患者中提高的心絞痛風(fēng)險(xiǎn)的比值比為Kir6.2-23-KK基因型1.061而Kir6.2-337-II基因型1.615(圖2C和圖3C)。
本文顯示的數(shù)據(jù)說(shuō)明Kir 6.2基因中由位置23從谷氨酸到賴氨酸的改變引起的突變(特別是Kir6.2-23-KK)和Kir6.2基因中引起位置337從纈氨酸到異亮氨酸的氨基酸改變的突變(特別是Kir6.2-337-II)，代表了糖尿病患者中心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物。由于心絞痛是冠心病的征兆，可以預(yù)期這些標(biāo)記物通常是冠心病的指征。另外，可以預(yù)期Kir6.2基因中引起Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23氨基酸改變的其他突變(特別是將酸性谷氨酰酸改變?yōu)榉菢O性的或優(yōu)選堿性氨基酸的突變)具有相同或者類似的效應(yīng)?？蓪?duì)位置337的氨基酸改變做相同預(yù)期，所述改變將纈氨酸改變?yōu)槠渌模貏e是酸性或堿性的或更大的脂肪族氨基酸。很可能這些氨基酸改變還與非糖尿病患者的冠心病(特別是心絞痛)發(fā)病非常密切地相關(guān)。
參考文獻(xiàn)Yamada Y，Kuroe A，Li Q，Someya Y，Kubota A，lhara Y，Tsuura Y1 SeinoY(2001).Genomic variation in pancreatic ion channel genes in Japanesetype 2 diabetic patients.Diabetes Metab Res Rev 17213-216.
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實(shí)驗(yàn)室方法的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)如果沒(méi)有另外說(shuō)明，根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.545頁(yè)；Current Protocols in Molecular Biology；常規(guī)更新的，例如2000卷；Wiley&Sons，Inc；編輯Fred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics；常規(guī)更新的；Wiley&Sons，Inc；編輯Nicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.
Current Protocols in Protein Science；常規(guī)更新的；Wiley&Sons，Inc；編輯John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，PaulT.Wingfield.Molecular Biology of the Cell；第3版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York&London，1994；Short Protocols in Molecular Biology，第5版，F(xiàn)rederick M.Ansubel(編輯)，Roger Brent(編輯)，Robert E.Kingston(編輯)，David D.Moore(編輯)，J.G.Seidman(編輯)，John A.Smith(編輯)，Kevin Struhl(編輯)，October2002，John Wiley&Sons，Inc.，New York＂


圖1在位置23(谷氨酸)和位置337(纈氨酸)包含最常見(jiàn)多肽鏈變體(對(duì)應(yīng)于編碼序列位置67/68/69的密碼子GAG和位置1009/1010/1011的GTC)的Kir6.2(KCNJ 11)的蛋白質(zhì)序列和編碼核苷酸序列。這些變體被稱為Kir6.2-23K-337V(或KK和/或VV，如果兩個(gè)等位基因就位置23和/或337而言是相似的)。該Kir6.2變體的蛋白質(zhì)登錄號(hào)(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))為D50582。多肽序列的位置23和337以及相應(yīng)的核苷酸位置和編碼序列中的ATG標(biāo)有下劃線。
圖2在位置23上含有變體賴氨酸和在位置337為最常見(jiàn)變體纈氨酸(對(duì)應(yīng)于編碼序列的位置67/68/69上密碼子AAG和位置1009/1010/1011上GTC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白質(zhì)序列和編碼核苷酸序列。該Kir6.2變體的蛋白質(zhì)序列登錄號(hào)(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))為XP_006398(圖2A；SEQ ID No.2)。核苷酸序列登錄號(hào)(NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù))為XM_006398(圖2B；SEQ ID No.4)。多肽序列的位置23和337和編碼序列中相應(yīng)的核苷酸位置標(biāo)有下劃線。
圖3在位置23上含有最常見(jiàn)變體谷氨酸和在位置337含有變體異亮氨酸(對(duì)應(yīng)于編碼序列的位置67/68/69上密碼子GAG和位置1009/1010/1011上ATC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白質(zhì)序列和編碼核苷酸序列。蛋白質(zhì)序列除位置337外對(duì)應(yīng)于根據(jù)序列登錄號(hào)D50582的“野生型”Kir6.2，所述位置337帶有異亮氨酸而非纈氨酸。編碼序列除位置1009外對(duì)應(yīng)于根據(jù)序列登錄號(hào)D50582的“野生型”Kir6.2，所述位置1009帶有腺苷而非鳥(niǎo)苷。多肽序列的位置23和337和編碼序列中相應(yīng)的核苷酸位置標(biāo)有下劃線。
圖4在位置23含有變體賴氨酸和在位置337含有變體異亮氨酸(對(duì)應(yīng)于編碼序列位置67/68/69的密碼子AAG和位置1009/1010/1011的ATC)的Kir6.2(KCNJ11)蛋白質(zhì)序列和編碼核苷酸序列。除位置23帶有賴氨酸而非谷氨酸和位置337帶有異亮氨酸而非纈氨酸外，該蛋白質(zhì)序列對(duì)應(yīng)于根據(jù)序列登錄號(hào)D50582的“野生型”Kir6.2的蛋白質(zhì)序列。除位置67帶有腺苷而非鳥(niǎo)苷和位置337帶有腺苷而非鳥(niǎo)苷外，該編碼序列對(duì)應(yīng)于根據(jù)序列登錄號(hào)D50582的“野生型”Kir6.2的編碼序列。多肽序列的位置23和337和編碼序列中相應(yīng)的核苷酸位置標(biāo)有下劃線。
圖5DNA引物M67正向(SEQ ID No.9)和反向(SEQ ID No.10)用于檢測(cè)Kir6.2基因組序列中對(duì)應(yīng)于Kir6.2編碼序列的位置67/68/69的核苷酸改變，而DNA引物M1009正向(SEQ ID No.11)和反向(SEQ ID No.12)用于檢測(cè)Kir6.2基因組序列中對(duì)應(yīng)于根據(jù)序列登錄號(hào)的Kir6.2編碼序列的位置1009/1010/1011的核苷酸改變。就SEQ ID No.25而言，位置分別為5657106/107/108和5657978/79/80。
引物集合也可用于特異性擴(kuò)增根據(jù)NCBI序列登錄號(hào)D50582的Kir6.2 cDNA。引物M67(正向(SEQ ID No.9)和反向(SEQ ID No.10)擴(kuò)增包含Kir6.2 cDNA核苷酸67/68/69的區(qū)域，用于在RNA水平上檢測(cè)Kir6.2基因中的核苷酸改變。引物M1009(正向(SEQ ID No.11)和反向(SEQ IDNo.12)擴(kuò)增包含Kir6.2 cDNA核苷酸1009/1010/1011的區(qū)域，用于在RNA水平上檢測(cè)Kir6.2基因中的核苷酸改變。
圖6一些Kir6.2變體的基因組和編碼序列的相應(yīng)核苷酸位置概況?；蚪M序列內(nèi)位置的編號(hào)來(lái)自NCBI登錄號(hào)NT 009307下人類染色體11基因組連續(xù)序列(包含Kir6.2基因組基因座連續(xù)序列的部分也參閱圖10)。
圖7引起多肽鏈位置23從谷氨酸到賴氨酸和位置337從纈氨酸到異亮氨酸氨基酸改變的Kir6.2核苷酸序列的改變。核苷酸位置是指Kir6.2編碼序列。這些位置與根據(jù)SEQ ID No.25的基因組Kir6.2序列的位置5657106/7/8和5657978/79/80相關(guān)(其中SEQ ID No.25編碼蛋白質(zhì)序列位置337的纈氨酸)。最常見(jiàn)的變體(即野生型)用正常字母寫(xiě)出，核苷酸或氨基酸序列中自該野生型的衍變用粗體字母給出。對(duì)于氨基酸23，單核苷酸改變G67A產(chǎn)生摻入多肽鏈的賴氨酸，而單獨(dú)的改變G69A并不引起氨基酸序列的改變。這一突變類型通常被稱為沉默突變。另一方面，如果上述兩個(gè)核苷酸改變同時(shí)發(fā)生，仍是賴氨酸摻入位置23。至于氨基酸鏈的位置337，單核苷酸改變C1011T、C1011A和C1011G是沉默突變，而單核苷酸改變G1009A使多肽鏈位置337摻入異亮氨酸，即使C1011T或C1011A與G1009A一起共同發(fā)生也是如此。位置67/68/69和/或1009/1010/1011的其他改變是可能的，分別引起其他氨基酸摻入多肽鏈代替位置23的G或K或位置337的V或I(這些遺傳密碼引起的關(guān)聯(lián)通常為本領(lǐng)域技術(shù)水平公知)。
圖8在位置5657106/107/108含有核苷酸GAC(對(duì)應(yīng)于編碼序列位置1009/1010/1011的密碼子GTC并因此編碼多肽鏈位置337含有氨基酸纈氨酸的蛋白質(zhì)變體)和位置5657978/79/80含有核苷酸CTT(對(duì)應(yīng)于編碼序列位置67/68/69的密碼子AAG并因此編碼多肽鏈位置23含有氨基酸賴氨酸的蛋白質(zhì)變體)的Kir6.2(KCNJ11)基因座基因組序列。所示的核苷酸三聯(lián)體打印為粗體并標(biāo)有下劃線。根據(jù)SEQ ID No.9到12的PCR引物的雜交位置也打印為粗體并標(biāo)有下劃線。如此選擇引物序列以允許使用Kir6.2cDNA作為模板擴(kuò)增多核苷酸?？晒_(kāi)獲得的包含該Kir6.2基因組變體的人染色體11基因組連續(xù)序列的序列登錄號(hào)為NT_009307(SEQ ID No.25)。
表格說(shuō)明表1已進(jìn)行所有分析的患者群的基本特征。
表2分析的糖尿病患者群中Kir6.2變體的分布。
表3卡方檢驗(yàn)計(jì)算的糖尿病患者中蛋白質(zhì)位置23的Kir6.2變體與心絞痛的關(guān)聯(lián)。在心絞痛陽(yáng)性組中能夠觀察到Kir6.2-23-KK攜帶者頻率提高。
表4通過(guò)邏輯斯特回歸計(jì)算糖尿病患者中Kir6.2-23-KK與心絞痛關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
表5計(jì)算與Kir6.2-23-EK和Kir6.2-23-EE攜帶者相比，Kir6.2-23-KK攜帶者的糖尿病患者心絞痛風(fēng)險(xiǎn)的比值比。
表6通過(guò)卡方檢驗(yàn)計(jì)算糖尿病患者中Kir6.2在蛋白質(zhì)位置337的變體與心絞痛的關(guān)聯(lián)。心絞痛陽(yáng)性組中能夠觀察到Kir6.2-337-II攜帶者頻率提高。
表7通過(guò)邏輯斯特回歸計(jì)算糖尿病患者中Kir6.2-337-II與心絞痛關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
表8計(jì)算與Kir6.2-337-VI和Kir6.2-337-VV攜帶者相比，Kir6.2-337-II攜帶者的糖尿病患者心絞痛風(fēng)險(xiǎn)的比值比。
表1

*中位數(shù)和四分位數(shù)(Q1-Q3)
表2

表3

表4

表5

表6

表7

表8

序列表<110>塞諾菲-安萬(wàn)特德國(guó)有限公司<120>蛋白質(zhì)多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)<130>DEAV2004/0064<140>04021528.7<141>2004-09-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>390<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160
Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Val Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile370 375 380Ser Pro Asp Ser Leu Ser385 390<210>2<211>1173<212>DNA<213>智人
<400>2atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccgagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>3<211>390<212>PRT<213>智人<400>3Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Lys Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125
Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Val Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365Arg Lys Arg Ser Val Pro Met Ala Lys Ala Lys Pro Lys Phe Ser Ile370 375 380Ser Pro Asp Ser Leu Ser385 390
<210>4<211>1173<212>DNA<213>智人<400>4atgctgtccc gcaagggcat catccccgag gaatacgtgc tgacacgcct ggcagaggac 60cctgccaagc ccaggtaccg tgcccgccag cggagggccc gctttgtgtc caagaaaggc 120aactgcaacg tggcccacaa gaacatccgg gagcagggcc gcttcctgca ggacgtgttc 180accacgctgg tggacctcaa gtggccacac acattgctca tcttcaccat gtccttcctg 240tgcagctggc tgctcttcgc catggcctgg tggctcatcg ccttcgccca cggtgacctg 300gcccccagcg agggcactgc tgagccctgt gtcaccagca tccactcctt ctcgtctgcc 360ttccttttct ccattgaggt ccaagtgact attggctttg gggggcgcat ggtgactgag 420gagtgcccac tggccatcct gatcctcatc gtgcagaaca tcgtggggct catgatcaac 480gccatcatgc ttggctgcat cttcatgaag actgcccaag cccaccgcag ggctgagacc 540ctcatcttca gcaagcatgc ggtgatcgcc ctgcgccacg gccgcctctg cttcatgcta 600cgtgtgggtg acctccgcaa gagcatgatc atcagcgcca ccatccacat gcaggtggta 660cgcaagacca ccagccccga gggcgaggtg gtgcccctcc accaggtgga catccccatg 720gagaacggcg tgggtggcaa cagcatcttc ctggtggccc cgctgatcat ctaccatgtc 780attgatgcca acagcccact ctacgacctg gcacccagcg acctgcacca ccaccaggac 840ctcgagatca tcgtcatcct ggaaggcgtg gtggaaacca cgggcatcac cacccaggcc 900cgcacctcct acctggccga tgagatcctg tggggccagc gctttgtgcc cattgtagct 960gaggaggacg gacgttactc tgtggactac tccaagtttg gcaacaccgt caaagtgccc 1020acaccactct gcacggcccg ccagcttgat gaggaccaca gcctactgga agctctgacc 1080ctcgcctcag cccgcgggcc cctgcgcaag cgcagcgtgc ccatggccaa ggccaagccc 1140aagttcagca tctctccaga ttccctgtcc tga 1173<210>5<211>390<212>PRT<213>智人<400>5Met Leu Ser Arg Lys Gly Ile Ile Pro Glu Glu Tyr Val Leu Thr Arg1 5 10 15Leu Ala Glu Asp Pro Ala Glu Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95
His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ser Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285Gly Val Val Glu Thr Thr Gly Ile Thr Thr Gln Ala Arg Thr Ser Tyr290 295 300Leu Ala Asp Glu Ile Leu Trp Gly Gln Arg Phe Val Pro Ile Val Ala305 310 315 320Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Asp Tyr Ser Lys Phe Gly Asn Thr325 330 335Ile Lys Val Pro Thr Pro Leu Cys Thr Ala Arg Gln Leu Asp Glu Asp340 345 350His Ser Leu Leu Glu Ala Leu Thr Leu Ala Ser Ala Arg Gly Pro Leu355 360 365
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Leu Ala Glu Asp Pro Ala Lys Pro Arg Tyr Arg Ala Arg Gln Arg Arg20 25 30Ala Arg Phe Val Ser Lys Lys Gly Asn Cys Asn Val Ala His Lys Asn35 40 45Ile Arg Glu Gln Gly Arg Phe Leu Gln Asp Val Phe Thr Thr Leu Val50 55 60Asp Leu Lys Trp Pro His Thr Leu Leu Ile Phe Thr Met Ser Phe Leu65 70 75 80Cys Ser Trp Leu Leu Phe Ala Met Ala Trp Trp Leu Ile Ala Phe Ala85 90 95His Gly Asp Leu Ala Pro Ser Glu Gly Thr Ala Glu Pro Cys Val Thr100 105 110Ser Ile His Ser Phe Ser Ser Ala Phe Leu Phe Ser Ile Glu Val Gln115 120 125Val Thr Ile Gly Phe Gly Gly Arg Met Val Thr Glu Glu Cys Pro Leu130 135 140Ala Ile Leu Ile Leu Ile Val Gln Asn Ile Val Gly Leu Met Ile Asn145 150 155 160Ala Ile Met Leu Gly Cys Ile Phe Met Lys Thr Ala Gln Ala His Arg165 170 175Arg Ala Glu Thr Leu Ile Phe Ser Lys His Ala Val Ile Ala Leu Arg180 185 190His Gly Arg Leu Cys Phe Met Leu Arg Val Gly Asp Leu Arg Lys Ser195 200 205Met Ile Ile Ser Ala Thr Ile His Met Gln Val Val Arg Lys Thr Thr210 215 220Ser Pro Glu Gly Glu Val Val Pro Leu His Gln Val Asp Ile Pro Met225 230 235 240Glu Asn Gly Val Gly Gly Asn Ser Ile Phe Leu Val Ala Pro Leu Ile245 250 255Ile Tyr His Val Ile Asp Ala Asn Ser Pro Leu Tyr Asp Leu Ala Pro260 265 270Ser Asp Leu His His His Gln Asp Leu Glu Ile Ile Val Ile Leu Glu275 280 285
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tgcaccggag cgcagggggc ggggccggag caagcccccg cccctcccgc gcccctcccc 3060gcccccgccc tccacctccc ctcccgggac tcacaacccg gc310權(quán)利要求
1.鑒定個(gè)體中提高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中確定樣品中Kir6.2蛋白質(zhì)位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸的存在。
2.鑒定個(gè)體中提高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中確定樣品中Kir6.2基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因Kir6.2核苷酸序列上變異的存在，所述變異產(chǎn)生的Kir6.2多肽序列含有Kir6.2蛋白質(zhì)位置23上非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸。
3.調(diào)適治療和/或預(yù)防冠心病的藥物劑量的方法，其中確定個(gè)體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因上核苷酸序列的變異，所述變異產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
4.選擇應(yīng)答冠心病藥物的個(gè)體的方法，其中確定個(gè)體樣品中Kir6.2的存在，所述Kir6.2含有a)Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，b)Kir6.2基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因上核苷酸序列的變異，所述變異產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸，或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
5.Kir6.2蛋白質(zhì)或核酸在鑒定適用于治療和/或預(yù)防冠心病的藥物中的用途。
6.篩選適用于治療和/或預(yù)防冠心病的藥物的方法，包括a.提供含有Kir6.2的兩個(gè)樣品；b.將一個(gè)樣品與潛在的藥物接觸；c.確定存在或不存在潛在藥物時(shí)的Kir6.2活性或結(jié)構(gòu)；d.比較存在和不存在潛在藥物時(shí)的Kir6.2活性或結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的用途或根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其使用a)Kir6.2蛋白質(zhì)，其在Kir6.2蛋白質(zhì)中含有位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸；b)Kir6.2核酸，其在Kir6.2基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因核苷酸序列中含有變異，所述變異產(chǎn)生Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23的非谷氨酸氨基酸和/或位置337的非纈氨酸氨基酸；或c)Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II。
8.根據(jù)權(quán)利要求5到8中任一項(xiàng)的方法或用途，其中Kir6.2為分離的Kir6.2蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或分離的Kir6.2核酸或核酸片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法或用途，其中所述蛋白質(zhì)包含或具有根據(jù)SEQ ID No.3、5或7的序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法或用途，其中所述蛋白質(zhì)片段包含或具有對(duì)應(yīng)于部分SEQ ID No.3、5或7的序列，所述部分包含氨基酸位置23和/或337。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法或用途，其中核酸包含或具有根據(jù)SEQ IDNo.4、6或8的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法或用途，其中核酸片段包含或具有對(duì)應(yīng)于部分SEQ ID No.4、6或8的序列，如果所述片段來(lái)自Kir6.2 cDNA，則所述部分包含位置67和/或1009，如果所述片段來(lái)自Kir6.2基因組DNA，則所述部分包含位置5657978和/或5657106。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法或用途，其中蛋白質(zhì)位置23的氨基酸為賴氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法或用途，其中蛋白質(zhì)位置337的氨基酸為異亮氨酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求2到14中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述核苷酸序列在Kir6.2編碼序列位置67帶有A。
16.根據(jù)權(quán)利要求2到15中任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述核苷酸序列在Kir6.2編碼序列位置1009帶有G。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法或用途，其中個(gè)體為糖尿病患者。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法或用途，其中糖尿病為糖尿病diabetesmullitus。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法或用途，其中冠心病為心絞痛。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求1到4或13到19中任一項(xiàng)的方法，其中確定樣品中Kir6.2-23-KK和/或Kir6.2-337-II的存在。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的方法，其中樣品為組織學(xué)樣品、細(xì)胞提取物或組織提取物或細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到4或6到21中任一項(xiàng)的方法，其中樣品從人體中分離。
23.根據(jù)權(quán)利要求1到4或13到22中任一項(xiàng)的方法，其中如下確定氨基酸改變的存在a.制備含有基因組DNA的生物樣品；b.優(yōu)選地從根據(jù)a)的樣品中分離染色體DNA；c.使用能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含基因組Kir6.2序列中對(duì)應(yīng)于編碼序列位置67/68/69和/或1009/1010/1011的核苷酸位置；d.測(cè)序根據(jù)c)的多核苷酸片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中使用至少一種或優(yōu)選兩個(gè)根據(jù)SEQID No.9到12的引物進(jìn)行多核苷酸片段的擴(kuò)增。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其中使用根據(jù)SEQ ID No.9到12的引物之一進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1到4或13到22中任一項(xiàng)的方法，其中如下確定氨基酸改變的存在a.制備含有基因組DNA的生物樣品；b.從根據(jù)a)的樣品中分離基因組DNA；c.將其固定在載體上；d.用一個(gè)或多個(gè)探針在嚴(yán)格條件下與固定的DNA雜交，所述探針能夠與含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸改變的Kir6.2序列以與野生型Kir6.2序列相比更高的親和力雜交，所述核苷酸改變引起一個(gè)或兩個(gè)所述氨基酸改變。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中分離的基因組DNA被a.固定在芯片基質(zhì)、合適的膜上或b.轉(zhuǎn)移至凝膠基質(zhì)上并印跡在合適的膜上。
28.根據(jù)權(quán)利要求1到4或13到22中任一項(xiàng)的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來(lái)自個(gè)體的含有RNA的生物樣品；b.優(yōu)選地，從根據(jù)a)的樣品中分離RNA；c.使用能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物通過(guò)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增多核苷酸片段，所述多核苷酸片段包含Kir6.2 cDNA序列的位置67和/或1009；d.測(cè)序根據(jù)c)的多核苷酸片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中使用至少一種根據(jù)SEQ ID No.9到12的引物。
30.根據(jù)權(quán)利要求1到4或13到22中任一項(xiàng)的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來(lái)自個(gè)體的含有RNA的生物樣品；b.從根據(jù)a)的樣品中分離RNA；c.將其固定在載體上；d.用一個(gè)或多個(gè)探針與固定的RNA雜交，所述探針在嚴(yán)格條件下能夠與編碼在位置23并非谷氨酸和/或在位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA以與編碼在位置23含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2多肽的Kir6.2 RNA相比更高的親和力雜交。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中分離的RNA被a.固定在芯片基質(zhì)或合適的膜上，或b.轉(zhuǎn)移至凝膠基質(zhì)上并隨后印跡在合適的膜上。
32.根據(jù)權(quán)利要求1到4或13到22中任一項(xiàng)的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來(lái)自個(gè)體的含有蛋白質(zhì)的生物樣品；b.從根據(jù)a)的樣品中分離蛋白質(zhì)；c.將其固定在載體上；d.使用抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，所述抗體能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結(jié)合；e.使抗體對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合成像。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中分離的蛋白質(zhì)被a.固定在芯片基質(zhì)或合適的膜上；b.轉(zhuǎn)移至凝膠基質(zhì)上并隨后固定在合適的膜上，或c.固定在ELISA板上。
34.根據(jù)權(quán)利要求1到4或13到22中任一項(xiàng)的方法，其中如下確定氨基酸改變a.提供來(lái)自個(gè)體的組織學(xué)樣品；b.使用抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，所述抗體能夠與其多肽鏈上位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2以比其多肽鏈上位置337含谷氨酸和/或在位置337含纈氨酸的Kir6.2更高的親和力結(jié)合；c.使抗體對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合成像。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中通過(guò)免疫組織化學(xué)或免疫放射反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)。
36.檢測(cè)試劑盒，其用于檢測(cè)Kir6.2蛋白質(zhì)、Kir6.2-23-KK、Kir6.2-337-II中位置23非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337非纈氨酸的其他氨基酸的存在，其中所述試劑盒包括至少一種用于檢測(cè)蛋白質(zhì)中所述存在的工具。
37.檢測(cè)試劑盒，其用于檢測(cè)在一個(gè)或兩個(gè)Kir6.2基因的等位基因上Kir6.2核苷酸序列中變異的存在，所述變異產(chǎn)生含有Kir6.2蛋白質(zhì)中位置23含非谷氨酸的其他氨基酸和/或位置337含非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2多肽序列，其中所述試劑盒包括至少一種用于檢測(cè)核苷酸序列中所述變異的工具。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37之一的檢測(cè)試劑盒，其中位置23的氨基酸為賴氨酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求36到38中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，其中位置337的氨基酸為異亮氨酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求36、38或39中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，其含有對(duì)位置23含谷氨酸和/或位置337含纈氨酸的Kir6.2與位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的Kir6.2之間的結(jié)合特性有區(qū)別的抗體。
41.根據(jù)權(quán)利要求37到39中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，其中Kir6.2核苷酸序列在編碼序列的位置67帶有G。
42.根據(jù)權(quán)利要求37到39或41中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，其中Kir6.2核苷酸序列在編碼序列的位置1009帶有A。
43.根據(jù)權(quán)利要求37到39、41或42中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物集合，所述片段含有Kir6.2編碼序列的位置67和/或1009。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有至少一種根據(jù)SEQ ID No.9到12的引物。
45.根據(jù)權(quán)利要求37到39或41到43中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有能夠擴(kuò)增多核苷酸片段的引物集合，所述片段包含根據(jù)SEQ IDNo.13的Kir6.2基因組序列的位置5657106/107/108和/或5657978/79/80。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的檢測(cè)試劑盒，其中所述試劑盒含有至少一種根據(jù)SEQ ID No.9到12的引物。
47.根據(jù)權(quán)利要求37到39、41或42中任一項(xiàng)的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒含有在嚴(yán)格條件下特異識(shí)別Kir6.2基因組DNA或RNA的一種或多種核酸探針，所述Kir6.2基因組DNA或RNA帶有編碼位置23并非谷氨酸和/或位置337并非纈氨酸的其他氨基酸的核苷酸序列。
48.在多肽序列位置23帶有賴氨酸而在位置337帶有異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和337。
49.包含根據(jù)SEQ ID No.7的序列或由之組成的分離的Kir 6.2多肽或其片段，所述片段包括氨基酸位置23和/或337。
50.在多肽序列位置23帶有谷氨酸而在位置337帶有異亮氨酸的分離的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括位置23和337。
51.包含根據(jù)SEQ ID No.5的序列或由之組成的分離的Kir6.2多肽或其片段，所述片段包括氨基酸位置23和337。
52.分離的多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求51到54中任一項(xiàng)的Kir6.2蛋白質(zhì)或其片段。
53.包括根據(jù)SEQ ID No.6或8的序列的分離的多核苷酸或其片段，所述片段包括核苷酸位置67和1009。
54.分離的多核苷酸，其在高嚴(yán)格條件下與根據(jù)權(quán)利要求54或55的DNA序列或它們的互補(bǔ)鏈雜交。
55.用于檢測(cè)Kir6.2基因或RNA內(nèi)核苷酸變異的探針，所述探針包含Kir6.2序列的至少17個(gè)，優(yōu)選19到100個(gè)連續(xù)核苷酸或由之組成，所述連續(xù)核苷酸屬于包括位置67和/或1009的Kir6.2編碼序列或?qū)儆诎ㄎ恢?657106/107/108和/或5657978/79/80的根據(jù)SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列。
56.用于擴(kuò)增Kir6.2多核苷酸的引物，其中擴(kuò)增的多核苷酸包含Kir6.2編碼序列的位置67和/或1009和/或根據(jù)SEQ ID No.13的基因組Kir6.2序列的位置5657978和/或5657106。
全文摘要
本發(fā)明涉及在個(gè)體中鑒定提高的冠心病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中在樣品中確定Kir6.2蛋白質(zhì)位置23上非谷氨酸的其他氨基酸的存在和/或位置337上非纈氨酸的其他氨基酸的存在。此外，還要求保護(hù)適用于所述方法的探針、引物、多肽或多核苷酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101018873SQ200580030463
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者D·科齊安, H·戈蓋萊因, K-E·西格勒, M·雅各布斯, J-F·德勒茲, S·里卡德, S·馬賽 申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬(wàn)特德國(guó)有限公司