專利名稱：一種使杜氏藻累積高含量番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物合成番茄紅素的方法，尤其是一種使杜氏藻(Dimaliella)累積高含量的番茄紅素的方法。
背景技術(shù)：
番茄紅素(Lycopene)是一種脂溶性天然色素，其分子是由11個(gè)共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵組成的直鏈型碳?xì)浠衔?，屬類胡蘿卜素類。主要存在于番茄、西瓜、紅色葡萄柚等植物中。近十年來(lái)的研究表明，番茄紅素極強(qiáng)的抗氧化活性，其清除單線態(tài)氧的能力是維生素E的100倍、是β -胡蘿卜素的2. 2倍，清除羥自由基的效果比β -胡蘿卜素強(qiáng)32 倍，為目前自然界中被發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑之一。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素具有優(yōu)越的生理功能，它不僅具有抗癌、抑癌的功效，而且對(duì)于預(yù)防心血管疾病、動(dòng)脈硬化等各種成人病、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)以及延緩衰老等也有良好的效果。2009年全世界番茄紅素的總用量約2300 噸，據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，番茄紅素的需求量在未來(lái)數(shù)年仍將以約10%的速度增長(zhǎng)。目前世界上番茄紅素的生產(chǎn)方法有天然提取法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法三種。俄羅斯和美國(guó)羅氏藥業(yè)有化學(xué)合成的番茄紅素產(chǎn)品，生產(chǎn)成本較低，但其結(jié)構(gòu)為非全反式，生理功能差，而且人們對(duì)化學(xué)合成品毒副作用有相當(dāng)?shù)囊蓱]，因此化學(xué)合成番茄紅素很少用于藥物和食品添加劑。目前市場(chǎng)上的番茄紅素大多是從番茄中提取的天然產(chǎn)物，但由于番茄中番茄紅素的含量?jī)H為0. 002%左右，提取難度大、成本高、純度低，而且大量種植番茄用于番茄紅素提取需要消耗很多的土地資源。利用微生物發(fā)酵法制備番茄紅素的研究方面也有一些報(bào)道，美國(guó)專利US3097146、 US3369974及中國(guó)專利200510090996. 0提出了利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵制備番茄紅素的方法，但這些方法均需要添加氨基吡啶等化學(xué)藥劑干擾霉菌的生物合成路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)番茄紅素的積累，化學(xué)添加劑在產(chǎn)品中的殘留對(duì)人體的健康會(huì)產(chǎn)生不利影響。中國(guó)專利 20071012^95發(fā)明了一種利用細(xì)菌(龜裂鏈霉菌)發(fā)酵累積番茄紅素的方法，但由于受到其合成前體供應(yīng)量的限制，依照此方法生產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)率僅在0. 4% 0. 7%細(xì)胞干重范圍，仍沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的突破與提高。通過(guò)基因工程和代謝工程的方法來(lái)提高番茄中番茄紅素的含量方面也有一些有益的嘗試。如以色列Lycored Natural Product hdustries公司率先選育出番茄紅素含量為普通番茄4 5倍的雜交番茄。英國(guó)將細(xì)菌八氫番茄紅素脫氫酶基因crtl導(dǎo)入番茄細(xì)胞中，培育出了番茄紅素含量為普通番茄3. 5倍的轉(zhuǎn)基因番茄新品種。這些研究雖然在一定程度上提高了原料中番茄紅素的含量，但總體水平仍很低。杜氏藻(Dimaliella)，為綠藻門(mén)多鞭藻科的一屬，是鹽生的、無(wú)細(xì)胞壁的單細(xì)胞綠藻，能高效率地生物合成β-胡蘿卜素，其中的鹽生杜氏藻(Dimaliella salina)細(xì)胞中累積β-胡蘿卜素最高可達(dá)干重的14%，是β-胡蘿卜素含量最高的生物體，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它生物。此外杜氏藻可以在露天開(kāi)放環(huán)境下利用陽(yáng)光和二氧化碳快速生長(zhǎng)，其中鹽生杜氏藻的增殖速度達(dá)約10g/m2/天，因此杜氏藻是生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的很好資源，全球有不少公司利用杜氏藻來(lái)生產(chǎn)胡蘿卜素，用作藥物或健康食品的成分。番茄紅素和胡蘿卜素都是胡蘿卜素類物質(zhì)，它們有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)，讓杜氏藻像生物合成胡蘿卜素那樣直接合成、累積番茄紅素的想法非常有吸引力的，因?yàn)槠駷橹故澜缟线€沒(méi)有發(fā)現(xiàn)過(guò)能夠以如此高的效率來(lái)合成、累積番茄紅素的生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種使杜氏藻(Dimaliella)累積高含量的番茄紅素的方法。植物生物合成β -胡蘿卜素途徑的相關(guān)研究表明，番茄紅素是生物合成β -胡蘿卜素的前體，番茄紅素在番茄紅素-β-環(huán)化酶(Lycopene β-cyclase, LycB)的催化作用
下，先將番茄紅素分子的兩個(gè)末端的之一環(huán)化成Y-胡蘿卜素，然后再將另一端環(huán)化形成 β -胡蘿卜素，LycB是番茄紅素轉(zhuǎn)化為β -胡蘿卜素的關(guān)鍵酶。圖1顯示的是植物β -胡蘿卜素生物合成路徑，如果沒(méi)有LycB的參與，番茄紅素就不能環(huán)化，生物合成β-胡蘿卜素的過(guò)程就會(huì)終止于番茄紅素合成階段。番茄果實(shí)中番茄紅素的累積研究證實(shí)，番茄紅素的累積是上游八氫番茄紅素合成酶基因(psy基因)和八氫番茄紅素脫氫酶基因(pds基因)表達(dá)增強(qiáng)及下游IycB基因表達(dá)減弱的結(jié)果，其調(diào)控方式為相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。杜氏藻生物合成β-胡蘿卜素的過(guò)程中，兩步環(huán)化反應(yīng)都必需LycB參與才能完成，而LycB是IycB基因表達(dá)的產(chǎn)物，因此，通過(guò)抑制杜氏藻的IycB基因的表達(dá)就可以實(shí)現(xiàn)番茄紅素在杜氏藻體內(nèi)不被轉(zhuǎn)化為胡蘿卜素而大量累積下來(lái)。抑制杜氏藻IycB基因表達(dá)的理想途徑是將杜氏藻基因組中的IycB基因敲除 (knock-out)。本發(fā)明將通過(guò)構(gòu)建有效的杜氏藻IycB基因敲除載體，并將載體轉(zhuǎn)入杜氏藻細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)篩選得到敲除了 IycB基因的杜氏藻，該新杜氏藻能夠累積高含量的番茄紅素，使人類可以用一種全新的方式大量、方便地獲取天然番茄紅素。本發(fā)明的具體過(guò)程是第一步，提取杜氏藻基因組DNA。用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)或其它已知方法。所述的杜氏藻 (Dunaliella)是鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil) 或雙杜氏藻(Dunaliella biocuiate)等，其中優(yōu)選累積β -胡蘿卜素能力更強(qiáng)的鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)或巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，特別是鹽生杜氏藻 (Dunaliella salina)。第二步，對(duì)杜氏藻IycB全長(zhǎng)基因進(jìn)行測(cè)序。按照基因工程領(lǐng)域常用的測(cè)序方法進(jìn)行，也可以將測(cè)序工作委托給專門(mén)提供測(cè)序服務(wù)的生物技術(shù)公司。通常利用基因分析儀測(cè)序，先設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行分段克隆、測(cè)序獲取分段序列，然后組裝獲取IycB全長(zhǎng)基因。本發(fā)明根據(jù)GenBank登錄號(hào)EU327877序列設(shè)計(jì)6對(duì)引物對(duì)鹽生杜氏藻Y6株(中鹽制鹽工程技術(shù)研究院)進(jìn)行分段克隆、測(cè)序、組裝，獲得了 Y6的IycB基因序列，見(jiàn)序列表 SEQID NO :1。詳細(xì)的技術(shù)方案將在實(shí)施例1中說(shuō)明。
第三步，IycB基因敲除載體構(gòu)建。在IycB基因敲除載體中包含用于篩選的篩選標(biāo)記基因，并接入了 IycB基因的3' 端同源重組區(qū)和IycB基因的5'同源重組區(qū)。所述的篩選標(biāo)記基因是氯霉素抗性基因、阿特拉津抗性基因、熒光蛋白基因等，本發(fā)明優(yōu)選氯霉素抗性基因、阿特拉津抗性基因。本發(fā)明能采用的起始質(zhì)粒有很多選擇，包括PCAMBIA1301，這是本專業(yè)領(lǐng)域的研究人員所熟知的。。以質(zhì)粒pCAMBIAl30l(GenBank Locus :AF2;3^97)為骨架進(jìn)行含氯霉素抗性基因的IycB基因敲除載體的構(gòu)建過(guò)程是首先將pCAMBIA1301質(zhì)粒中的潮霉素抗性基因(hpt)用限制性內(nèi)切酶BioI酶切，替換為660bp的氯霉素抗性基因(cat，來(lái)自載體pBC SK+)，得到pl301-cat。然后將 pl301-cat 和 pBluescript II KS(+) (GenBank Locus :X52327)用 SacII 酶切，連接，得載體 pBS-1301-cato 再將 pBS-1301-cat 用 XcmI 酶切，自連得載體 pBS-1301-cat-Xcm。原始載體具有三個(gè)NotI酶切位點(diǎn)，但是當(dāng)去掉)(CmI酶切位點(diǎn)之間的片段后，載體只剩一個(gè) NotI酶切位點(diǎn)，因此用NotI酶切鑒定。再將載體pBS-1301-cat-Xcm用NcoI/BstEII雙酶切，去掉其1.81Λ長(zhǎng)的β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)，連上0.61Λ的白喉毒素A鏈基因 (dtA, GenBank Locus :AY6115;35)，得到載體 pBS-1301-cat-Xcm-DTA。最后用 SbfI 酶切載體pBS-1301-cat-Xcm-DTA，接入IycB基因的3 ‘端同源重組區(qū)，NotI酶切載體接入IycB基因的5'同源重組區(qū)，得到敲除載體pDs-GKO-cat。第四步，將IycB基因敲除載體轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞、轉(zhuǎn)化株的篩選、PCR鑒定。將IycB基因敲除載體轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞方法可以是電擊法、聚乙二醇(PEG)法、 基因槍法、玻璃珠攪拌法等，這些方法是基因工程領(lǐng)域所常用的，這些方法在轉(zhuǎn)化效率方面有所不同，優(yōu)選簡(jiǎn)便高效電擊法。用電擊法將IycB基因敲除載體轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞在冰浴中以3kV/cm 8kV/cm 電擊杜氏藻細(xì)胞懸浮液。在本發(fā)明中電擊法可以達(dá)到較高的0. 05% 0. 2%的轉(zhuǎn)化效率。攜帶抗性標(biāo)記的的轉(zhuǎn)化株可以用抗性平板篩選，攜帶熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)化株用流式細(xì)胞鑒別分離儀器篩選。附圖2是電轉(zhuǎn)化后利用氯霉素抗性篩選的平板。挑選出來(lái)的單藻落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后提取DNA，然后PCR檢測(cè)cat基因、dtA基因和敲除片段。檢測(cè)結(jié)果顯示，篩選得到的藻株基因組存在cat基因、dtA基因和敲除片段，證明 IycB基因被成功敲除。將已確認(rèn)IycB基因被敲除的杜氏藻進(jìn)行放大養(yǎng)殖，用高壓液相色譜(HPLC)檢測(cè)藻體中番茄紅素的含量，結(jié)果顯示，所得到的杜氏藻能夠累積高含量的番茄紅素。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)杜氏藻番茄紅素-β-環(huán)化酶基因敲除載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化株的篩選， 得到敲除IycB基因的杜氏藻，該杜氏藻的IycB基因的表達(dá)被抑制，其生物合成β-胡蘿卜素的過(guò)程被阻止于番茄紅素階段，進(jìn)而在其生物體內(nèi)大量累積番茄紅素，該累積過(guò)程是藻體自然的生物代謝過(guò)程，無(wú)需添加任何化學(xué)抑制劑。由本發(fā)明得到的IycB基因敲除的杜氏藻，在10%鹽濃度(脅迫)下養(yǎng)殖就可以大量累積番茄紅素，HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，其番茄紅素的含量可以達(dá)到生物體干重的3% 4%，超過(guò)番茄的1000倍，是迄今為止已知的番茄紅素含量最高的生物。本發(fā)明成果將為人類大量、廉價(jià)地獲取番茄紅素提供全新的解決方案。
本發(fā)明獲得了鹽生杜氏藻Y6的全長(zhǎng)IycB基因SEQ ID NO :1，該鹽生杜氏藻Y6 是商業(yè)化生產(chǎn)胡蘿卜素的最常用的杜氏藻品種，在強(qiáng)光、高鹽等脅迫環(huán)境下能夠累積 β-胡蘿卜素的量最高可達(dá)到生物體干重的10% 14%，因此，該IycB基因序列應(yīng)用于鹽生杜氏藻Υ6的基因敲除具有很好的潛在價(jià)值。


圖1是植物β -胡蘿卜素生物合成途徑。圖2是電轉(zhuǎn)化后利用氯霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化藻。圖3是杜氏藻Υ6和突變株4#40Α1的HPLC分析譜圖，峰I為β _胡蘿卜素，峰II
為番茄紅素。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所涉及的方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為該技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法，所用的酶制劑如無(wú)特別說(shuō)明均為T(mén)aKaRa公司的產(chǎn)品，所涉及的引物的DNA序列在序列中表相應(yīng)列
出ο實(shí)施例1、杜氏藻番茄紅素-β-環(huán)化酶基因敲除載體的構(gòu)建步驟1、杜氏藻基因組DNA的提取5000r/min離心收集DsMG液體培養(yǎng)基(牟春琳，陳喜文，侯召麗.工業(yè)生產(chǎn)β-胡蘿卜素杜氏藻的分離及種屬鑒定.鹽業(yè)與化工，2009,38 ) :25 29)培養(yǎng)的杜氏藻細(xì)胞， 按每IOOmg細(xì)胞加750 μ L制備液(含2. 5mL提取液，2. 5mL核裂解液，ImL 5% (w/v)N-月桂酰肌氨酸鈉，混勻后，稱取0. 024g亞硫酸氫納，溶解，混勻。提取液為350mmol/L山梨醇、 IOOmmol/LTris (pH7. 5)、5mmol/L EDTA。核裂解液為 200mmol/L Tris .HCl (pH7. 5)、50mmol/ L EDTA、2. 0mol/LNaCl,2%CTAB)，55°C孵育濁(每15min顛倒混勻一次)，分裝，每個(gè)離心管 750 μ L ；每管加750 μ L氯仿/異戊醇(24 1)，顛倒混勻，室溫12000r/min離心5min ；取上清，加500 μ L冷異丙醇，顛倒混勻，直至看到線狀DNA出現(xiàn)，室溫12000r/min離心5min ； 用冰冷的75%乙醇洗DNA沉淀兩次，空氣干燥；加500yL TE溶解DNA，55°C加適量RNase A 消化RNA;酚/氯仿/異戊醇05 24 1)抽提兩次；加1/10體積的3!1101/1乙酸鈉，2.5 倍體積的冷無(wú)水乙醇，置_20°C Ih以上，4°C最大轉(zhuǎn)速離心15min，棄上清；用冰冷的75%乙醇洗DNA沉淀兩次，空氣干燥，加100 μ L TE溶解DNA，_70°C保存。步驟2、杜氏藻IycB基因的克隆根據(jù)GenBank 登錄號(hào) EU327877 序列設(shè)計(jì)六對(duì)引物 LycB-l-F/R、LycB-2-F/R、 LycB-3F/R、LycB-4-F/R、LycB-5-F/R、LycB-6-F/R，對(duì)杜氏藻 Y6 的 IycB 全長(zhǎng)基因進(jìn)行分段克隆，測(cè)序。引物L(fēng)ycB-I-F的序列為CTAGATTGCATACAGAACAG，引物L(fēng)ycB-I-R的序列為 GCTGAGC ATCTGTGTAAG ；引物 LycB-2-F 的序列為 TGACCAAGAGTTCAACCCAG，引物 LycB-2-R 的序列為 CTTTGCACCTTTGTCAATGAG ；引物 LycB-3-F 的序列為 GATTGCTGTAAGCCAACCCAC， 引物 LycB-3-R 的序列為 ACAAGAAAGCATCCTGAGGACC ；引物 LycB-4-F 的序列為 ATCGGTAGCCTGAAACCAC,引物 LycB-4-R 的序列為 ATCAGGCAGTACTCCTCATCC ；引物 LycB-5-F 的序列為 AACCCATGTACAAGGTAG ACCC，引物 LycB-5-R 的序列為 AATATCACACCTCATGCCAATG ； 引物 LycB-6-F 的序列為 GGTT ATGAACTCACTTACTCCG,引物 LycB_6_R 的序列為T(mén)TGCTTGTAGTACCCAGTCAC。PCR體系為15 μ L，含Ing鹽生杜氏藻Υ6基因組DNA，0. 18 μ L的10 μ mol/L上游引物，0. 18 μ L的 10 μ mol/L 下游引物，0. 075 μ L的5U/μ L Ex Taq, IXEx Taq 緩沖液，1.2yL 的 2. 5mol/LdNTPs。PCR 反應(yīng)在 TaKaRa PCR Thermal Cycler 600 上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5min ；40 個(gè)三溫度循環(huán)(94°C 40s, 58°C 32s，72°C 110s)， 72°C再延伸7min。0. 7 %瓊脂糖凝膠電泳分離回收PCR產(chǎn)物條帶，與pMD19_T Simple Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α -FT,菌落PCR確定的陽(yáng)性菌進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過(guò)組裝，獲得 9035bp長(zhǎng)的Y6的IycB全長(zhǎng)基因，其序列見(jiàn)序列表SEQ ID NO :1。步驟3、杜氏藻IycB基因敲除載體的構(gòu)建以pCAMBIA1301為骨架進(jìn)行敲除載體構(gòu)建，其步驟如下a.將PCAMBIA1301質(zhì)粒中的潮霉素抗性基因(hpt)用限制性內(nèi)切酶BioI酶切，替換為660bp的氯霉素抗性基因(cat)，得到pl301-cat。b.將 pl301_cat 和 pBluescript II KS(+)用 SacII 酶切，連接，得到載體 pBS-1301-cat。c.將pBS-1301-cat用)(cml酶切，質(zhì)粒自連接，得到載體pBS-1301-cat-Xcm。原本載體具有三個(gè)NotI酶切位點(diǎn)，但是當(dāng)去掉)(CmI酶切位點(diǎn)之間的片段后，載體只剩一個(gè)NotI 酶切位點(diǎn)，因此用NotI酶切鑒定。d.將載體 pBS-1301-cat-Xcm 用 NcoI/BstEII 雙酶切，去掉 1. 8kb 的 gus 基因，連入 0. 6kb 的 dtA 基因，得到載體 pBS-1301-cat-Xcm-DTA。e.用SbfI酶切載體pBS-1301-cat-Xcm-DTA，接入IycB基因的3'端同源重組區(qū)， NotI酶切載體接入IycB基因的5'同源重組區(qū)，得到敲除載體pDs-GKO-cat。對(duì)最終構(gòu)建完成的敲除載體pDs-GKO-cat進(jìn)行關(guān)鍵部位測(cè)序，得到的序列完全正確。3'端同源重組區(qū)是利用引物Ds-T-3-F/R擴(kuò)增基因組所得，5'同源重組區(qū)是利用引物Ds-T-5-F/R擴(kuò)增基因組所得。引物 Ds-T-5-F 的序列為 AAGCGGCCGCCTCAGAAAAAATTGCTAACTCACAAACCATC，引物 Ds-T-5-R 的序列為 AAGCGGCCGCCACCAAGGAAGTCTCTTCCAAGAACAC ；引物 Ds-T-3-F 的序列為 A ACCTGCAGGTGAACAACCCCTTCTAGCCCAATG，引物 Ds-T-3-R 序列為 AACCTGCAGGTTAGGAATCCATCA CAAGCCAATACCC。實(shí)施例2、IycB基因敲除載體pDs-GKO-cat的電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定a.培養(yǎng)杜氏藻細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(1. OX 106/mL)，4°C，4000r/min離心5min，收集細(xì)胞；b.冰上操作，電擊緩沖液(組成為:0. 28mol/L 的 NaCl,5mmol/L 的 KCl,25mmol/ L 的 CaCl2, 20mmol/L 的 H印es，200mmol/L 的甘露醇，200mmol/L 的山梨醇，0. 05 % 的 Tween-20,0. 4mol/L的甘油)懸浮細(xì)胞，清洗2次；c.重懸至細(xì)胞密度為1. 0 X IOVmL ；取90 100 μ L重懸藻液，加終濃度為IOng/ μ L的載體和20ng/ μ L的魚(yú)精DNA，混勻，冰浴IOmin ；d. 6kV/cm 電擊，冰浴 IOmin,加入 ImL DsMG,暗培養(yǎng) 12h ；e.光暗=14 10培養(yǎng)，最后鋪板于含100 μ g/mL氯霉素的固體平板上培養(yǎng)(說(shuō)明書(shū)附圖2)。f.敲除載體pDs-GKO-cat的5 ‘端同源重組區(qū)和3 ‘端同源重組區(qū)，分別位于IycB基因的外顯子VI上游和內(nèi)含子VI下游，且中間插入了 cat基因，因此敲除突變株的IycB基因?qū)⒃贗ycB基因的外顯子VI和內(nèi)含子VI之間產(chǎn)生突變。因此，我們?cè)O(shè)計(jì) CAT-F1/R1、DTA-F2/R2、LycB_F3/R3、DTA-J-F/R、CAT-F/R 引物對(duì)對(duì)藻株進(jìn)行檢測(cè) cat 基因、dtA基因和敲除片段。方法是挑取單藻落擴(kuò)大到ImL培養(yǎng)，然后提取其基因組，用PCR 方法分別鑒定。引物CAT-Fl的序列為AAAATCACTGGATATACCACCG，引物CAT-Rl的序列為 TCATTAAGCATTCTGCCGAC ；引物 DTA-F2 的序列為 ATGGCAGCTATGGCTGGTCCTGATG，引物 DTA-R2 的序列為 CTAGGATCGCCTGACACGATTTC ；引物 LycB_F3 的序列為 GATTGCTGTAAGCCAACCCAC， 弓丨物L(fēng)ycB-R3的序列為ACAAGAAAGCATCCTGAGGACC ；弓丨物DTA-J-F的序列為 GCCATGGCAGCTATGGCTGGTCCTGATG，引物 DTA-J-R 的序列為 CGGTCACCTGTAATCTAGGATCGCCTGA CACGATTTCo經(jīng)上述電轉(zhuǎn)化、篩選、PCR鑒定操作步驟后，得到到IycB基因已經(jīng)被成功敲除的鹽生杜氏藻4#40A1，以10%鹽度的下養(yǎng)殖該藻，并以鹽生杜氏藻Y6為對(duì)照。按以下方式分離藻體、提取番茄紅素，利用HPLC定量檢測(cè)番茄紅素的含量，以確認(rèn)其是否能夠累積高含量的番茄紅素。取藻液50mL，4000r/min離心5min，去上清；加3mL丙酮重新懸浮藻泥，抽提，-20°C放置Ih ；6000r/min離心IOmin ；取上清，0. 45 μ m膜過(guò)濾；取15 μ L進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件色譜柱為Comatex C18 (5 μ m，Φ4. 6 X 250mm)，流動(dòng)相A為乙酸乙酯，流動(dòng)相 B為乙腈和水(9 1，體積比)，梯度0 16min 0 60%、16 30min 60%、30 35min 60% 100%，進(jìn)樣量為151^，柱溫為351，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為502nm。β -胡蘿
卜素標(biāo)準(zhǔn)品用三氯甲烷溶解，番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品用二氯甲烷溶解，然后用HPLC測(cè)定β -胡蘿卜素的標(biāo)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程。HPLC分析杜氏藻提取樣品的胡蘿卜素和番茄紅素的含量，附圖3是HPLC分析的圖譜。HPLC分析結(jié)果顯示4#40Α1的番茄紅素含量占總類胡蘿卜素的56. 4士3. 5%，遠(yuǎn)高于Υ6的2. 9%，是Υ6的19. 45倍；β-胡蘿卜素含量由61. 9%降為15. 9 士 2. 9%，降至Υ6 的25. 7%。按干重計(jì)算，4#40Α1的番茄紅素含量為3. 5士0. 6%，超過(guò)番茄的1000倍以上。參考文獻(xiàn)1、中國(guó)專利200510090996. 00 一種利用三孢布拉氏霉菌發(fā)酵制備番茄紅素的方法；2、中國(guó)專利申請(qǐng)20071012^95—種利用細(xì)菌發(fā)酵生累積高含量番茄紅素的方法。3、牟春琳，陳喜文，侯召麗.工業(yè)生產(chǎn)β-胡蘿卜素杜氏藻的分離及種屬鑒定.鹽業(yè)與化工，2009，38 (4) :25 四
權(quán)利要求
1.一種使杜氏藻(Dimaliella)累積高含量番茄紅素的方法，其特征是抑制杜氏藻的番茄紅素-β-環(huán)化酶(LycB)基因的表達(dá)，使其細(xì)胞的類胡蘿卜素代謝途徑的番茄紅素環(huán)化路徑被阻斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使杜氏藻累積高含量番茄紅素的方法，其特征是敲除杜氏藻的IycB基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的敲除杜氏藻IycB基因的方法，其特征是包括以下步驟 第一步，提取杜氏藻基因組DNA第二步，對(duì)杜氏藻IycB全長(zhǎng)基因進(jìn)行測(cè)序，獲取IycB全長(zhǎng)基因。 第三步，構(gòu)建杜氏藻IycB基因敲除載體，在所構(gòu)建的IycB基因敲除載體中接入IycB 基因的3'端同源重組區(qū)和IycB基因的5'同源重組區(qū)。第四步，將IycB基因敲除載體轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏藻細(xì)胞、轉(zhuǎn)化株的篩選、PCR鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的杜氏藻IycB基因敲除載體，其特征在于含有氯霉素抗性基因或阿特拉津抗性基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的杜氏藻是以下杜氏藻的任何一種鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、雙杜氏藻(Dunaliella biocuiate)。
6.根根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的杜氏藻是鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)或巴 1 (Dunaliella bardawil)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的杜氏藻是鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的杜氏藻IycB基因，其特征在于其序列為SEQID NO1。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物合成番茄紅素的方法，尤其是一種使杜氏藻(Dunaliella)能夠累積高含量的番茄紅素的方法。通過(guò)提取杜氏鹽藻基因組DNA，并克隆其番茄紅素-β-環(huán)化酶(LycB)基因，然后構(gòu)建lycB基因敲除載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)杜氏鹽藻細(xì)胞，經(jīng)篩選和鑒定獲取了lycB基因被敲除杜氏藻，該杜氏藻的lycB基因的表達(dá)被抑制，細(xì)胞生物合成β-胡蘿卜素的過(guò)程被阻止于番茄紅素階段，脅迫條件下能夠在生物體內(nèi)大量累積番茄紅素，番茄紅素的含量可以達(dá)到藻體干重的3％～4％。本發(fā)明的方法是大量、廉價(jià)地獲取天然番茄紅素的新途徑。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102191266SQ20111008489
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者李伯平, 陳喜文, 陳德富 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)