專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)方法，具體是轉(zhuǎn)基因植物分子水平的非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
按照聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)的定義，生物安全是指“避免由于對(duì)具有感染能力的有機(jī)體或者遺傳修飾有機(jī)體的研究和商品化生產(chǎn)而對(duì)人類的健康和安全以及環(huán)境的保護(hù)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)”，可歸納為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、食品安全和非預(yù)期效應(yīng)三個(gè)方面。在轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)的諸多項(xiàng)目中，非預(yù)期效應(yīng)的評(píng)價(jià)是難度最高的項(xiàng)目，其原因在于轉(zhuǎn)基因植物的非預(yù)期效應(yīng)具有顯著的難以預(yù)測(cè)性(European foodsafety authority, 2005 ；Konig, 2004) 根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FA0/WH0)的定義，轉(zhuǎn)基因生物非預(yù)期效應(yīng)是指由外源基因整合于基因組導(dǎo)致的非目標(biāo)性狀的增加或者導(dǎo)致受體植物存在的性狀的丟失(WHO， 2000)。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室中及世界各國(guó)環(huán)境和食品監(jiān)管部門(mén)在研究和檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物非預(yù)期效應(yīng)時(shí)所使用的方法和技術(shù)主要包括1、基于靶標(biāo)的表型篩選。首先考察轉(zhuǎn)基因植株整體表型與非轉(zhuǎn)基因植株是否存在顯著差異，即農(nóng)藝性狀有沒(méi)有退化；然后鑒定目標(biāo)性狀是否被無(wú)誤的引入受體植物。2、主要成分比較分析法。即基于實(shí)質(zhì)等同性原則對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其非轉(zhuǎn)基因受體在組分上進(jìn)行比較分析，這些主要成分包括脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)、灰分、氨基酸、脂肪酸和維生素等。3、組學(xué)和譜學(xué)的方法，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)(基因芯片)、蛋白質(zhì)組學(xué)(雙向電泳)、代謝組學(xué)(代謝物譜系分析)。其實(shí)質(zhì)也是基于實(shí)質(zhì)等同性原則進(jìn)行的比較法。以蛋白質(zhì)組學(xué)為例，即用雙向電泳技術(shù)考察轉(zhuǎn)基因植物與其非轉(zhuǎn)基因受體之間在表達(dá)譜上是否存在差異點(diǎn)。(參考文獻(xiàn)F. Cellini, A. Chesson, I.Colquhoun, etal, .2004. Unintended effects and their detection in genetically modifiedcrops[J]. Food and Chemical Toxicology. 42 :1089-1125. Deng PJ, Zhou XY, Yang DY, et al, . 2008.The definition, source, manifestationand assessment of unintended effects in genetically modified plants[J]. Journal ofthe Science of Food and Agriculture. 88 :2401-2413.)。上述所有方法的思路都是從結(jié)果入手，先分析一個(gè)結(jié)果性事件對(duì)另一個(gè)結(jié)果性事件是否存在影響，然后從出發(fā)的結(jié)果上找原因，并試圖研究這個(gè)原因是否同時(shí)是終點(diǎn)的結(jié)果的原因。在這一過(guò)程中間，就存在由各通路鏈條的“黑盒子”而導(dǎo)致的結(jié)論不確定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是利用酵母雙雜交的方法，首先對(duì)外源目的蛋白克隆與鑒定，構(gòu)建為誘餌融合蛋白，再將轉(zhuǎn)基因植物受體親本的cDNA文庫(kù)構(gòu)建獵物融合蛋白，最后用誘餌融合蛋白對(duì)獵物融合蛋白文庫(kù)進(jìn)行篩選，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物受體親本 cDNA文庫(kù)的篩選，獲得與外源目的蛋白相互作用的陽(yáng)性作用子(見(jiàn)圖1)。本發(fā)明直接考察外源蛋白與受體植物蛋白組的相互作用，這樣從確定的原因著手，通過(guò)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)得到明確的結(jié)果，從而在分子水平得到評(píng)價(jià)非預(yù)期效應(yīng)的確定性結(jié)論，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物分子水平的非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)的研究可以得到轉(zhuǎn)基因植物表型的非預(yù)期改變，從而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物表型水平非預(yù)期效應(yīng)的確定性結(jié)論。本發(fā)明具體包括以下步驟1、外源目的蛋白的克隆與鑒定外源目的蛋白是指轉(zhuǎn)基因植物中插入的目標(biāo)性狀。從轉(zhuǎn)基因植物或外源目的蛋白的原始來(lái)源處通過(guò)PCR或基因分離的方法獲得目標(biāo)蛋白的基因序列，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆擴(kuò)增，再通過(guò)PCR、瓊脂糖電泳、序列測(cè)定、序列比對(duì)分析鑒定目的片段。2、外源目的蛋白構(gòu)建誘餌融合蛋白將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，雙酶切同時(shí)消化目的基因片段和質(zhì)粒載體，并回收純化線性酶切產(chǎn)物。將載體和目的基因按照1 3的摩爾比進(jìn)行連接反應(yīng)，16°C過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，于抗性培養(yǎng)基上鑒定陽(yáng)性克隆。液體培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，確定為外源目的基因構(gòu)建的誘餌融合蛋白質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化酵母鑒定外源蛋白重組子的自激活活性和毒性，如無(wú)自激活活性和毒性，即可用于后續(xù)分子操作。3、轉(zhuǎn)基因植物受體親本的cDNA文庫(kù)構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫(kù)的材料是轉(zhuǎn)基因植物受體親本的全株幼苗。具體操作為常規(guī)文庫(kù)構(gòu)建的方法，提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-Hoffman 法合成ds cDNA文庫(kù)，經(jīng)末端平滑化，連接Adaptor、限制性酶切，去除短片段后連接到質(zhì)粒載體上，構(gòu)建質(zhì)粒載體連接文庫(kù)。取0. 5 μ L連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，檢測(cè)文庫(kù)庫(kù)容約> 1. 8 X IO6Cfu, 100萬(wàn)倍克隆擴(kuò)增放大cDNA文庫(kù)后提取濃度為1. Omg/mL的質(zhì)粒2mL待用，即為獵物融合蛋白表達(dá)文庫(kù)。4、用共轉(zhuǎn)化的方法通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行文庫(kù)篩選共轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化使用的酵母菌株為Y2H Gold yeast strain (購(gòu)自Clontech公司)， 將新鮮復(fù)蘇的酵母單菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)去離子水、lXTE/LiAc 重懸、洗滌后獲得感受態(tài)細(xì)胞；然后利用PEG/LiAc介導(dǎo)的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質(zhì)粒系統(tǒng)通過(guò)熱擊共轉(zhuǎn)入新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，最后將轉(zhuǎn)化后的酵母涂
布于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用酵母雙雜系統(tǒng)共有四個(gè)報(bào)告基因，即-His，-Ade，AURl-C和MEL1，因此篩選結(jié)果最終確定的陽(yáng)性克隆應(yīng)該可以同時(shí)將這四個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)激活。文庫(kù)篩選過(guò)程首先是將共轉(zhuǎn)化菌液在加有α半乳糖苷酶顯色底物X- α -Gal和抗真菌素金擔(dān)子素Aba的雙缺培養(yǎng)基上初篩，這一步篩選所得到的克隆即可以生長(zhǎng)且變藍(lán)的菌落，理論上認(rèn)為是由于蛋白質(zhì)之間的相互作用而激活了兩個(gè)報(bào)告基因AURl-C和MELl的表達(dá)。經(jīng)過(guò)第一輪篩選得到的陽(yáng)性克隆繼續(xù)劃線培養(yǎng)在含Χ-α -Gal和Aba的四缺培養(yǎng)基上。有些第一輪篩出的陽(yáng)性克隆在四缺培養(yǎng)基上就不能生長(zhǎng)了，這些視為假陽(yáng)性而予以舍棄。在四缺培養(yǎng)基上仍能很好的生長(zhǎng)的菌落被認(rèn)為又激活了 -His，-Ade基因的表達(dá)，這些菌落被認(rèn)為是初步篩選得到的陽(yáng)性結(jié)果。提取所有陽(yáng)性克隆酵母菌株的質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后菌液涂布LB+Amp的平板，以篩選文庫(kù)質(zhì)粒。由于表達(dá)誘餌蛋白的質(zhì)粒是Kana抗性，而表達(dá)獵物蛋白的質(zhì)粒是Amp抗性，就可以篩除誘餌質(zhì)粒，而只保留獵物質(zhì)粒。每個(gè)板上至少隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，測(cè)序并對(duì)序列進(jìn)行分析。將上述序列分析得到的陽(yáng)性蛋白分別與pGBKT7_Bt共轉(zhuǎn)化Y2H Gold strain酵母菌株，重復(fù)前面的篩選過(guò)程，再次獲得的陽(yáng)性克隆，即可確認(rèn)該蛋白與誘餌蛋白的相互作用。有益效果本發(fā)明所述方法在轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)研究領(lǐng)域具有創(chuàng)新性和很強(qiáng)的實(shí)踐性，對(duì)目前的實(shí)質(zhì)等同性原則基礎(chǔ)下的各種方法具有很好的改進(jìn)和補(bǔ)充作用。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)確定性這是本方法最大的創(chuàng)新和優(yōu)點(diǎn)所在。直接從效應(yīng)產(chǎn)生的根本原因入手，獲得明確的結(jié)論。傳統(tǒng)研究轉(zhuǎn)基因生物非預(yù)期效應(yīng)的各種方法(如主要成分比較法和組學(xué)的方法等)最大的問(wèn)題就是原因和結(jié)果之間各通路鏈條的“黑盒子”而導(dǎo)致的結(jié)論不確定性。在這點(diǎn)上本發(fā)明做了根本性的改進(jìn)。( 高效性通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行的文庫(kù)篩選和驗(yàn)證即可以獲得一些陽(yáng)性互作蛋白，結(jié)果明確且易于分析。(3)實(shí)用性酵母雙雜交的方法對(duì)比于比較分析法和組學(xué)的方法技術(shù)更為成熟和簡(jiǎn)單。更易于操作。(4)廣泛適應(yīng)性本發(fā)明所述方法可以用于任何轉(zhuǎn)基因植物外源目標(biāo)蛋白分子水平的非預(yù)期效應(yīng)研


圖1是酵母雙雜交的方法研究轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)流程圖；圖2是文庫(kù)篩選陽(yáng)性結(jié)果的圖樣，為在四缺培養(yǎng)基(含有X-α-Gal和Aba)上篩選的陽(yáng)性結(jié)果，在四缺培養(yǎng)基上仍可生長(zhǎng)的菌落被認(rèn)為是存在陽(yáng)性相互作用的結(jié)果，每個(gè)菌斑對(duì)應(yīng)一個(gè)可能的陽(yáng)性作用結(jié)果；圖3是陽(yáng)性克隆PCR電泳結(jié)果圖，所示為從四缺培養(yǎng)基上獲得的陽(yáng)性菌落提取酵母質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含Amp的LB培養(yǎng)基上篩出的陽(yáng)性單菌落提取質(zhì)粒后PCR的結(jié)果， 其中I-M泳道各為一陽(yáng)性結(jié)果，Marker為T(mén)randK分子量標(biāo)記。以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻分子水平非預(yù)期效應(yīng)研究的實(shí)例。1、外源蛋白Bt基因的克隆鑒定分析目的基因片段序列和連接載體多克隆位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)下列引物5，端引物CCCATATGATGGATAACAATCCGAACATC，下劃線部分為所引入的Nde I酶切位點(diǎn)；3’端引物GCGTCGACATCATATTCTGCCTCAAAGG,下劃線部分為所引入的Mil酶切位占.對(duì)蘇云金桿菌HD-I菌株(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心)PCR獲得 Bt 基因片段。50 μ L PCR 體系5，端引物 1 μ L，3，端引物 1 μ L，10XK0D buffer 5 μ L, MgS04buffer 2 μ L, dNTP 5 μ L, KOD plus 酶 1 μ L，ddH20 35 μ L ；PCR 條件94 "C 5min, 94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 2min，39 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小并測(cè)序，基因序列在NCBI上Blast比對(duì)鑒定序列信息。2、誘餌質(zhì)粒載體的構(gòu)建將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并回收DNA片段，用del和MlI雙酶切同時(shí)分別消化目的基因片段Bt和質(zhì)粒載體pGBKT7，并回收純化線性酶切產(chǎn)物。將載體和目的基因按照1 3的摩爾比進(jìn)行連接反應(yīng)，16°C過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，于抗性培養(yǎng)基上鑒定陽(yáng)性克隆。搖菌提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后， 轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞鑒定其沒(méi)有自激活活性和毒性，可用于后續(xù)分子操作。3、水稻cDNA文庫(kù)的構(gòu)建種植水稻“明恢63” ( “華恢1號(hào)”受體親本)，取三葉期幼苗，五葉期幼苗和分蘗期苗三個(gè)時(shí)期全株苗材料，液氮研磨后，將三期幼苗研磨粉充分混勻提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-HofTman法合成ds cDNA文庫(kù)，經(jīng)末端平滑化，連接Adaptor、限制性酶切，去除短片段后連接到載體pGADT7上，構(gòu)建水稻質(zhì)粒載體連接文庫(kù)。取0.5yL連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，檢測(cè)文庫(kù)庫(kù)容> LSXlO6Cfu, 100萬(wàn)倍克隆擴(kuò)增放大cDNA文庫(kù)后提取濃度為1. Omg/mL的質(zhì)粒2mL待用。4、文庫(kù)篩選用酵母雙雜交的方法篩選水稻中與蘇云金桿菌殺蟲(chóng)蛋白(CrylAb/Bt)相互作用的候選蛋白。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中以Bt作為誘餌連接到載體pGBKT7，而水稻文庫(kù)蛋白則作為獵物。根據(jù)發(fā)明方案中所述篩庫(kù)方法進(jìn)行文庫(kù)篩選。共轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化使用的酵母菌株為Y2H Gold yeast strain，將新鮮復(fù)蘇的酵母單菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)去離子水、ΙΧΤΕ/LiAc重懸、洗滌后獲得感受態(tài)細(xì)胞；然后利用PEG/LiAc介導(dǎo)的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質(zhì)粒系統(tǒng)通過(guò)熱擊共轉(zhuǎn)入新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞中，最后將轉(zhuǎn)化后的酵母涂布于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用酵母雙雜系統(tǒng)共有四個(gè)報(bào)告基因，即-His，-Ade, AURl-C和MEL1， 因此篩選結(jié)果最終確定的陽(yáng)性克隆應(yīng)該可以同時(shí)將這四個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)激活。文庫(kù)篩選過(guò)程首先是將共轉(zhuǎn)化DNA-BD/Bait (pGBKT7_BT)和水稻cDNA文庫(kù)構(gòu)建的AD/ prey(pGADT7-Library)的酵母菌液涂布在加有α半乳糖苷酶顯色底物X-α-Gal和抗真菌素金擔(dān)子素Aba的雙缺培養(yǎng)基上初篩，這一步篩選所得到的克隆即可以生長(zhǎng)且變藍(lán)的菌落，理論上認(rèn)為是由于蛋白質(zhì)之間的相互作用而激活了兩個(gè)報(bào)告基因AURl-C和MELl的表達(dá)。經(jīng)過(guò)第一輪篩選得到的陽(yáng)性克隆繼續(xù)劃線培養(yǎng)在含X- α -Gal和Aba的四缺培養(yǎng)基上進(jìn)行更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)年?yáng)性篩選。有些第一輪篩出的陽(yáng)性克隆在四缺培養(yǎng)基上就不能生長(zhǎng)了，這些視為假陽(yáng)性而予以舍棄。在四缺培養(yǎng)基上仍能很好的生長(zhǎng)的菌落被認(rèn)為又激活了 -His，-Ade 基因的表達(dá)，這些菌落被認(rèn)為是初步篩選得到的陽(yáng)性結(jié)果。四缺培養(yǎng)基上篩選的陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖2。提取所有陽(yáng)性克隆酵母菌株的質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后菌液涂布LB+Amp的平板，以篩選文庫(kù)質(zhì)粒。由于表達(dá)誘餌蛋白的質(zhì)粒是Kana抗性，而表達(dá)獵物蛋白的質(zhì)粒是Amp抗性，就可以篩除誘餌質(zhì)粒，而只保留獵物質(zhì)粒。每個(gè)板上至少隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，菌落PCR(圖幻后提取質(zhì)粒，測(cè)序并對(duì)序列進(jìn)行分析。將上述序列分析得到的有意義的陽(yáng)性蛋白分別與pGBKT7_Bt共轉(zhuǎn)化Y2H Gold strain酵母菌株，重復(fù)前面的篩選過(guò)程，再次獲得的陽(yáng)性克隆，即可確認(rèn)該蛋白與誘餌蛋白的相互作用。最終得到的陽(yáng)性互作蛋白有①金屬硫蛋白類蛋白；②肌醇加氧酶類蛋白；③脂肪酶；④冷素類家族蛋白；⑤稻屬gamma鏈前體類似物；⑥芥子酶前體；⑦二氫吡啶二羧酸合酶1，葉綠體內(nèi)蛋白前體。由此可以看出，轉(zhuǎn)Bt水稻中這些蛋白會(huì)和表達(dá)的Bt蛋白發(fā)生相互作用，在分子水平上產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)的方法，其特征在于，用外源目的蛋白構(gòu)建誘餌融合蛋白，用轉(zhuǎn)基因植物受體親本cDNA文庫(kù)構(gòu)建獵物融合蛋白文庫(kù)，通過(guò)酵母雙雜交用誘餌融合蛋白對(duì)獵物融合蛋白文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性相互作用蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)的評(píng)價(jià)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將外源基因連接到具有編碼DNA結(jié)合功能域基因的酵母雙雜交質(zhì)粒上構(gòu)建得到表達(dá)誘餌融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，將cDNA文庫(kù)的基因連接到的具有編碼DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域基因的酵母雙雜交質(zhì)粒上構(gòu)建得到表達(dá)獵物融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，將這兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得陽(yáng)性互作蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA結(jié)合功能域?yàn)镚AL4-bd或 LexA-bd,所述DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域?yàn)镚AL4_ad或VP16。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，構(gòu)建誘餌融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的方法是通過(guò)PCR特異擴(kuò)增目的基因，凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，雙酶切同時(shí)消化PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體 PGBKT7，并回收純化線性酶切產(chǎn)物；將載體和目的基因按照1 3的摩爾比進(jìn)行連接反應(yīng)， 16°C過(guò)夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，于抗性培養(yǎng)基上鑒定陽(yáng)性克隆；液體培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定后，確定為外源目的基因構(gòu)建的誘餌融合蛋白質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化酵母鑒定外源蛋白重組子的自激活活性和毒性。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，所述cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法是以轉(zhuǎn)基因植物受體親本的全株幼苗為材料提取純化總RNA，分離純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，利用Gubler-Hoffman法合成ds cDNA文庫(kù)，經(jīng)末端平滑化，連接接頭、限制性酶切，去除短片段后連接到質(zhì)粒載體上；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，檢測(cè)文庫(kù)庫(kù)容大于 LSXlO6Cfu,并擴(kuò)增放大cDNA文庫(kù)，即為獵物融合蛋白表達(dá)文庫(kù)。
6.如權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，用共轉(zhuǎn)化的方法通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行文庫(kù)篩選的方法是將新鮮復(fù)蘇的酵母單菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)去離子水、ΙΧΤΕ/LiAc重懸、洗滌后獲得感受態(tài)細(xì)胞；然后利用PEG/LiAc介導(dǎo)的方法，將誘餌融合蛋白和獵物融合蛋白雙質(zhì)粒系統(tǒng)通過(guò)熱擊共轉(zhuǎn)入新鮮制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞中， 最后將轉(zhuǎn)化后的酵母涂布于培養(yǎng)基上培養(yǎng)；酵母雙雜系統(tǒng)共有四個(gè)報(bào)告基因-His，-Ade, AURl-C和MELl，將共轉(zhuǎn)化菌液在加有α半乳糖苷酶顯色底物X- α -Gal和抗真菌素金擔(dān)子素Aba的雙缺培養(yǎng)基上初篩，篩選能夠生長(zhǎng)且變藍(lán)的菌落；經(jīng)過(guò)第一輪篩選得到的菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)在含X-α-Gal和Aki的四缺培養(yǎng)基上，仍能生長(zhǎng)的菌落為初步篩選得到的陽(yáng)性克隆。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)初步篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步鑒定提取所有陽(yáng)性克隆酵母菌株的質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后菌液涂布LB+Amp的平板，以篩選文庫(kù)質(zhì)粒；每個(gè)平板上至少隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序并對(duì)序列進(jìn)行分析；將上述序列分析得到的陽(yáng)性蛋白的克隆提取質(zhì)粒分別與表達(dá)誘餌融合蛋白的質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株，重復(fù)前面的篩選過(guò)程。
8.如權(quán)利要求2 4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述植物為水稻，所述外源蛋白為CryIAb/Bt，所述具有編碼DNA結(jié)合功能域基因的酵母雙雜交質(zhì)粒為pGBKT7，所述具有編碼DNA轉(zhuǎn)錄激活功能域基因的酵母雙雜交質(zhì)粒為PGADT7，所述酵母菌為Y2HGold yeast strain。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，得到的陽(yáng)性互作蛋白有①金屬硫蛋白類蛋白；②肌醇加氧酶類蛋白；③脂肪酶；④冷素類家族蛋白；⑤稻屬gamma鏈前體類似物；⑥ 芥子酶前體；⑦二氫吡啶二羧酸合酶1，葉綠體內(nèi)蛋白前體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于酵母雙雜交技術(shù)的轉(zhuǎn)基因植物分子水平非預(yù)期效應(yīng)評(píng)價(jià)的方法。將外源目的蛋白構(gòu)建為誘餌融合蛋白，再將轉(zhuǎn)基因植物受體親本的cDNA文庫(kù)構(gòu)建獵物融合蛋白，通過(guò)酵母雙雜交的方法用誘餌融合蛋白對(duì)獵物融合蛋白文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得與外源目的蛋白相互作用的陽(yáng)性作用子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物分子水平的非預(yù)期效應(yīng)的評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102251025SQ20111010479
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者王戎疆, 甄剛, 許崇任, 韓娟 申請(qǐng)人:北京大學(xué)