專利名稱：轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物分子育種，尤其涉及一種轉(zhuǎn)抗蟲基因三系雜交棉育種的方法。
背景技術(shù)：
雜種優(yōu)勢是生物界普遍存在的現(xiàn)象，它可以表現(xiàn)在各種經(jīng)濟(jì)性狀、生長發(fā)育、生理生化、細(xì)胞，以至于分子水平等各個層次上。利用雜種優(yōu)勢是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)提高農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性的有效途徑。如玉米、水稻、油菜等農(nóng)作物雜種優(yōu)勢帶來的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)對世界食物安全已作出了巨大貢獻(xiàn)。
三系，即雄性不育系、保持系和恢復(fù)系，是利用植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育進(jìn)行雜種種子生產(chǎn)(制種)的體系。美國是最早開展三系雜交研究的國家，培育出具有哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)的不育系Des-HAms16和Des-HAms277，并通過把哈克尼西棉的細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)移到陸地棉染色體組中去的方法育成兩個恢復(fù)系Des-HAF16和Des-HAF277，但由于野生棉細(xì)胞質(zhì)對雜種后代的負(fù)效應(yīng)，以及恢復(fù)系育性恢復(fù)不完全、波動大，在同一年份里有的恢復(fù)好，有的恢復(fù)不好(不育)，因此未在生產(chǎn)上應(yīng)用。1980年我國從美國引進(jìn)哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)不育三系，并相繼育成一批有一定育種價值的材料，且完成了海陸三系和陸海三系配套組合，但因為制種產(chǎn)量低和高優(yōu)勢組合缺乏，僅在新疆有小面積種植，未實現(xiàn)大面積產(chǎn)業(yè)化。近年來，浙江大學(xué)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶基因(GTS)導(dǎo)入哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)恢復(fù)系DES-HAF277中，篩選到一個對雄性不育系具有恢復(fù)力的恢復(fù)系“浙大強恢”，與受體恢復(fù)系相比，其對不育系的恢復(fù)力提高25.8％，F(xiàn)1不孕籽率降低10.1％，證明了GTS對棉花花粉育性有明顯的促進(jìn)作用，但也未達(dá)到完全恢復(fù)以及見在生產(chǎn)上應(yīng)用的報道。目前，國際和國內(nèi)棉花雜交種子主要通過“人工去雄授粉法”獲得，但它費工、費時且成本高，大面積應(yīng)用受到限制。
同時，利用生物技術(shù)手段可以獲得對特定害蟲有殺蟲作用的轉(zhuǎn)基因植物，例如目前已經(jīng)在世界上大面積推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉、抗蟲玉米等，即是將異源抗蟲基因轉(zhuǎn)化棉花和玉米，篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株并進(jìn)一步進(jìn)行品種選育，最終培育出可大面積應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因棉花和玉米品種。并且，為獲得特定害蟲難以產(chǎn)生抗性的轉(zhuǎn)基因植物，可以采用同時轉(zhuǎn)化兩種或兩種以上不同殺蟲基因的方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種將Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci抗蟲基因轉(zhuǎn)化棉花保持系和恢復(fù)系，育成轉(zhuǎn)基因抗蟲保持系、不育系和恢復(fù)系，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲不育系和恢復(fù)系選配可獲得強優(yōu)勢組合的轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉分子育種的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取下列措施。
1)采用轉(zhuǎn)基因方法，將異源抗蟲基因(Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci)導(dǎo)入陸地棉品種(系)中，育成轉(zhuǎn)抗蟲基因的保持系；2)采用回交轉(zhuǎn)育的方法，以轉(zhuǎn)抗蟲基因的保持系為輪回親本，育成轉(zhuǎn)抗蟲基因的不育系及其衍生系，其不育率和不育度均為100％；
3)采用雜交的方法，將0-613-2R中的恢復(fù)基因與我國常規(guī)陸地棉中的恢復(fù)加強基因聚合在一起，使獲得的新型陸地棉恢復(fù)系對步驟2獲得的不育系具有完全恢復(fù)能力；4)采用轉(zhuǎn)基因方法，將異源抗蟲基因(Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci)導(dǎo)入新型陸地棉恢復(fù)系中，育成轉(zhuǎn)抗蟲基因的恢復(fù)系及其衍生系，其恢復(fù)率和恢復(fù)度均為100％；5)以轉(zhuǎn)抗蟲基因的不育系為母本，以恢復(fù)系或轉(zhuǎn)抗蟲基因恢復(fù)系為父本，測交并篩選出在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性上具有強優(yōu)勢的雜種F1組合。
本發(fā)明所提供的陸地棉恢復(fù)系及轉(zhuǎn)基因抗蟲恢復(fù)系，聚合了恢復(fù)系0-613-2中的恢復(fù)基因和我國陸地棉中的恢復(fù)加強基因，使雜種F1的可育株率和可育度均達(dá)到了100％，從而有效地克服了國內(nèi)外現(xiàn)有三系雜交棉，尤其是陸陸三系雜交棉雜種F1可育度低的缺陷。同時，本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)抗蟲基因的保持系、不育系和恢復(fù)系，其轉(zhuǎn)化的抗蟲基因包括Bt GFM cry1A單價抗蟲基因、Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因以及cryci融合抗蟲基因三類不同的抗蟲基因，其中Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因以及cryci融合抗蟲基因的表達(dá)產(chǎn)物均包含兩類殺蟲機理不同、殺蟲譜互補且具有協(xié)同增效作用的兩種抗蟲活性蛋白質(zhì)，即Bt毒蛋白和豇豆胰蛋白酶抑制劑，選育獲得的轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因和轉(zhuǎn)融合抗蟲基因的棉花不僅抗蟲效率達(dá)90％以上，而且在生長發(fā)育的中后期，抗蟲效率明顯高于轉(zhuǎn)單價抗蟲基因的棉花。另外，實驗室汰選結(jié)果表明，轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因的棉花可有效延緩棉鈴蟲產(chǎn)生抗性的進(jìn)程。2003-2004年，抗蟲三系雜交棉銀棉2號在全國棉花區(qū)試黃河流域春棉組中，籽棉、皮棉、霜前皮棉兩年平均分別比對照中棉所41增產(chǎn)21.1％、26.4％和29.1％，均居兩年參試品種第一位。
具體實施例方式
給出以下實施例的目的是舉例詳細(xì)描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明待批權(quán)利范圍的限制。在本發(fā)明技術(shù)特征和待批權(quán)利要求范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進(jìn)。
實施例一轉(zhuǎn)抗蟲基因陸地棉保持系選育利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法和花粉管通道法，將Bt GFM cry1A單價抗蟲基因(ZL 95 1 19563.8)、BtGFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因(ZL 98 1 02885.3)以及cryci融合抗蟲基因(200510076823.3)三類不同的抗蟲基因分別導(dǎo)入晉棉7號、中棉所12、中棉所19、中植372、泗棉3號、蘇棉8號、蘇棉12號、泗陽167、泗陽168、石遠(yuǎn)321、新陸早4號、新陸早7號、新陸早8號、遼棉15，以及3517、541、916、C6524、Q0101、蘇引A、蘇引B、蘇引C以及低酚棉W8等優(yōu)良陸地棉品種(系)中，經(jīng)過分子檢測和抗蟲性鑒定，獲得近600份抗蟲性超過90％的轉(zhuǎn)抗蟲基因棉花種質(zhì)資源材料，并在此基礎(chǔ)上，通過系選，獲得70多個高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲的品系，選育出通過省級和國家級審定的晉棉26號、國抗12號、國抗1號、國抗22號、魯棉研16、晉棉31、鄂抗蟲棉1號、晉棉34、魯棉研18號、魯棉研21號、魯棉研22號、魯棉研19號、邯鄲109等共13個單價抗蟲常規(guī)棉品種，和sGK321、新研96-48、中棉所41、中棉所45、中棉所51(棕色)、SGK3、中棉所50等共7個雙價抗蟲常規(guī)棉品種。所獲得的這些抗蟲常規(guī)陸地棉品種(系)均可作為轉(zhuǎn)抗蟲基因陸地棉保持系。
實施例二轉(zhuǎn)抗蟲基因陸地棉不育系獲得以具有陸地棉胞質(zhì)的雄性不育系104-7A為起始不育系，以生產(chǎn)上廣泛種植，具有獨立自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良抗蟲品種或品系為保持系，經(jīng)過連續(xù)多代回交轉(zhuǎn)育，育成具有陸地棉細(xì)胞質(zhì)的棉花雄性不育系40多個，其中穩(wěn)定的單價抗蟲高代不育系包括國抗12A，魯棉研21A、魯棉研22A、魯棉研19A、國抗19A、K9A、C21A等7個，穩(wěn)定的雙價抗蟲高代不育系包括中棉所41A，sGK321A，新研96-48A，中棉所45A，P03A，P05A、17-79A，P80A、5-2A，I-4A，2921A，C035A、HDA，NDA，43A、652A，653A，S-25A，S-56A，L14-343A等20個。在這些不育系中，國抗12A、魯棉研21A、中棉所41A、sGK321A、新研96-48A、17-79A、P03A、P05A具有高配合力，與恢復(fù)系選配出的優(yōu)良組合一般比抗蟲常規(guī)陸地棉品種增產(chǎn)15％以上。
實施例三陸地棉恢復(fù)系及轉(zhuǎn)抗蟲基因恢復(fù)系選育以0-613-2R為起始恢復(fù)系，與生產(chǎn)上廣泛種植的常規(guī)陸地棉雜交后并與不育系測配，篩選獲得聚合了0-613-2R中的恢復(fù)基因以及常規(guī)陸地棉中的恢復(fù)加強基因的恢復(fù)系，并自交純合，育成新型恢復(fù)系18R、19R和20R。新型恢復(fù)系與104-7A來源的不育系雜交，其F1的恢復(fù)株率和恢復(fù)度均達(dá)到了100％，而且可育性穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上，利用花粉管通道法分期、分批進(jìn)行Bt GFM cry1A單價抗蟲基因(ZL 95 119563.8)、Bt GFM cry1A+cpti雙價抗蟲基因(ZL 98 1 02885.3)以及cryci融合抗蟲基因(200510076823.3)三類不同的抗蟲基因?qū)?，?jīng)過卡那霉素初篩、PCR分子鑒定，目前已獲得轉(zhuǎn)單價抗蟲基因的T0代恢復(fù)系32株；轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因的T0代恢復(fù)系26株，轉(zhuǎn)融合抗蟲基因的T0代恢復(fù)系8株。
將T0代轉(zhuǎn)基因植株種成株行，觀察轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀、抗蟲基因的遺傳穩(wěn)定性以及抗蟲基因的表達(dá)特性，同時與不育系雜交判斷其育性恢復(fù)能力。經(jīng)過篩選，將農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良、抗蟲基因遺傳穩(wěn)定且抗蟲性好、育性恢復(fù)完全的株行保留下來繼續(xù)進(jìn)行系選和配合力測定，目前已獲得配合力好、恢復(fù)性狀穩(wěn)定的抗蟲恢復(fù)系A(chǔ)sR(單價)、BsR(單價)、CsR(單價)、R1F-8(雙價)、14R(雙價)、30R(雙價)、FK18R(融合)等7個。
實施例四抗蟲三系雜交棉組合選配利用選育的恢復(fù)系或抗蟲恢復(fù)系與抗蟲不育系組配，目前已篩選出皮棉超過常規(guī)抗蟲對照sGK321 15％的組合8個，而兩個優(yōu)質(zhì)棉組合L14AF1、P80AF1也分別比對照增產(chǎn)12％和6％，抗蟲三系雜交棉銀棉2號在全國棉花區(qū)試黃河流域春棉組中，籽棉、皮棉、霜前皮棉兩年平均分別比對照中棉所41增產(chǎn)21.1％、26.4％和29.1％，均居兩年參試品種第一位。于2005年通過國家棉花專業(yè)委員會的審定，成為第一個通過國家審定的三系雜交棉。目前，尚有GKz11、GKz28、sGKz6、sGKz34等4個組合正在參加全國棉花區(qū)試。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于它的步驟如下1)采用基因?qū)爰夹g(shù)，將單價、雙價、融合抗蟲基因?qū)胂到y(tǒng)選育的棉花恢復(fù)系中，育成對細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的育性恢復(fù)率達(dá)100％的、抗蟲性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)抗蟲基因恢復(fù)系及其衍生系；2)采用基因?qū)爰夹g(shù)，將單價、雙價、融合抗蟲基因?qū)朕r(nóng)藝性狀優(yōu)良的陸地棉品種中，育成對細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的保持率和保持度達(dá)100％的、抗蟲性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)抗蟲基因保持系及其衍生系；3)采用不育系與保持系雜交轉(zhuǎn)育的方法，將抗蟲基因轉(zhuǎn)育到細(xì)胞質(zhì)不育系中，育成對棉鈴蟲和紅鈴蟲等鱗翅目害蟲具有抗蟲性的轉(zhuǎn)基因抗蟲不育系及其衍生系；4)以抗蟲不育系為母本，以抗蟲恢復(fù)系為父本，測交和篩選出抗蟲雜種F1組合；5)F1組合經(jīng)過品種區(qū)域試驗和生產(chǎn)試驗，選育出品質(zhì)優(yōu)良、抗蟲性強、一般可增產(chǎn)20～30％的能用于生產(chǎn)的F1組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的抗蟲基因是指GFMCry1A單價抗蟲基因；GFMCry1A加cpti雙價抗蟲基因和GFMCry1A基因與cpti基因相融合的融合抗蟲基因cryci，基因的表達(dá)產(chǎn)物對棉鈴蟲和紅鈴蟲等鱗翅目害蟲有毒殺作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系是指陸地棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、保持系和恢復(fù)系，并且三系均具有穩(wěn)定的抗蟲性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的轉(zhuǎn)抗蟲基因是指用基因?qū)牒娃D(zhuǎn)育方法，將抗蟲基因轉(zhuǎn)入三系中的過程。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的衍生系，是指以轉(zhuǎn)抗蟲基因的保持系、不育系、恢復(fù)系為基礎(chǔ)材料而育成的有血緣關(guān)系的抗蟲保持系、抗沖不育系和抗蟲恢復(fù)系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-(3)所述的細(xì)胞質(zhì)雄性不育，其特征在于所說的細(xì)胞質(zhì)雄性不育是指陸地棉細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核互作的質(zhì)核互作不育遺傳類型。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的測交和篩選是指雄性不育系與其相應(yīng)恢復(fù)系雜交所獲雜種F1在產(chǎn)量、品質(zhì)和抗蟲性上的優(yōu)勢測定和選擇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的分子育種是指從分子水平的層次上，用基因工程技術(shù)與常規(guī)轉(zhuǎn)育方法相結(jié)合，培育三系雜交棉新種子的技術(shù)，及其應(yīng)用是指培育的新種子應(yīng)用于棉花生產(chǎn)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)抗蟲基因的三系雜交棉的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用，其特征在于所說的F1組合是指經(jīng)過三系雜交所培育的品質(zhì)優(yōu)、抗蟲性強、產(chǎn)量高、并能應(yīng)用于棉花生產(chǎn)的第一代棉花雜交新種子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)三系雜交棉的分子育種方法。育成抗蟲性穩(wěn)定、不育株率和不育度均為100％的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；育成抗蟲性穩(wěn)定、對細(xì)胞質(zhì)雄性不育系恢復(fù)率和恢復(fù)度均達(dá)100％的轉(zhuǎn)基因陸地棉恢復(fù)系；抗蟲恢復(fù)系與不育系雜交，后代表現(xiàn)出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗蟲等強的超親雜種優(yōu)勢，一般可比常規(guī)對照增產(chǎn)皮棉20％～40％。
文檔編號A01H1/06GK1771792SQ20051010911
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者郭三堆, 張銳, 王遠(yuǎn) 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 郭三堆