專利名稱：用于檢測鴨瘟病毒抗體的elisa試劑盒及抗體檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物醫(yī)學領域，特別涉及用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒及抗體檢測方法。
背景技術：
鴨瘟(duck plague，DP)是由皰疹病毒科中的鴨瘟病毒(duck plague virus,DPV) 引起的常見于鴨、鵝、天鵝等水禽的一種高度致死性傳染病，在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)都有分布， 其預防和控制已直接關系到水禽養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。臨床和實驗室試驗證實DPV弱毒疫苗是預防控制DP的有效生物制劑，而對DPV特異性抗體的監(jiān)測是評價DPV弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程序的關鍵。目前，用于檢測DPV抗體的方法主要有中和試驗 (neutralization test, NT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、Dot-ELISA測定法和被動血凝試驗等。其中經(jīng)典的方法是血清中和試驗，但其敏感性不夠理想，且耗時費力，不適于大批量血清樣品的檢測。ELISA具有特異性強、敏感度高、快速準確、易于操作等特點，是DPV感染早期快速診斷和免疫抗體監(jiān)測的有效手段；但是，由于DPV全病毒純化方法的復雜性以及純度不夠理想，阻礙了包被全病毒的ELISA方法 (DPV-ELISA)的大規(guī)模應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種ELISA試劑盒，該試劑盒可用于鴨瘟病毒抗體的檢測，其成本低，適用于大規(guī)模運用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為
用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒，所述ELISA試劑盒包括固相支持物、抗體捕獲劑、酶標二抗、底物、封閉液，所述抗體捕獲劑為重組鴨瘟病毒UL16蛋白，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。進一步，所述重組鴨瘟病毒UL16蛋白的濃度為大于或等于1. 25 μ g/ml ； 進一步，所述酶標二抗作10000倍體積稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鴨IgG ； 進一步，所述抗體捕獲劑與所述酶標二抗的加入量為等體積。本發(fā)明的目的之二在于提供一種鴨瘟病毒抗體的檢測方法，該方法操作簡單，特異性和敏感性高。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為
運用ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，具體步驟為 用所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，具體步驟為 a固相抗原的制備將抗體捕獲劑與固相支持物連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，得固相抗原；
b 一抗結(jié)合將待檢標本通過保溫反應使與所述固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；c 二抗結(jié)合將所述酶標二抗稀釋液與所述固相抗原抗體復合物結(jié)合，得抗原一抗體一二抗復合物；
d顯色在步驟C所得抗原一抗體一二抗復合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應得顯色樣品液；
e檢測并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標儀測OD45tlnm值，判斷結(jié)果。進一步，步驟B中所述待測標本為作160倍體積稀釋的血清；
進一步，步驟e中，將步驟d所述顯色樣品液用酶標儀測OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0. 598為陽性，所述OD450nm彡0. 598則為陰性；
進一步，所述方法還包括空白對照實驗和陰性對照實驗；
進一步，步驟a中所述重抗體捕獲劑、步驟b中所述待檢標本及步驟c中所述酶標二抗的加入量為等體積；
進一步，步驟a中所述重組鴨瘟病毒UL16蛋白液、步驟b中所述待測標本及步驟c中所述酶標二抗加入量為100 μ L0本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明基于純化的重組UL16蛋白建立的間接ELISA法， 其特異性好，對鴨乙肝病毒(DHBV)、鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨大腸桿菌(E. coli)、鴨沙門氏菌(Salmonella)、鴨腫頭出血癥病毒(DSHDV)、流感病毒(Η5Ν1) 的陽性血清進行檢測，結(jié)果均為陰性；該方法對批內(nèi)或批間重復試驗顯示變異系數(shù)均小于 10%，能檢出經(jīng)1:5120倍稀釋的DPV弱毒疫苗免疫鴨的陽性血清。


為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中
圖1為DPV UL16基因的PCR擴增M指DNA相對分子質(zhì)量標準D2000 ； 1指以DPV CHv 毒株基因組DNA為模板的PCR擴增產(chǎn)物(分子量大小，約為1098 bp)；
圖2為重組質(zhì)粒pMD18-UL16的雙酶切及PCR鑒定M1指DNA相對分子質(zhì)量標準 D15000，M2為DNA相對分子質(zhì)量標準D2000 ；1指重組質(zhì)粒pMD18_UL16用HindIII和XhoI 雙酶切得到的兩個片段；2指重組質(zhì)粒pMD18-UL16的PCR擴增產(chǎn)物(分子量大小約為1098 bp)；
圖3為重組表達載體pET32b-UL16的雙酶切及PCR鑒定M1為DNA相對分子質(zhì)量標準 D2000 ；M2指DNA相對分子質(zhì)量標準D15000 ； 1是重組表達載體pET32b_UL16的PCR產(chǎn)物；2 指重組表達載體pET32b-UL16用HindIII和SioI雙酶切得到的兩個片段(UL16分子量大小約為1098bp)。圖4為重組表達蛋白的SDS-PAGE鑒定M為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1為以 Rossetta (DE3)為表達宿主的pET32b_UL16加IPTG誘導的包涵體；2為以Rossetta (DE3) 為表達宿主的pET32b-UL16未加IPTG誘導；3為以Rossetta(DE3)為表達宿主的pET32b空載加IPTG誘導，4為Rossetta (DE3)為表達宿主的pET32b_UL16加IPTG誘導的上清(表達蛋白質(zhì)分子量大小約為60 KD)。圖5為誘導劑IPTG不同終濃度誘導表達結(jié)果1-6的IPTG濃度分別為1. 0,0. 8、、0. 6、0. 4、0. 2、和0. 0 mmol/L ;M為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；7為以Rossetta (DE3)為表達宿主的pET32b空載加IPTG誘導(IPTG濃度對表達量的影響較小)。圖6為不同溫度誘導pET32b-UL16表達結(jié)果1_3的溫度分別為25、30和37°C ； 圖7為不同時間誘導pET32b-UL16表達結(jié)果:1_5的誘導時間分別為2、4、0、8和6h ；6
為以Rossetta (DE3)為表達宿主的pET32b空載加IPTG誘導(誘導Mi時表到量最大)。圖8為重組UL16蛋白純化效果檢測(SDS-PAGE分析)M為蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1為包涵體洗滌法過柱純化后透析復性的重組UL16蛋白；2為6次洗滌后的重組UL16 包涵體蛋白；
圖9為重組UL16蛋白的反應原性檢測(Western blotting分析)=M為預染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1指是以兔抗DPV抗體為一抗檢測復性的重組UL16蛋白(約為60 KD)。
具體實施例方式實施例1抗體捕獲劑的制備
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一材料方法菌株、質(zhì)粒和毒株
質(zhì)粒PMD18-T，購自大連寶生物工程有限公司；原核表達質(zhì)粒pET32b (+), Novagen公司產(chǎn)品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達宿主菌E. coli Rossetta (DE3)和DPV CHv強毒株，由四川農(nóng)業(yè)大學禽病研究中心提供。2試驗鴨胚和血清
10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性；兔抗DPV抗體，由四川農(nóng)業(yè)大學禽病研究中心提供。主要試劑
瓊脂糖、2XTaq PCR MasterMix, DNA連接酶Mix、限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol、 UltraPure 質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和UltraPure DNA回收試劑盒等分子生物學試劑及試劑盒購自大連寶生物公司、北京賽百盛基因技術有限公司、華美生物工程公司和Bio-Rad 公司；其它試劑均為分析純，購自上海生工生物技術有限公司。二實驗方法
1鴨瘟病毒UL16基因的克隆 1.1引物設計
利用Primer Premier5. O軟件，參考UL16基因序列(GenBank登錄號EU195095)，由寶生物生物技術有限公司合成。引物DPV-UL16 Pl 5’-AAGCTTATGGCTCGCAGTACTATTA-3’ ( 劃線部分為 HindIII 位點)JBSEQ ID NO: 1 所示；引物 DPV-UL16 P2: 5，-CTCGAGGACAGTA TATTATGTTTTGG-3，(劃線部分為XhoI位點)，如SEQ ID NO: 2所示。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為10 umol/L, -20°C保存?zhèn)溆?。鴨瘟病毒基因組DNA的提取
鴨胚成纖維細胞的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用5%碘酒和75%酒精消毒蛋殼表面。無菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟，PBS沖洗后將胚體剪成Imm大小的小塊，加PBS適量，之后置于三角瓶內(nèi)，加細胞分散劑(體積分數(shù)為 2. 5%的胰蛋白酶)150 μ 1/胚，于37°C水浴中消化anin。立即將細胞懸液以5000r/min 4°C 離心5min，傾棄上清，細胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用5層紗布過濾，向濾液中加入10% 小牛血清和100IU/mL雙抗后，分裝于IOOmL細胞培養(yǎng)瓶中，7mL/瓶，水平靜置于37°C細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。鴨瘟病毒增殖取剛剛長成致密單層的鴨胚成纖維細胞(DEF)，棄生長營養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細胞表面2次后，加入鴨瘟病毒液0. 5 ImL覆蓋細胞表面進行吸附，37°C吸附120 min后棄鴨瘟病毒液，然后加含體積分數(shù)為3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM 維持營養(yǎng)液，之后37 °C培養(yǎng)。同時做未接毒的DEF對照。DNA提取方法直接從感染細胞中提取鴨瘟病毒基因組DNA的具體步驟如下(1) 選取用DPV種毒感染后細胞病變(CPE)達60 % 70 %的DEF (IOOmL細胞瓶)；同時選取細胞形態(tài)正常的DEF作對照；(2)傾去細胞培養(yǎng)液，加入500yL的細胞裂解液，同時加蛋白酶 K(10mg/mL)至終濃度為200 μ g/mL，輕輕混勻后，37°C孵育IOmin ； (3)將細胞懸浮液倒入 EP離心管中，并用500 μ L的飽和酚洗滌殘存于細胞瓶內(nèi)的裂解物，倒入離心管中；(4)用飽和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/L NaAC, 混勻后，加入2倍體積冷無水乙醇，_20°C放置30 60min ； (6) 13 000r/min離心20min，沉淀用預冷的70%乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入IyL RNA酶， 37°C作用30min，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 1. 3 PCR擴增鴨瘟病毒UL16基因 PCR反應體系為
權(quán)利要求
1.用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述ELISA試劑盒包括固相支持物、抗體捕獲劑、酶標二抗、底物、封閉液，所述抗體捕獲劑為重組鴨瘟病毒UL16蛋白， 其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述重組鴨瘟病毒UL16蛋白的濃度為大于或等于1. 25μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述酶標二抗作10000倍體積稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鴨IgG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述抗體捕獲劑與所述酶標二抗的加入量為等體積。
5.用權(quán)利要求1-4任一項所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于， 具體步驟為a固相抗原的制備將抗體捕獲劑與固相支持物連接，用封閉液封閉，洗滌去除未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，得固相抗原；b 一抗結(jié)合將待檢標本通過保溫反應使與所述固相抗原結(jié)合形成固相抗原抗體復合物，洗滌去除固相載體上雜質(zhì)；c 二抗結(jié)合將所述酶標二抗稀釋液與所述固相抗原抗體復合物結(jié)合，得抗原一抗體一二抗復合物；d顯色在步驟C所得抗原一抗體一二抗復合物加入色原底物避光顯色后，加入終止液終止反應得顯色樣品液；e檢測并判定將步驟d所述顯色樣品液用酶標儀測OD45tlnm值，判斷結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于，步驟B 中所述待測標本為作160倍體積稀釋的血清。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于，步驟e 中，將步驟d所述顯色樣品液用酶標儀測OD45tlnm值，所述OD45tlnm值> 0.598為陽性，所述^ 0. 598則為陰性。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于所述方法還包括空白對照實驗和陰性對照實驗。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于步驟a 中所述重抗體捕獲劑、步驟b中所述待檢標本及步驟c中所述酶標二抗的加入量為等體積。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法，其特征在于步驟 a中所述重組鴨瘟病毒UL16蛋白液、步驟b中所述待測標本及步驟c中所述酶標二抗加入量為100 μ L。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物醫(yī)學領域，特別涉及用于檢測鴨瘟病毒抗體的ELISA試劑盒，所述ELISA試劑盒由固相支持物、抗體捕獲劑、酶標二抗、底物、封閉液組成，所述抗體捕獲劑為重組鴨瘟病毒UL16蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNO3所示；所述的ELISA試劑盒檢測鴨瘟病毒抗體的方法具體步驟為固相抗原的制備、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、顯色及檢測和判定；本試劑盒特異性和敏感性高，該方法對批內(nèi)或批間重復試驗顯示變異系數(shù)均小于10%，能檢出經(jīng)1:5120倍稀釋的DPV弱毒疫苗免疫鴨的陽性血清。
文檔編號C12N15/70GK102360013SQ20111010530
公開日2012年2月22日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者何琴, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學