專利名稱：馬流感病毒核蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體，尤其涉及馬流感病毒NP單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發(fā)明還涉及該馬流感病毒NP單克隆抗體在制備檢測或診斷馬流感病毒的試劑中的應用，屬于馬流感病毒的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬、流感(Equine influenza, ΕΙ)是由馬、流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起馬屬動物的急性呼吸性疾病，由于其恢復期長、治療費用昂貴，給養(yǎng)馬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失(REEVE-JOHNSON L. Equine influenza in Australia [J]. Vet Rec，2007， 161:635.)。因此，建立一種快速、有效的檢測EI的方法對其早期預防和控制極為重要。馬流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)具有種群和型特異性，是保守的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒進化中變異率極低，對于易發(fā)生變異的流感病毒的診斷具有重要的應用價值。單克隆抗體在檢測中以其高特異性、準確性和有效性備受人們青睞。故利用針對NP的單克隆抗體建立起來的檢測技術(shù)廣泛應用于流感病毒的診斷，尤其是多亞型和高突變的禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)。deBore等僅利用一株抗NP單抗建立的雙抗體夾心ELISA方法和雙抗體夾心阻斷ELISA可以分別從病原水平和血清水平檢測人、禽和馬等不同動物來源的各亞型流感病毒(SIEBINGA J T and BOER GFD. Influenza A viral nucleoprotein detection in isolates from human and various animal species[J]. Arch Virol, 1988,100 :75-87 ；deBOER G F,BACK W and 0STERHAUS A D M E. An ELISA for detection of antibodies against influenza A nucleoprotein in humans and various animal species [J], Arch Virol，1990，115 :47-61.)。2008 年 Yang M 等運用流感病毒的 NP 單抗發(fā)明了一種快速檢測針對AIV的探針，此單抗與NP結(jié)合后能被免疫熒光法、免疫組化法和免疫噬菌斑法展現(xiàn)出來(YANG Μ, BERHANE Y, SALO Τ, et al. Development and application of monoclonal antibodies against avian influenza virus nucleoprotein[J]. J Virol Methods, 2008，147 :265-274.)。而EI方面，尤其是中國國內(nèi)，基于EIV抗NP單抗建立起的檢測方法鮮有報道。與其它A型流感病毒一樣，EIV極易變異，但是NP作為其重要的結(jié)構(gòu)蛋白，卻相當保守。應用單抗研究發(fā)現(xiàn)，所有不同動物來源的病毒株都有一個共同的抗原表位，針對此表位的單抗具有型特異性，利用該表位的單抗可檢測不同動物來源的流感病毒，正如deBore等建立的雙抗體夾心ELISA和雙抗體夾心競爭ELISA。同時世界動物衛(wèi)生組織(OIE)指出，在無分離病毒的實驗室條件時，可采用EIV NP單抗進行抗原捕捉ELISA 直接檢測鼻腔分泌物中的 EIV(COOK R F, SINCLAIR R and MUMF0RD J A. Detection of influenza nucleoprotein antigen in nasal secretions from horses infected with A/equine influenza(H3N8)viruses[J]. J Virol Methods,1988, 20 1-12. LIVESAY G J, 0' NEILL Τ,HANNANT D，et al. The outbreak of equine influenza(H3N8)in the United Kingdom in 1989 !diagnostic use of an antigen capture ELISA[J]. Vet Rec,1993,133 :515-519.)。因此，一種快速有效的診斷技術(shù)對于EIV的預防控制和流行病學研究極為重要。目前國內(nèi)常用的檢測EI的方法有病毒的分離、血凝血凝抑制試驗、RT-PCR等，但進行大規(guī)模檢測比較困難，應用也局限于專業(yè)實驗室，很難在基層推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種抗馬流感病毒NP單克隆抗體；本發(fā)明目的之二是提供分泌該抗馬流感病毒NP單克隆抗體的雜交瘤細胞株；本發(fā)明目的之三是將上述抗的抗馬流感病毒NP單克隆抗體應用于制備成檢測馬流感病毒抗原或抗體的有關(guān)試劑。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明利用原核表達的馬流感病毒(EIV)核蛋白(NP)為免疫原，經(jīng)腹腔接種4周齡BALB/c小鼠，取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)4次有限稀釋法克隆和間接 ELISA法篩選，獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞株2G11和3E10。其中，雜交瘤細胞株2G11的微生物保藏號是CGMCC NO. 4611 ；其分類命名為雜交瘤細胞株；保藏時間是2011年2月23日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。亞類鑒定結(jié)果顯示，單抗2G11為IgGl亞型，單抗3E10為IgGh亞型，輕鏈均為 κ鏈。經(jīng)間接ELISA檢測，單抗效價分別為上清液分別是1 640、1 640，腹水分別是 1 409600,1 204800。Western-blot分析表明，獲得的2株單抗均能特異性識別EIV NP 重組蛋白；間接免疫熒光試驗證明，2株單抗能夠與天然EIV結(jié)合；ELISA測定，2株單抗與馬動脈炎病毒、馬皰疹病毒1型、馬皰疹病毒4型、馬乙型腦炎病毒均不發(fā)生交叉反應。親和力試驗結(jié)果為2G11和3E10與EIV的親和力常數(shù)分別是4. 39 X IO6M"1和2. 2 X IO6M^10
總之，本發(fā)明兩株單抗均能產(chǎn)生較高的腹水效價，都與EIV有很好的親和力。本發(fā)明為抗EIVNP單抗的制備及后期EIV檢測方法的建立提供了物質(zhì)基礎。


圖1抗EIV NP單克隆抗體Wfestern blot分析；M 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1 :NP重組蛋白；2 :His標簽。圖2本發(fā)明單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定結(jié)果；1 3 接毒的MDCK分別與單抗 2G11、3E10、4A1的間接免疫熒光反應結(jié)果；4 接毒的MDCK與SP2/0的間接免疫熒光反應結(jié)^ ο圖3雜交瘤細胞與不同濃度抗原結(jié)合的ELISA曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例本發(fā)明單克隆抗體的制備及鑒定1.材料與方法1. 1病毒株、細胞及實驗動物EIV A/馬/新疆/07(H3N8)由本發(fā)明人實驗室分離并保存，馬病毒性動脈炎病毒 (EAV)、馬乙型腦炎病毒(JEV)、馬鼻肺炎病毒(EHV-1和EHV-4)購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；NP和骨髓瘤細胞SP2/0由本發(fā)明人實驗室保存；BALB/c小鼠購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。1. 2主要試劑HAT選擇性培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記抗鼠IgG羊抗鼠熒光二抗購自Sigma公司；胎牛血清購自GIBCO公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠二抗為Sigma公司產(chǎn)品；Surper ECL Plus超敏發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；HiTrap Protein G HP購自GE公司。1. 3動物免疫NP經(jīng)鎳柱純化后作為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑乳化，經(jīng)腹腔接種4周齡 BALB/c小鼠，IOOyg/只。以后每間隔2周將免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑乳化進行免疫。共免疫3次。在3免后第7d-10d尾部靜脈采血測抗體效價，當抗體效價達到1 104 以上時，用不加佐劑的抗原100 μ g/只于腹腔加強免疫，3d后取小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。1. 4間接ELISA檢測方法的建立蔗糖密度梯度純化EIV A/馬/新疆/07 (H3N8)，方法見文獻(郭巍，王英原，王宇， 等.H3N8亞型馬流感病毒間接ELISA抗體檢測方法建立及應用[J].中國預防獸醫(yī)學報， 2010,32 :190-193.)。以純化的EIV作為包被抗原，設置矩陣建立間接ELISA檢測方法，通過酶標儀讀取D45tlnm值。取陽性孔D45tlnm接近1. 0，P/N值最大的抗原、抗體稀釋度作為二者的最佳工作濃度。1. 5細胞融合、雜交瘤細胞的篩選及亞型鑒定將免疫鼠的脾細胞與SP2/0用PEG 4000進行融合，用建立的ELISA方法進行篩選。經(jīng)4次亞克隆后，選擇D45tlnm值高且能穩(wěn)定分泌抗體的細胞擴大培養(yǎng)。每次亞克隆前都要及時進行細胞凍存。采用SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類試劑盒進行亞型鑒定。1. 6單抗腹水的制備選取8周齡 10周齡健康雌性BALB/c小鼠0. 5mL/只腹腔注射滅菌液體石蠟油， 7d 14d后接種2 X IO5個/只 IX IO6個/只雜交瘤細胞。約7d IOd后收集腹水。間接ELISA方法測定雜交瘤細胞上清和腹水效價，SP2/0細胞培養(yǎng)上清和SP2/0腹水作為陰性對照，以P/N ^ 2. 1的最高稀釋倍數(shù)為單抗的效價。利用ftOtein G柱子對腹水進行純化。1. 7單抗特性鑒定1.7. 1特異性分析采用^festern blot分析單抗與重組His-ΝΡ和His蛋白的反應活性，間接ELISA 分析單抗與EAV、EHV-I、EHV-4和JEV的反應性。間接免疫熒光分析單抗與EIV的反應性。將MDCK細胞傳至96孔板，待其長至60%時接種TPCK-胰酶處理的EIV。培養(yǎng)60h后用預冷的無水乙醇室溫固定15min 30min。加入雜交瘤上清和SP20上清，37°C感作Ih后，加入羊抗鼠熒光抗體，37°C作用lh，鏡檢。1.7. 2親和力分析利用非競爭性酶聯(lián)免疫法進行(BEATTY J D，BEATTY B G and VLAHOS W G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay [J], J Immunol Methods，1987，100 :173-179.)。將純化的新疆株 EIV 按 10 μ g/ml、5 μ g/ml、2. 5 μ g/ml和1. 25 μ g/ml包被酶標板。將純化的單抗從300 μ g/ml開始稀釋，稀釋因子為1 4。測045(| 。以抗體濃度(μ g/ml)為橫坐標，對應的吸光值為縱坐標，繪制曲線。將S型曲線的頂部設置為Dmax，找出50% Dmax對應的抗體濃度，將曲線兩兩一組，根據(jù)公式Ka= (n-l)/2(n[Ab' ]t_[Ab]t)計算單抗的親和常數(shù)。其中η為每組中兩個包被濃度的倍數(shù)，[Ab' ]t和[Ab]t是每組中兩個50% Dmax對應的抗體濃度(mol/ L)。2.實驗結(jié)果2. 1間接ELISA方法的建立以純化的EIV新疆株為檢測抗原，通過矩陣法確定抗原的最佳濃度為10 μ g/ml, 陰陽性血清的最佳稀釋度均為1 400，作用時間lh。HRP標記抗鼠IgG最佳稀釋度為 1 40000，作用時間 45min。2. 2雜交瘤細胞株的建立及亞類鑒定經(jīng)4次細胞克隆，最終獲得3株能穩(wěn)定分泌抗EIVNP的雜交瘤細胞株，分別命名為 2G11、3E10和4A1?？贵w亞類試劑盒鑒定結(jié)果顯示2G11為IgGl亞型，3E10為IgG^i亞型， 4A1為IgM亞型。輕鏈均為κ鏈。2. 3單抗腹水的制備及效價測定采用間接ELISA方法測定2G11和3E10腹水效價為1 409 600和1 204 800， 明顯高于雜交瘤上清液的效價1 640和1 640。但4A1上清效價為1 320，腹水效價確為0。采用ftOtein G對2G11和3E10進行純化，純化后濃度分別為900 μ g/ml和!Mg/ ml ο2. 4單抗的特性鑒定2. 4. 1特異性分析Western blot分析結(jié)果顯示，3株單抗均能特異性識別EIV NP重組蛋白，而與His 標簽無反應性(圖1)。間接ELISA結(jié)果證明這3株單抗僅與EIV反應呈陽性，而與EAV、 EHV-l、EHV-4和JEV反應均為陰性。表明這3株單抗與EIV特異性結(jié)合。間接免疫熒光鑒定，其結(jié)果同樣反映出這3株單抗與EIV反應呈陽性(圖2)。2. 4. 2單抗親和力測定結(jié)果純化的2G11和3E10利用非競爭性酶聯(lián)免疫試驗，繪制ELISA反應曲線圖(圖3)。 通過計算得出2G11的親和常數(shù)為4. βθΧΙΟ^,βΕΙΟ的親和力常數(shù)為2. 2 X IO6M^10
權(quán)利要求
1.一株分泌抗馬流感病毒核蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于，其微生物保藏號是CGMCC NO. 4611。
2.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株在制備診斷或檢測馬流感病毒試劑中的用途。
4.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備診斷或檢測馬流感病毒試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了馬流感病毒核蛋白單克隆抗體及其制備方法和應用。本發(fā)明利用原核表達的馬流感病毒(EIV)核蛋白(NP)為免疫原，細胞融合后通過有限稀釋法克隆和間接ELISA法篩選，獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞株2G11和3E10。兩株單抗均能產(chǎn)生較高的腹水效價，Western-blot分析表明，所獲得的2株單抗均能特異性識別EIV NP重組蛋白；間接免疫熒光試驗證明，2株單抗能夠與天然EIV結(jié)合；ELISA測定，2株單抗與馬動脈炎病毒、馬皰疹病毒1型、馬皰疹病毒4型、馬乙型腦炎病毒均不發(fā)生交叉反應。本發(fā)明為抗EIV NP單抗的制備及后期EIV檢測方法的建立提供了物質(zhì)基礎。
文檔編號C12N5/20GK102242082SQ20111010538
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者相文華, 趙立平, 郭巍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所