專利名稱：儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞分離培養(yǎng)與保存相關技術，尤其是從經(jīng)血中分離宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞，宮內(nèi)膜干細胞株的建立，以及相應的培養(yǎng)和保存技術。
背景技術：
干細胞技術是當今生命科學中最熱門的技術之一，其研究內(nèi)容幾乎涉及所有生命科學的生物醫(yī)學領域，除了在細胞治療、組織/器官移植和基因治療中發(fā)揮重要作用外，還在發(fā)現(xiàn)新基因、基因功能分析、發(fā)育生物學模型及新藥開發(fā)等方面產(chǎn)生重要影響。近幾年來，干細胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最權威的美國《kience》雜志連續(xù)2年將干細胞和人類基因組計劃列為當年的10大科學突破，尤其是在1999年甚至將干細胞研究列為第一位。干細胞很可能在醫(yī)學領域引發(fā)革命性進步，因而具有不可估量的醫(yī)學價值，引起了全世界的廣泛關注和研究，美國《時代》周刊認為干細胞和人類基因組計劃將同時成為新世紀最具有發(fā)展和應用前景的領域。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，簡稱MSCs)是來源于成熟組織中的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是細胞移植和組織工程的新型種子細胞， 具有廣闊的應用前景。其中，研究最為廣泛的MSCs是來源于骨髓的間充質(zhì)干細胞，盡管其倫理問題與胚胎干細胞相比大為減少，但骨髓細胞必須通過侵入的途徑獲得，而且隨著年齡的增長，干細胞數(shù)量顯著減少。眾所周知，子宮內(nèi)膜細胞系具有很強的自我更新能力。在每個月經(jīng)周期都會有組織和血管的大量增長，這一增長過程會隨著月經(jīng)周期的結束而停止。美日中等多國科學家的最新研究顯示在隨女性經(jīng)血脫落的子宮內(nèi)膜組織中，具有相當數(shù)量的間充質(zhì)干細胞(基質(zhì)干細胞)——宮內(nèi)膜干細胞，數(shù)量為骨髓來源的30倍；這些干細胞活力更強，更強的自我更新和增殖能力(如心肌細胞的培育效率為傳統(tǒng)利用骨髓細胞培育的100倍)，分化潛能更接近胚胎干細胞。有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜的再生細胞(ERC)不僅具有幾乎每M小時復制一次的驚人速率，而且它們產(chǎn)生獨特生長因子的速率，比來自于臍帶血的干細胞要大上10 萬倍。如果把這些干細胞通過科學的方法儲存起來，在女性未來的一生中，一旦發(fā)生腫瘤等重大疾病或意外嚴重傷害時，就可立即做自體干細胞的移植，恢復健康，減輕自己及家人的經(jīng)濟負擔，減輕社會負擔，還有可能實現(xiàn)女性夢寐以求的“青春常在”、“紅顏永駐”的美好愿望，擁有高品質(zhì)的人生。女性的宮內(nèi)膜干細胞不但可用于本人，還可為她的子女、相關親屬 (如堂表弟妹，甚至父母)等人的臨床應用。由于國內(nèi)所實行的獨生子女政策，一旦患血液系統(tǒng)惡性疾病和遺傳性疾病，就只能采用異基因干細胞移植，宮內(nèi)膜干細胞是異基因干細胞移植最豐富最好的資源。一旦儲存了宮內(nèi)膜干細胞，就相當于為其整個家族建立了一個預防和治療腫瘤及其它相關需干細胞治療疾病的生命銀行。儲存的宮內(nèi)膜干細胞還可供全國和全世界患者選擇作干細胞移植用，并逐步替代價格昂貴、難以找到配型相合的骨髓干細胞。全世界等待干細胞移植的患者數(shù)以億計，僅白血病在我國的發(fā)病率就達十萬分之三、四，即每年新增四萬名左右的患者，而累計的白血病患者約有四百萬，其中大部分是兒童，他們都急需通過干細胞移植來救治。目前有經(jīng)血標本的儲存方法是獲得經(jīng)血標本后，經(jīng)過初步分離，去除大部分的紅細胞，然后直接添加凍存液凍存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法。本發(fā)明針對現(xiàn)有干細胞來源困難或受倫理限制等問題，尋找一種更為高效的來源廣泛且不受倫理限制的宮內(nèi)膜干細胞分離和培養(yǎng)方法。在此基礎上，擴增和純化干細胞，并對所培養(yǎng)的干細胞進行形態(tài)和功能鑒定，從而建立具有干細胞特性的新型干細胞株，然后再將優(yōu)質(zhì)的干細胞資源儲存。本發(fā)明的優(yōu)越之處在于女性廢棄的月經(jīng)血來源廣泛，干細胞含量豐富，先通過高效的分離方法能夠保證被儲存的干細胞的質(zhì)量。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法，依次包括以下步驟1)、準備采集套裝和配制培養(yǎng)基采集管1 裝有20ml Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下濃度萬古霉素(Vancomycin) 60 100 μ g/mL、頭孢氨芐(Claforan) 150 350 μ g/mL、卡那霉素(Amikacin) 50 150 μ g/mL、慶大霉素(Gentamycin) 80 160 μ g/mL、兩性霉素 B (Amphotericin B) 2 ~ 3 μ g/mL R 300 500 月干i ；采集管2 裝有IOml Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，并添加150 250單位肝素；配制Chang完全培養(yǎng)基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha培養(yǎng)基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、16 20mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、1 3mL Chang C基液(Irvine kientific公司)、1 3mL青霉素或者鏈霉素 (Penicillin/Streptomycin, Invitrogen公司，或者為青霉素硫酸鹽或者鏈霉素硫酸鹽)、 1 :3mL 濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、10 20mL 的胎牛血清(ES-FBS，hvitrogen公司)，充分混勻，置4°C冰箱待用；2)、經(jīng)血收集收集月經(jīng)開始的第二或第三天的經(jīng)血；在采集管1內(nèi)加入15 20ml的經(jīng)血，在采集管2內(nèi)加入5 IOml的經(jīng)血；并于0 4°C的低溫下保存，所述保存期彡48h ；3)、無菌檢查將采集管2將離心處理后，得上清液；將上清液按照血培養(yǎng)法進行厭氧菌和需氧菌檢查，并鑒定；若為陽性結果，則結束整個儲存宮內(nèi)膜干細胞的程序；4)、宮內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)將步驟幻所得的采集管1內(nèi)的混合液先進行過濾，然后采用密度梯度離心法，收集單個核細胞；將上述所得的單個核細胞接種于Chang完全培養(yǎng)基中，單個核細胞的接種密度為 1*105 l*106/ml，置于37°C、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的C02培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；5)、細胞擴增和純化待步驟4)的單個核細胞接種于Chang完全培養(yǎng)基中開始細胞培養(yǎng)的4 5天后， 更換Chang完全培養(yǎng)基，并棄除未貼壁細胞；以后每3 4天全量換液一次(可根據(jù)細胞生長狀況而定，全量換液即指換掉全部的Chang完全培養(yǎng)基)；待細胞生長達到80% 90% 融合時，用質(zhì)量濃度為0. 25%的胰蛋白酶(一般每1 20ml的細胞中使用Iml的所述胰蛋白酶)消化收集細胞，然后按5000-6000個/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代；6)、細胞凍存待步驟幻的Pl代細胞鋪滿容器底部后，用質(zhì)量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞；用預冷的凍存液重懸細胞；從而使細胞的密度為1 2*106/ml ；凍存液為在 9體積份的Chang完全培養(yǎng)基中加入1體積份的DMSO(calbiochem公司)制備而得(即為含有10% DMSO的Chang完全培養(yǎng)基)；將上述被凍存液重懸的細胞進行凍存，凍存步驟如下第一步4°C，等待(即溫度降至4°C后，進入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體，即為箱體溫度)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1 · 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束； 取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存。作為本發(fā)明的儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法的改進步驟4)中的密度梯度離心法為 將過濾后所得的混合液離心(例如1600g離心10分鐘)，去除上清后，得血液；用PBS稀釋血液，PBS與血液的體積比為1. 5 2. 5 1 ；將稀釋后的血液加至人淋巴細胞分離液上，稀釋后的血液與人淋巴細胞分離液的體積比為1.5 2. 5 1，離心 (例如600g離心15分鐘)，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層，吸出中間白膜層即單個核細胞。在本發(fā)明中，步驟幻的無菌檢查和步驟4)的內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)可同步進行，原因是無菌檢查需要較長周期，因此，不能等到無菌培養(yǎng)出結果后再進行細胞的分離培養(yǎng)。 如步驟3)的監(jiān)測結果為陽性，則結束整個儲存宮內(nèi)膜干細胞的程序?，F(xiàn)在世界上大部分干細胞庫的做法是從人體取得干細胞(或混有干細胞的其他組織，人臍帶、羊水、外周血等)后，稍加分離即進行凍存，等到需要時再將凍存的細胞復蘇、培養(yǎng)增殖。本發(fā)明的優(yōu)越之處在于從人體取得經(jīng)血標本后，經(jīng)過密度梯度分離后，去除大部分紅細胞，再進行純化擴增培養(yǎng)，獲得純度較高、數(shù)量較大的目標細胞即宮內(nèi)膜干細胞，再進行凍存，這樣就保證了凍存細胞的質(zhì)量，且以后需要用到該份細胞，復蘇后的培養(yǎng)時間也較其他方法短得多。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是實施例1中培養(yǎng)不同時間的宮內(nèi)膜干細胞放大100倍的顯微照片；A 為 PO 代換液 4 天，100X ；B 為 Pl 代 3 天，100X ；C 為 P2 代 3 天，100X ；D 為 P7 代 3 天，100X ；E 為 P22 代 3 天，100X ；圖2是實施例1中流式細胞分析結果圖。
具體實施例方式實施例1 儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法，即人宮內(nèi)膜干細胞的分離、培養(yǎng)、擴增及凍存、復蘇；依次進行以下步驟1)、準備采集套裝和配制培養(yǎng)基采集管1 裝有20ml Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下濃度萬古霉素(Vancomycin) 70 μ g/mL、頭孢氨芐(Claforan) 200 μ g/mL、卡那霉素 (Amikacin) 100 μ g/mL、 X U M (Gentamycin) 140 μ g/mL、胃個生 # ■ B (Amphotericin B) 2. 5 μ g/mL及添加400單位肝素。采集管2 裝有IOml HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)，并添加180單位肝素。在開始步驟2、的收集經(jīng)血以前，要將上述采集管1和采集管2在4°C環(huán)境下存放。配制Chang完全培養(yǎng)基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha培養(yǎng)基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、16mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、2· 5mL Chang C基液(Irvine kientif ic公司)、ImL青霉素(內(nèi)含0. 25g作為有效成分的青霉素鉀鹽)、ImL濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、15mL ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen公司)，充分混勻，置4°C冰箱待用。2)、經(jīng)血收集在志愿者(42歲，已簽訂知情同意書)月經(jīng)開始的第二天，采取半蹲或全蹲的姿勢，將月事杯對折兩次后，放入陰道內(nèi)。兩小時后小心取出，將月事杯中的經(jīng)血20ml倒入采集管1(事先含有步驟1)所述的特定采集液)中；再按照以上步驟重復操作，在采集管2(事先含有步驟1)所述的特定采集液)內(nèi)加入IOml的經(jīng)血。將所得的采集管1和采集管2放入搖床孵育，溫度設置為4°C。3)、無菌檢查將搖床孵育M小時后的采集管2進行離心處理(1600g離心10分鐘)后，得上清液；將所述上清液按照常規(guī)的血培養(yǎng)法進行厭氧菌和需氧菌檢查，并按照常規(guī)方法進行鑒定。若為陽性結果，則結束整個儲存宮內(nèi)膜干細胞的程序。4)、宮內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)將搖床孵育對小時后的采集管1中的樣品用電動移液器吹打混勻，再過濾樣品中的血塊及粘液，接著轉移至50ml離心管中；配平離心管，1600g離心10分鐘，離心機降速調(diào)至最低檔；然后密度梯度離心分離單個核細胞，具體如下首先去除離心管中的上清；注意小心吸液，不要擾亂細胞層，造成額外的細胞丟失；用PBS按一定比例(體積比約為2 1)稀釋已轉移上清的血細胞，電動移液器吹打混勻；在超凈工作臺中取干凈離心管，轉移15mL人淋巴細胞分離液至每根50ml離心管中；鋪層加樣將稀釋后的血液小心的加至已倒好的人淋巴細胞分離液上(加樣時動作要輕柔，避免沖散分層液面或與分層液面混合而影響分離效果)，稀釋后的血液和人淋巴細胞分離液的體積比為2 1 ；
配平離心管，600g離心15分鐘，離心機升降速要調(diào)至最低速擋，確保離心穩(wěn)定，分層清晰；提取單個核細胞離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層，由下到上依次為紅細胞層、粒細胞層、分離液層、單核細胞(MNC)層和血漿層；吸出單個核細胞層把吸管或移液管直接伸入單個核細胞層，先吸該層中央部分細胞，再吸取四周細胞，動作要輕柔，保證不把該層細胞吹散。如果分離液層和MNC層呈乳白色，界面不清楚，提示含有較多單個核細胞，酌情吸取分離液層，速度要緩慢，確保不吸取到紅細胞層；洗滌細胞吸出的單個核細胞混有部分細胞分離液，需用PBS加以洗滌；用電動移液器加PBS將細胞稀釋兩倍以上，混勻，200g離心10分鐘；離心完畢后，小心取出離心管，
去除上清；重復此步驟一次；細胞計數(shù)將以上所得細胞充分混勻，用臺盤藍染色，計數(shù)活細胞；接種細胞根據(jù)細胞計數(shù)結果，調(diào)整細胞密度至2*105/ml接種于75cm2培養(yǎng)瓶內(nèi) (內(nèi)裝IOml的Chang完全培養(yǎng)基)。當然，接種時的細胞密度可采用l*105-l*106/ml。5)、細胞擴增和純化細胞培養(yǎng)于75cm2培養(yǎng)瓶中(內(nèi)設含有密度為2*105/ml細胞的Chang完全培養(yǎng)基10ml)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，瓶蓋擰松半圈，確保瓶內(nèi)空氣與培養(yǎng)箱內(nèi)空氣相通，保持培養(yǎng)箱 37 °C、飽和濕度、CO2體積濃度5%的狀態(tài)開始培養(yǎng)。4天后，從(X)2培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，在無菌條件下去除瓶中的培養(yǎng)基，棄除未貼壁細胞，添加IOmL Chang完全培養(yǎng)基到培養(yǎng)瓶中，再次放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，每3-4天全量換液一次(即全量更換Chang完全培養(yǎng)基一次)。待細胞達到 80%-90%融合時，在每個培養(yǎng)瓶中加入ImL 0. 25% (質(zhì)量濃度)的胰蛋白酶消化，水平方向輕輕搖晃，使胰酶鋪滿平底，作用1分鐘后，倒置顯微鏡下觀察消化效果，待大部分細胞縮至圓形后，再加入IOmL Chang完全培養(yǎng)基終止消化；然后按按5000-6000個/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代。傳代培養(yǎng)過程中，根據(jù)細胞生長情況，每3-4天進行全量或半量換液，直至細胞再次融合，鋪滿平底，重復以上操作進行傳代，記為P2代，依此操作進行傳代。細胞原代培養(yǎng)3-4天全量換液后，去除未貼壁細胞，鏡下觀察，可見較多幾個細胞聚集在一起的克隆，細胞增殖迅速，其倍增時間大約為M-36小時，2天后細胞形態(tài)呈均勻長梭形，培養(yǎng)4-5天后細胞可達到80% -90%融合，細胞呈漩渦狀分布。傳代后細胞M小時內(nèi)完全貼壁，3-4天可鋪滿瓶底，繼續(xù)傳代。體外培養(yǎng)細胞培養(yǎng)至20代后，細胞的增殖速度明顯減慢，細胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象。圖1顯示了培養(yǎng)傳代過程中的細胞形態(tài)圖A原代培養(yǎng)4天，換液后2天的細胞形態(tài)圖，可見細胞形態(tài)較多，有圓形、多角形、梭形等，此時細胞較雜；B是Pl代細胞傳代后3 天的圖，細胞形態(tài)趨于一致；C是P2代細胞傳代后3天的圖，D是P7代細胞傳代后3天的圖， 細胞呈漩渦狀排列，此時細胞純度較高；E是P22代細胞傳代后3天的圖，細胞密度較低，增殖速度慢，并呈現(xiàn)老化現(xiàn)象。以上結果說明，從細胞形態(tài)來看，本發(fā)明分離培養(yǎng)的細胞符合干細胞的特點，細胞的增殖能力較強，本發(fā)明中細胞可傳代至20代左右。
6)、細胞凍存選擇Pl代細胞進行凍存，既保證了凍存時細胞的原始狀態(tài)，也能夠使細胞擴增到
足夠數(shù)量級。每個試管內(nèi)裝含有密度為l_2*106/ml的Pl代細胞1ml。待Pl代細胞生長至融合80 % -90 %后，用Iml質(zhì)量濃度為0. 25 %的胰蛋白酶消化收集細胞。用少量Chang完全培養(yǎng)基重懸細胞，臺盤藍染色，計算細胞數(shù)量和細胞活率，確定細胞活率在80%以上，用Chang完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2_4*106/ml，加入等體積預冷)的凍存液(10% DMS0)；然后分裝于2ml的凍存管中。采用的凍存液是含有10% DMSO(calbiochem公司)的Chang完全培養(yǎng)基(即，凍存前細胞的終濃度為l-2*106/ml)。將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序。凍存程序設置如下第一步4°C，等待(即溫度降至4°C后，進入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1. 0°C /分鐘降至-40. O0C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束； 取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存。實施例2、細胞復蘇培養(yǎng)將上述實施例1所得的凍存的樣本從液氮儲存罐中取出，立即放入37°C水浴中解凍。當觀察到凍存管內(nèi)的冰核只有黃豆大小的時候，將凍存管取出，立刻放入冰水混合物中。在無菌條件下，將凍存管中樣本輕柔吸出，加入一支50mL無菌離心管中，再立即加入 IOmL的Chang完全培養(yǎng)基，充分混勻洗滌，在4°C、IOOOrpm的條件下離心10分鐘，去除管中上清。重復操作一次。用臺盤藍進行細胞計數(shù)及活率分析。按照10000個/cm2的密度(利用Chang完全培養(yǎng)基)將細胞接種到75cm2培養(yǎng)瓶中，放入37°C、飽和濕度、體積分數(shù)為5 % 的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，每3-4天全量換液一次，待細胞達到80% -90%融合時，用濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化，以5000-6000個/cm2密度傳代，復蘇后細胞形態(tài)正常，增殖速度沒有改變，傳代至20代左右，細胞出現(xiàn)老化現(xiàn)象。實施例3.流式細胞檢測選擇實施例1中所得培養(yǎng)P5代的宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞按如下步驟進行流式檢測。每個試管內(nèi)裝有濃度為5*106/ml的P5代細胞^il。1)細胞懸液制備用Iml的0. 25% (質(zhì)量濃度)的胰酶將細胞消化下來，500rpm，5min離心，棄上清。 加PBS洗2遍，然后aiil PBS重懸細胞，從而使細胞濃度為5*106/ml。2) 4%多聚甲醛(PBS配制)固定15min，然后PBS洗2遍(1500rpm，離心5min)。3)5%的85六固定40111士11。4)根據(jù)流式抗體(直標)稀釋度要求每IO6個細胞/200ul分別加入20ul抗體 (CD39、CD44、CD90、CD34、HLA (ABC)、HLA (DR-DP-DQ))，避光，37°C 孵育 30min。5)用PBS洗一遍，1500rpm,離心5min，棄上清，再加入500ul PBS重懸，準備上機檢測。
6)流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司，型號FC-500。所用抗體來自于貝克頓迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富蘭克林湖，NJ)。根據(jù)檢測的干細胞大小特點利用前向散射光(FS)、側向散射光(SS)找到目標細胞群。根據(jù)所選擇的抗體的熒光素標記選擇流式檢測通道，對目標細胞的熒光強弱進行分析，計算出細胞表面標記分子的陽性百分比。具體如圖2所示。從以上實施例可見本發(fā)明方法可以成功從女性經(jīng)血樣品中分離獲得人宮內(nèi)膜干細胞，細胞經(jīng)過擴增和純化培養(yǎng)可培養(yǎng)至20代；細胞經(jīng)過凍存后能夠復蘇繼續(xù)傳代培養(yǎng)，保持干細胞形態(tài)。經(jīng)過流式細胞檢測，復蘇細胞表達⑶39、⑶44、⑶90，不表達⑶34、 HLA(ABC)、HLA(DR-DP-DQ)。表明本發(fā)明能夠建立人宮內(nèi)膜干細胞株，本發(fā)明的人宮內(nèi)膜干細胞儲存方法實際可行，并具有其他細胞庫儲存方法不具備的優(yōu)點。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法，其特征是依次包括以下步驟 1)、準備采集套裝和配制培養(yǎng)基采集管1 裝有20ml Hank's平衡鹽溶液，并添加以下成分至以下濃度萬古霉素 60^100 Pg/mL、頭孢氨芐 150 ；350 Pg/mL、卡那霉素 5(Tl50 Pg/mL、慶大霉素8(Tl60 Pg/mL、 兩性霉素B 2 3Pg/mL及300 500單位肝素；采集管2 裝有IOml Hank's平衡鹽溶液，并添加15(Γ250單位肝素； 配制Chang完全培養(yǎng)基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha培養(yǎng)基、 16^20mL Chang B基液、廣3mL Chang C基液、廣3mL青霉素或者鏈霉素、廣3mL濃度為200 mM的L-谷氨酰胺、l(T20mL的胎牛血清，充分混勻，置4°C冰箱待用； 2)、經(jīng)血收集收集月經(jīng)開始的第二或第三天的經(jīng)血；在采集管1內(nèi)加入15 20ml的經(jīng)血，在采集管2 內(nèi)加入5 10ml的經(jīng)血；并于0、°C的低溫下保存，所述保存期彡48h ；3)、無菌檢查將采集管2將離心處理后，得上清液；將所述上清液按照血培養(yǎng)法進行厭氧菌和需氧菌檢查，并鑒定；若為陽性結果，則結束整個儲存宮內(nèi)膜干細胞的程序；4)、宮內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)將步驟2)所得的采集管1內(nèi)的混合液先進行過濾，然后采用密度梯度離心法，收集單個核細胞；將上述所得的單個核細胞接種于Chang完全培養(yǎng)基中，單個核細胞的接種密度為 l*105 l*106/ml，置于37°C、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；5)、細胞擴增和純化待步驟4)的單個核細胞接種于Chang完全培養(yǎng)基中開始細胞培養(yǎng)的4飛天后，更換Chang完全培養(yǎng)基，并棄除未貼壁細胞；以后每3、天全量換液一次；待細胞生長達到 809Γ90%融合時，用質(zhì)量濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，然后按5000-6000個/cm2 密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代；6)、細胞凍存待步驟5)的Pl代細胞鋪滿容器底部后，用質(zhì)量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞；用預冷的凍存液重懸細胞；從而使細胞的密度為廣2*106/ml ；所述凍存液為在9 體積份的Chang完全培養(yǎng)基中加入1體積份的DMSO制備而得； 將上述被凍存液重懸的細胞進行凍存，凍存步驟如下 第一步4°C，等待； 第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C ； 第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C ； 第四步1. O0C /分鐘降至-40. O0C ； 第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C ； 第六步結束；取出凍存樣本，放入液氮儲存罐長期保存。
2.根據(jù)權利要求1所述的儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法，其特征是所述步驟4)中的密度梯度離心法為將過濾后所得的混合液離心，去除上清后，得血液；用PBS稀釋血液，所述PBS與血液的體積比為1. 5^2. 5 1 ；將稀釋后的血液加至人淋巴細胞分離液上,稀釋后的血液與人淋巴細胞分離液的體積比為1.5 2. 5:1，離心，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)明顯的分層，吸出中間白膜層即單個核細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種儲存宮內(nèi)膜干細胞的方法，依次包括以下步驟1)準備采集套裝和配制培養(yǎng)基；2)經(jīng)血收集；3)無菌檢查；4)宮內(nèi)膜干細胞分離培養(yǎng)將步驟2)所得的采集管1內(nèi)的混合液先進行過濾，然后采用密度梯度離心法，收集單個核細胞；將上述所得的單個核細胞接種于Chang完全培養(yǎng)基中，單個核細胞的接種密度為1*105~1*106/ml，置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；5)細胞擴增和純化；6)細胞凍存。采用本發(fā)明的方法能獲得純度較高、數(shù)量較大的目標細胞即宮內(nèi)膜干細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102154202SQ201110085328
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權日2010年4月6日
發(fā)明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術有限公司