檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的熒光定量pcr試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的熒光定量PCR試劑盒，包括PCR緩沖液、TaqDNA聚合酶混合物，SYBRGreen染料，兩對引物：引物1：上游引物為5’-TATGACCAGGGACCAGGTAC-3’，下游引物為5’-CTCTGCCCTTAGGGACTCACAG-3’；引物2：上游引物為5’-ATCGGCAATGAGCGGTTCC-3’，下游引物為5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTTG-3’。本發(fā)明的試劑盒可以簡便、快速，且能夠以相對定量檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中淀粉樣蛋白（SAA）基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而為快速判斷奶牛是否患有隱性子宮內(nèi)膜炎提供參考。
【專利說明】檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于PCR擴(kuò)增【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的特異性熒光定量PCR試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是DNA體外操作技術(shù)中最常用的技術(shù)，實現(xiàn)了靶DNA片段在反應(yīng)液中呈指數(shù)倍擴(kuò)增。熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合了實時熒光檢測技術(shù)和計算機(jī)分析技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入特定的熒光標(biāo)記物質(zhì)，通過檢測每個熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的變化情況來實時監(jiān)測DNA的擴(kuò)增情況，并獲得每個樣本的熒光定量變化曲線，進(jìn)而獲得每個反應(yīng)管中熒光變化達(dá)到閾值時的PCR循環(huán)數(shù)(Ct);以起始模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此各個標(biāo)本的Ct值對每個反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進(jìn)行定量測定。
[0003]SYBR Green是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝中的熒光染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光發(fā)光度大大增強(qiáng)。這種性質(zhì)用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量的SYBR Green熒光染料能充分地、特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因為模板不同而特別定制，因此設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SRYB Green的靈敏度很高。但是，由于SYRBGreen與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。通過熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0004]奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎是產(chǎn)后恢復(fù)后普遍存在的一種產(chǎn)科疾病，由于無明顯的臨床癥狀，有關(guān)奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎的體外診斷也較為困難，該病往往對養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)造成巨大損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種體外分離的檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的熒光定量PCR試劑盒，利用該試劑盒進(jìn)行的體外檢測的結(jié)果可以為判斷奶牛是否患有隱性子宮內(nèi)膜炎提供較好的參考價值。為此，本發(fā)明還提供其檢測方法和應(yīng)用。
[0006]奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎是子宮上皮細(xì)胞的慢性炎癥過程，而我們的研究結(jié)果表明，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中淀粉樣蛋白(SAA)基因的表達(dá)水平升高與子宮內(nèi)膜炎直接相關(guān)。因此，本發(fā)明提供一種操作簡便、快速，且能夠以相對定量檢測不同奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中淀粉樣蛋白基因(SAA)的相對轉(zhuǎn)錄水平(與ACTB相比較所得比值)的試劑盒，從而判斷奶牛是否患有隱性子宮內(nèi)膜炎。ACTB基因是一種看家基因，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，是理想的內(nèi)參基因。
[0007]本發(fā)明提供一種牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)檢測的熒光定量PCR試劑盒，包括含SYBR Green染料的PCR反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶混合物和兩對引物，所述引物序列如下:
弓丨物I (SAA基因):上游引物序列為5 ’ -TATGACCAGGGACCAGGTAC-3 ’，下游引物序列為5，- CTCTGCCCTTAGGGACTCACAG-3，；
弓丨物2 (ACTB基因):上游引物序列為5 ’ -ATCGGCAATGAGCGGTTCC-3，，下游引物序列為5’ - GTGTTGGCGTAGAGGTCCTTG -3’。
[0008]其中，所述牛為奶牛。
[0009]本發(fā)明的第二個目的是提供一種奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的相對定量檢測方法，是以奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中總mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用引物1、2和SYBR Green染料進(jìn)行實時熒光定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果:當(dāng)引物I擴(kuò)增的基因表達(dá)量相對于引物2擴(kuò)增的基因表達(dá)量>5倍，則判斷為奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎為陽性；反之則為陰性。
[0010]優(yōu)選地，所述實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性2min ;PCR反應(yīng)39個循環(huán)，其循環(huán)過程為95°C變性20s，60.5°C退火30s，72°C延伸30s，每個循環(huán)后檢測熒光信號值。
[0011]本發(fā)明還提供上述試劑盒在離體奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)檢測和鑒定奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎中的應(yīng) 用。
[0012]本發(fā)明提供的檢測試劑盒和檢測方法操作簡便、快速，且能夠以相對定量檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中淀粉樣蛋白(SAA)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而在體外條件下為快速判斷奶牛的隱性子宮內(nèi)膜炎提供參考，為疾病診斷、預(yù)防和提高經(jīng)濟(jì)效益提供幫助。本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用在有關(guān)奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎的體外實驗研究和診斷中都具有重要的參考價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1:引物I對奶牛SAA基因的檢測結(jié)果。左圖為擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對熒光值(Relative Fluorescence Units, RFU);右圖為溶解曲線，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為單位溫度下相對熒光值的變化量。
[0014]圖2:引物2對牛ACTB基因的檢測結(jié)果。左圖為擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)為相對熒光值(Relative Fluorescence Units, RFU);右圖為溶解曲線，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為單位溫度下相對熒光值的變化量。
【具體實施方式】
[0015]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0016]本發(fā)明的奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎的熒光定量PCR診斷試劑盒包括有:反轉(zhuǎn)錄液、
2X SYBR GREEN預(yù)混液、引物混合液1、引物混合液2、mRNA提取液和超純水。[0017]試劑盒中各組成成分如下:
反轉(zhuǎn)錄液:含有DNA酶(25U/ μ L), RNase抑制劑(50 U/ μ L)，逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScript II(250U/y L)。
[0018]2XSYBR Green預(yù)混液:含有Taq脫氧核糖核酸聚合酶(0.1 U/μ L)、dNTPs底物(0.4mmol/L)、Mg2+ (5.0 mmol/L)、KCl (100 mmol/L)、Tris.HCl (20 mmol/L，ρΗ8.3)、SYBRGreen染料。
[0019]引物混合液I (對奶牛SAA基因進(jìn)行擴(kuò)增):上游引物為10 ymol/L、下游引物為10 μ mo 1/L，上游引物I序列為5’ -TATGACCAGGGACCAGGTAC-3’，下游引物序列為5，-CTCTGCCCTTAGGGACTCACAG -3’ ；
引物混合液2 (對奶牛ACTB基因進(jìn)行擴(kuò)增):上游引物為10 ymol/L、下游引物為10 μ mo 1/L，上游引物I序列為5’ -ATCGGCAATGAGCGGTTCC-3’，下游引物序列為5’ -GTGTTGGCGTAGAGGTCCTTG-3’ ；
mRNA提取液=Trizol試劑，氯仿，異丙醇，乙醇(75%)，4種試劑均分別包裝。
[0020]超純水:純度超過18.25 ΜΩ.CM。
[0021]一、提取mRNA:使用時，首先用細(xì)胞刷(母牛專用，國內(nèi)外均有專利產(chǎn)品)從母牛子宮腔內(nèi)取得子宮內(nèi)膜細(xì)胞，將取得的細(xì)胞經(jīng)生理鹽水常規(guī)漂洗2次后，SOOrpm離心5min以收集細(xì)胞(>100個)，加入0.5ml Trizol試劑，室溫放置5min ;再加入0.25ml氯仿，混勻后靜置5min，12000g離心10min后，取上清液0.2ml至新的離心管，并加入異丙醇0.2ml，輕輕震蕩混勻，靜置5min后12000g離心10min，轉(zhuǎn)移0.2ml上清液至新的離心管中，并加入乙醇，12000g離心5min，棄上清，加入20 μ L純水溶解沉淀形成mRNA溶液。
[0022]二、反轉(zhuǎn)錄:取2 μ L mRNA溶液測定含量后，取200ng mRNA至PCR管中，加入4μ L反轉(zhuǎn)錄液，并補(bǔ)加純水至總體積IOyL,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所進(jìn)行程序為:42°C加熱15min,85°C滅活5s,再降溫至4°C。
[0023]三、PCR反應(yīng):取出PCR管，并補(bǔ)加SYBR Green預(yù)混液25 μ L，引物混合液(I或2分別在不同反應(yīng)管)2 μ L，純水13 μ L0將總體積50 μ L的PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min ；PCR反應(yīng)39個循環(huán)，其循環(huán)過程為95°C變性20s，60.5°C退火30s，72°C延伸30s，每個循環(huán)后檢測熒光信號值。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線檢測，程序為:55°C~95°C，0.5°C /10s。
[0024]結(jié)果計算與判斷:擴(kuò)增曲線結(jié)果表明SAA和ACTB基因熒光信號值都符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”型曲線，熔解曲線表明所檢測基因的熒光定量都具有高度的檢測專一性。根據(jù)基因相對表達(dá)的計算公式:2_ΛΛα，對SAA基因表達(dá)進(jìn)行相對表達(dá)量計算(常規(guī)的熒光定量PCR儀器均自帶計算軟件，且操作人員選擇后系統(tǒng)可以自行計算結(jié)果)。當(dāng)引物I擴(kuò)增基因(SAA)的表達(dá)量相對于引物2擴(kuò)增基因(ACTB)的表達(dá)量>5倍，則判斷為母牛隱性子宮內(nèi)膜炎為陽性；〈5倍則為陰性。
[0025]最后應(yīng)說明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括PCR反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和兩對引物；所述引物序列為: 引物1:上游引物序列為5’ -TATGACCAGGGACCAGGTAC-3’，下游引物序列為5’ -CTCTGCCCTTAGGGACTCACAG -3’ ； 引物2:上游引物序列為5’ -ATCGGCAATGAGCGGTTCC-3’，下游引物序列為5’ -GTGTTGGCGTAGAGGTCCTTG -3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述牛為奶牛。
3.一種奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)的相對定量檢測方法，是以奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用引物1、2和SYBR Green染料進(jìn)行實時熒光定量PCR，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果:當(dāng)引物I擴(kuò)增基因的表達(dá)量相對于引物2擴(kuò)增基因的表達(dá)量>5倍，則判斷為奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎為陽性；反之則為陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:95°C總變性2min ；PCR反應(yīng)39個循環(huán)，其循環(huán)過程為95°C變性20s、60.5°C退火30s、72°C延伸30s，每個循環(huán)后檢測熒光信號值。
5.權(quán)利要求1或2 所述的試劑盒在離體奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性反應(yīng)檢測和鑒定奶牛隱性子宮內(nèi)膜炎中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104017882SQ201410270225
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】張世棟, 王東升, 董書偉, 嚴(yán)作廷, 王旭榮, 楊峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所