專利名稱：增加植物β-胡蘿卜素含量的番茄紅素ε-環(huán)化酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于具有高含量類胡蘿卜素的新黃美甘薯品種的番茄紅素ε -環(huán)化酶(lycopene ε -cyclase)基因，具體地涉及通過抑制作為在番茄紅素中α -胡蘿卜素的合成酶的番茄紅素ε_環(huán)化酶基因的表達，達到提高植物體內(nèi)胡蘿卜素含量的方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)濟水平提高后，人們的飲食生活變得多樣化起來且水平逐漸提高，隨著消費者對健康食品需求的增大，抗氧化物質(zhì)、胡蘿卜素及膳食纖維的優(yōu)點被廣泛地普及，人們對作為健康食品的甘薯有了新的認識。甘薯的塊莖狀根的營養(yǎng)，除水分之外，大部分為作為熱量供給源的碳水化合物，是高熱量的食品，特別是胡蘿卜素和各種無機物質(zhì)，維生素及膳食纖維的含量并不遜色于他作物，并且甘薯的葉與葉柄作為蔬菜的利用價值很高。并且含有大量維生素B、維生素C、鈣、鐵等成分，并且含有花青素等類黃酮類或綠原酸(chlorogenic acid)等數(shù)種多酚類物質(zhì)。(Bovell_Benjamin2007，Adv Food Nutr Res 52 :1-59)。肉質(zhì)為黃色的甘薯品種含有高含量的類胡蘿卜素成分，全世界范圍內(nèi)在克服維生素A缺乏方面上(vitaminA deficiency, VAD)起到了重要的作用。在發(fā)展中國家，VAD會導(dǎo)致一時性或永久性失明，特別是對于兒童、孕婦、哺乳期女性來說更加致命。全世界很多人因為VAD而受苦，這可以通過攝取維他命原Α( β -胡蘿卜素或其他類胡蘿卜素)來克服(Stephenson et al. 2000, Parasitology 121 Suppl S5-22)。早在90年前就已知甘薯可以克服老鼠的VAD現(xiàn)象(Steenbock 1919，Science 50 352-35 ，在肯尼亞將黃色甘薯定為每年可以攝取的最經(jīng)濟的β-胡蘿卜素的材料，并將其進行廣泛宣傳(Solomons and Buluxl997, Eur J Clin Nutr 51 Suppl 4 :S39_45)。甘薯是由類胡蘿卜素的大部分轉(zhuǎn)換為維生素A的轉(zhuǎn)換活性最高的β-胡蘿卜素而構(gòu)成，是比其他植物更優(yōu)秀的維生素A攝取源。并且Van Jaarsveld(2005, Am J Clin Nutr 81 :1080-1087)等指出在發(fā)展中國家加大黃色甘薯的消費是最有效的通過飲食消除維生素A缺乏的戰(zhàn)略方法。表現(xiàn)為紅色，黃色，朱黃色的類胡蘿卜素在植物體中通過類異戊二烯的生物合成而得到，被廣泛地認為在去除脂質(zhì)氧化自由基及活性氧上起到重要作用 (Ben-Amotz and Fishier 1998，RadiatEnviron Biophys 37:187-193)。植物中的類胡蘿卜素是光合作用系的必要成分，并且是水果及花的揮發(fā)性成分， 作為植物荷爾蒙ABA的前體物，作為provitaminA的前體物，不僅對植物體本身，對包括人類在內(nèi)的動物也是非常有用的物質(zhì)。如胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素等類胡蘿卜素類成分具有很強的抗氧化功效，不僅作為營養(yǎng)素，在癌癥、心臟疾患、眼疾病方面也是被廣泛利用的重要物質(zhì)
發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明是由如上所述的要求而導(dǎo)出，本發(fā)明的完成實現(xiàn)于對甘薯固有的新型番茄紅素ε-環(huán)化酶的片段基因進行分離，通過調(diào)節(jié)上述基因的表達(expression)，選擇性地提高胡蘿卜素的含量，進而增大機能性活性物質(zhì)的生產(chǎn)，開發(fā)抗氧化活性增強的植物體。(二)技術(shù)方案為解決上述問題，本發(fā)明提供一種來源于甘薯的番茄紅素ε-環(huán)化酶 (lycopene ε -cyclase)蛋白質(zhì)。并且，本發(fā)明還提供編碼上述蛋白質(zhì)的基因。并且，本發(fā)明還提供包括上述基因的重組載體。并且，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化上述重組載體的宿主細胞。并且，本發(fā)明還提供包括上述基因的重組植物RNAi載體并且，本發(fā)明還提供利用上述重組植物RNAi載體，提高植物β -胡蘿卜素含量的方法。并且，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化上述重組植物RNAi載體的，β -胡蘿卜素含量增加的植物體及其種子。(三)有益效果根據(jù)本發(fā)明，抑制編碼新黃美甘薯的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因表達的轉(zhuǎn)化體，不僅能夠選擇性地增加作為生理活性物質(zhì)的胡蘿卜素的含量，并且已確定其具有很強的抗氧化活性，因此本發(fā)明中的轉(zhuǎn)化的愈傷組織可以應(yīng)用于開發(fā)對如高鹽等環(huán)境，具有強耐受性的植物當中。


圖1為本發(fā)明中甘薯(品種為新黃美)的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的部分序列。圖2為由本發(fā)明中甘薯番茄紅素ε -環(huán)化酶基因推測得到的蛋白質(zhì)的氨基酸序列表與各種植物(牽?；ā⒋蠖?、葡萄、咖啡、龍膽、土豆、番茄、棉花、水芹菜、胡蘿卜、甘藍、玉米、稻子、大麥、蘿卜外11種)的β-胡蘿卜素羥化酶基因氨基酸序列的比對圖。圖3為在圖2中進行比對的番茄紅素ε-環(huán)化酶基因之間的親緣關(guān)系 (relationship)的不意圖。圖4為在甘薯植物體中，對本發(fā)明中的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因不同組織表達模式的RT-PCR電泳圖。L，葉子；S，莖；FR，須根；SR，貯藏根。圖5為為在植物體內(nèi)抑制番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達而構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體 (RNAi)的相關(guān)圖。圖6為通過基因組DNA PCR篩選出的轉(zhuǎn)化番茄紅素ε -環(huán)化酶基因RNAi載體的轉(zhuǎn)化愈傷組織圖。圖7為轉(zhuǎn)化愈傷組織由于β -胡蘿卜素含量的增加表現(xiàn)為黃色的圖。圖8為通過RT-PCR，分析轉(zhuǎn)化愈傷組織的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因表達的電泳圖。圖9為通過DPPH自由基消除活性，調(diào)查分析轉(zhuǎn)化愈傷組織低分子抗氧化活性的結(jié)果圖。
圖10為對轉(zhuǎn)化愈傷組織分別進行150mM和200mM的NaCl處理后，觀察表型(A) 再分析氧化的DAB含量(B)的結(jié)果圖。
具體實施例方式為達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種甘薯(Ipomoea batatas)的番茄紅素 ε -環(huán)化酶(lycopene ε -cyclase)蛋白質(zhì)。本發(fā)明中番茄紅素ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)的范圍包括具有用從地瓜(Ipomoea kitatas)分離的SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)及同等活性的上述蛋白質(zhì)的衍生物。所謂“同等活性衍生物”是指經(jīng)過氨基酸的添加，置換或缺失的結(jié)果，與上述SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列至少有70%以上的序列同源性，優(yōu)選為80%以上，更優(yōu)選為 90%以上，最優(yōu)選為95%以上。與SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)具有實質(zhì)性地同質(zhì)的生理活性的蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明還提供編碼上述番茄紅素環(huán)化酶蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明中的基因是與甘薯胡蘿卜素含量的增加有關(guān)，對番茄紅素ε_環(huán)化酶進行編碼的基因組DNA 和cDNA都包括在內(nèi)。優(yōu)選地，本發(fā)明中的基因可包括SEQ ID No. 1所示的堿基序列。并且，本發(fā)明中上述核苷酸序列的突變包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。具體地，上述基因可包括與 SEQ ID No. 1所示的堿基序列分別具有70%以上的同源性的堿基序列。優(yōu)選為80%以上， 更優(yōu)選為90%以上，最優(yōu)選為95%以上。對于多核苷酸的“序列同源性的％”通過兩個最優(yōu)排列的序列和比對區(qū)域進行比較而確定，在比對區(qū)域中的多核苷酸序列的一部分與對于兩個序列的最優(yōu)排列的參考序列(不包括添加或刪除)相比可以包括添加或刪除(即，缺隙(gap))。并且，本發(fā)明提供含有本發(fā)明中的番茄紅素環(huán)化酶基因的重組載體。術(shù)語“重組”是指細胞復(fù)制不同種類的核酸或表達上述核酸或表達肽、不同種類的肽或表達不同種類的核酸編碼的蛋白質(zhì)的細胞。重組細胞可以將在上述細胞的天然形態(tài)中沒有被發(fā)現(xiàn)的基因或基因片段，用正義或反義形態(tài)表達。并且重組細胞能夠表達從天然狀態(tài)的細胞中發(fā)現(xiàn)的基因，但上述基因是經(jīng)過變形的，是通過人為手段重新導(dǎo)入到細胞內(nèi)部的。術(shù)語“載體”是指向細胞內(nèi)傳遞的DNA片段，指核酸分子時使用。載體對DNA進行復(fù)制，能夠獨立地在宿主細胞中再生產(chǎn)。術(shù)語“傳達體”通常與“載體”互換使用。術(shù)語 “表達載體”是指包括能夠在目標編碼序列和特定宿主植物中可動性地進行連接的，對表達編碼序列所必需的適合的核酸序列重組DNA分子。在真核細胞中可利用的信號有啟動子 (promoter)、增強子、終止子及多腺苷酸化信號。這是公知的。重組載體的優(yōu)選的例子有如土壤桿菌屬一樣的，存在于適當?shù)乃拗鲿r，能將本身的一部分，所謂T-區(qū)轉(zhuǎn)移到植物細胞中的Ti-質(zhì)粒載體。其他類型的Ti-質(zhì)粒載體(參照 EP 0116718B1號)作為將現(xiàn)有植物細胞或雜種DNA適當?shù)厍度氲街参锏幕蚪M內(nèi)的能夠產(chǎn)生新的植物的原生質(zhì)體，應(yīng)用于轉(zhuǎn)移雜種DNA序列。Ti-質(zhì)粒載體最優(yōu)選的形態(tài)為如EP 012051681號及美國專利第4，940，838號所申請的所謂二元(binary)載體。能夠?qū)⒈景l(fā)明涉及的DNA導(dǎo)入到植物宿主中的另一適合的載體有來自于雙鏈植物病毒(例如，CaMV)及單鏈病毒及雙生病毒等的病毒載體，例如可選自非完全性植物病毒載體。在難以將植物宿主進行適當?shù)剞D(zhuǎn)化時使用這種載體特別有利。表達載體優(yōu)選地包括一個以上的選擇性標記。上述標記通常情況下作為具有用化學(xué)方法可以選擇的特性的核酸序列，所有可以區(qū)別被轉(zhuǎn)化的細胞和沒有被轉(zhuǎn)化的細胞的基因都能與之對應(yīng)。例如有像草甘膦(glyphosate)或草胺膦(phosphinothricin)等除草劑抗性基因，像卡那霉素(kanamycin)、G418、伯萊霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、 氯霉素(chloramphenicol)等抗生素抗性基因，但并不僅限于這些。本發(fā)明中的重組載體中，啟動子可以為CaMV 35S、肌動蛋白、泛蛋白、pEUM、MAS或組蛋白啟動子等，但并不僅限于此。術(shù)語“啟動子”意味著結(jié)構(gòu)基因的DNA上游區(qū)域，為了開始轉(zhuǎn)錄，與RNA聚合酶結(jié)合的DNA分子?！爸参飭幼印笔侵冈谥参锛毎心軌蜷_始轉(zhuǎn)錄的啟動子?！敖M成型 (constitutive)啟動子”是在大部分環(huán)境條件及發(fā)育狀態(tài)或細胞分化條件下具有活性的啟動子。轉(zhuǎn)化體的選擇可根據(jù)各階段的各種組織而構(gòu)成，因此本發(fā)明中的啟動子可以優(yōu)選為組成型啟動子。并且組成型啟動子不限制選擇可能性。在本發(fā)明中的重組載體中，可使用通常的終止子，例如有一氧化氮合成酶 (NOS)、水稻α-淀粉酶RAmyl A終止子、菜豆堿基終止子(Phaseoline)、根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)的章魚堿基因的終止子等，但并不僅限于此。有關(guān)終止子的必要性，其領(lǐng)域為增加植物細胞中的轉(zhuǎn)錄的確定性及效率，這是一般所公知的。因此終止子的使用在本發(fā)明的內(nèi)容中是非常優(yōu)選的。并且，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化上述重組載體的宿主細胞。將本發(fā)明中的重組載體轉(zhuǎn)化到原核細胞內(nèi)，能夠連續(xù)無性繁殖及表達的宿主細胞可以使用業(yè)界公知的任意一種宿主細胞，例如有，如E. coli J1109、E. coli BL21、E. coli RR1、E. coli LE392、E. coli Β、Ε· coli X 1776, Ε. coli W3110、枯草芽胞桿菌、蘇云金桿菌等桿菌屬菌株；還有，如鼠傷寒沙門(氏) 菌、粘質(zhì)沙雷菌及多樣的假單胞菌屬等腸內(nèi)菌科菌株等。并且，將本發(fā)明中的載體轉(zhuǎn)化到真核細胞中的情況下，作為宿主細胞可以利用酵母((Saccharomyce cerevisiae)、昆蟲細胞、人細胞(例如，CHO細胞株(中華倉鼠卵巢 (Chinese hamster ovary))、W138、BHK、C0S_7、293、H印G2、3T3、RIN 及 MDCK 細胞株)及植物細胞等。宿主細胞優(yōu)選為植物細胞。將本發(fā)明中的載體向宿主細胞內(nèi)運輸?shù)姆椒?，當宿主細胞是原核細胞時，可采用 CaCl2 方法、哈納漢方法(Hanahan, D.，J. Mol. Biol.，166 :557-580(1983))及電穿孔方法等。并且宿主細胞為真核細胞時，可采用顯微注射法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體-介導(dǎo)的形質(zhì)感染法、DEAE-右旋糖苷處理法及基因槍法等方法將載體注入進宿主細胞內(nèi)。并且，本發(fā)明還提供含有本發(fā)明涉及的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的重組植物RNAi 載體。RNA干擾(RNA interfernce)是指將具有與靶基因mRNA相同的序列的正義RNA和與之對應(yīng)的具有互補序列的反義RNA構(gòu)成的雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA)注入到細胞中，進而誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解來抑制蛋白質(zhì)的表達的現(xiàn)象。利用RNAi的基因抑制方法不僅簡便，對基因表達的抑制效果也很優(yōu)秀，是最近非常受歡迎的方法。上述重組植物RNAi載體優(yōu)選為圖5中所記載的載體，但并不僅限于此。并且，本發(fā)明還提供利用含本發(fā)明涉及的番茄紅素環(huán)化酶基因的重組植物 RNAi載體對植物進行轉(zhuǎn)化，抑制植物中番茄紅素ε -環(huán)化酶的基因的表達，增加胡蘿卜素含量的方法。上述植物優(yōu)選為甘薯。植物的轉(zhuǎn)化表示將DNA轉(zhuǎn)移到植物中的任意的方法。這樣的轉(zhuǎn)化方法不一定必需要再生及(或)組織培養(yǎng)時間。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在不僅是針對雙子葉植物，而且對包括單子葉植物的植物種也都是普遍的。原則上，任意的轉(zhuǎn)化方法可利用于將有關(guān)本發(fā)明的雜種 DNA導(dǎo)入到適當?shù)某跏技毎小２捎玫姆椒蓮膶υ|(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens， F.A.et al. , 1982, Nature 296,72-74 ；Negrutiu I. et al. ,June 1987，Plant Mol. Biol. 8， 363-373)、原生質(zhì)體的電穿孔法(ShillitoR. D. et al.，1985 Bio/Technol. 3，1099-1102)、 作為植物要素的顯微注射法(Crossway A. et al.，1986，Mol. Gen. Genet. 202，179-185)、各種植物要素的(被編譯了 DNA或RNA)粒子沖擊法、由植物的浸潤或成熟的花粉或小孢子的轉(zhuǎn)化而來的以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(非完全性)， 由病毒引起的感染(EP0301316號)等方法中做適當?shù)倪x擇。關(guān)于本發(fā)明優(yōu)選的方法為包括以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)的DNA傳遞。特別優(yōu)選的方法為如EP A 120516號及美國專利第4，940，838 號所記載的利用所謂二元載體的技術(shù)。用于植物的轉(zhuǎn)化的“植物細胞”可采用任意一種植物細胞。植物細胞為培養(yǎng)細胞、 培養(yǎng)組織、培養(yǎng)器官或整個植物體?！爸参锝M織”可為分化的或未分化的植物組織，例如，包括根、莖、葉、花粉、種子、瘤組織及用于培養(yǎng)的多樣形態(tài)的細胞，即單一細胞，原生質(zhì)體(protoplast)、種子及愈傷組織，但并不限于此。植物組織可為植物體(in planta)或器官培養(yǎng)，組織培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)狀態(tài)。并且，本發(fā)明還提供用轉(zhuǎn)化含有本發(fā)明的番茄紅素環(huán)化酶基因的重組植物 RNAi載體的，β-胡蘿卜素含量增加的植物。上述植物優(yōu)選為甘薯。并且，本發(fā)明還提供由β -胡蘿卜素含量增加的植物得到的種子。下面，將對本發(fā)明進行詳細說明。本發(fā)明提供來源于甘薯的番茄紅素環(huán)化酶的cDNA片段。本發(fā)明中的番茄紅素ε_環(huán)化酶基因片段長度為439bp，編碼146個氨基酸(圖1)。將基因在數(shù)據(jù)庫中進行 Blast比對，結(jié)果表明1其與各個植物中的番茄紅素環(huán)化酶高度相同(圖幻。并且，用 Blast(BlastX)對本發(fā)明中的β -胡蘿卜素羥化酶的編碼片段的氨基酸序列進行比對時， 與牽?；ǖ膒utative基因有97%的最高同源性，除此之外，對胡蘿卜(Daucus carota)、大麥(Hordeum vulgare)、7jC禾S (Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、香蕉(Musa acuminate)等也有80%以上的很高的同源性(圖3)。本發(fā)明所涉及的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因確認為對植物體的葉子具有特異性的表達。(圖4)構(gòu)建了旨在抑制本發(fā)明中番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達的RNAi載體。(圖5)從轉(zhuǎn)化本發(fā)明所涉及的旨在抑制番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達的RNAi載體的愈傷組織中提取出基因組DNA并進行了 PCR分析。在番茄紅素ε-環(huán)化酶基因RNAi轉(zhuǎn)化體中，從11、12、13、17、18、19、28、四愈傷細胞中確認了 PCR產(chǎn)物。(圖6)
將本發(fā)明中的番茄紅素ε-環(huán)化酶RNAi轉(zhuǎn)化愈傷細胞與對照栗米(地瓜品種名稱)的愈傷組織進行比較的結(jié)果為，確認出轉(zhuǎn)化的愈傷組織因生產(chǎn)胡蘿卜素顯示為深黃色的表現(xiàn)形態(tài)(圖7)。并且，由于在本發(fā)明中導(dǎo)入克隆的番茄紅素環(huán)化酶基因的 RNAi載體，使β -胡蘿卜素的生物合成(biosynthesis)增加，因此確認為愈傷細胞呈黃色。將本發(fā)明中的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的轉(zhuǎn)化愈傷組織作為對象通過RT-PCR實際確認了番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達是否被抑制。轉(zhuǎn)化愈傷組織11，12，17，確認與對照的栗米愈傷組織相比，基因的轉(zhuǎn)化被顯著地抑制，轉(zhuǎn)化愈傷組織13基因的表達減少了一半以下(圖8)。將本發(fā)明中的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的轉(zhuǎn)化愈傷組織為對象，對表現(xiàn)出低分子抗氧化活性的DPPH自由基消除活性進行調(diào)查的結(jié)果為，確認了比對照栗米的活性要高出 2 4倍以上，可知相當于胡蘿卜素含量很高的新黃美品種的活性水準。并且，確認了本發(fā)明中胡蘿卜素含量增加的轉(zhuǎn)化體實際上其低分子抗氧化活性也一起增加了(圖 9)。對本發(fā)明中的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的轉(zhuǎn)化愈傷組織分別用150mM和200mM的 NaCl進行處理后，通過DAB染色測定了細胞內(nèi)氧化程度。結(jié)果為對照的栗米愈傷細胞內(nèi)的由活性氧的增加引起的DAB褐變的多于轉(zhuǎn)化愈傷組織(圖10A)。具體地說，對氧化的DAB 的量進行測定的結(jié)果，總體上，200mM的NaCl的處理中由細胞內(nèi)氧化壓力引起的DAB的氧化程度要高于150mM的NaCl處理。并且，對氧化的DAB的量進行測定的結(jié)果，可確認出，與對照相比，由減少1/2變成減小為1/5以上(圖10B)。并且抑制番茄紅素ε -環(huán)化酶基因表達的轉(zhuǎn)化愈傷組織，隨著胡蘿卜素的含量增加其抗氧化活性也隨之增加，可確認細胞內(nèi)去除活性氧的能力也增強了。并且，本發(fā)明中，通過調(diào)節(jié)基因的表達，提高胡蘿卜素含量，不僅提高了機能性，也可以有效應(yīng)用于開發(fā)具有高耐受性的植物體。下面，通過實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。下述實施例只是對本發(fā)明的例示，本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于下列實施例。實施例1甘薯番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的克隆，堿基序列分析及親緣關(guān)系分析利用QIAGEN 公司的 RNeasy Mini Kit，從甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam)新黃美品種的植物體葉子中分離出了總RNA。利用hvitrogen的RT-PCR用SuperScript III 第一鏈-Strand SynthesisSystem合成了第一鏈cDNA。為分離番茄紅素ε-環(huán)化酶基因， ^t TIGR Plant Transcript Assemblies 白勺 _立占巾(http://plantta.tigr. org/) (Lycopersicon esculentum)的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因進行了 Blast比對。結(jié)果為，從與甘薯接近的牽牛花(Ipomoea nil)的EST克隆(clone)中，找到了與番茄紅素ε -環(huán)化酶基因具有相似的堿基序列的克隆，并將這些基因作為從甘薯中克隆的PCR引物。為了利用^witrogen的gateway表達系統(tǒng)，在引物的堿基序列5’末端各追加了銜接(adapter)序列(用大寫表示)。堿基序列為番茄紅素環(huán)化酶正向引物 (5' -CAAAAAAGCAGGCTNNgaacaaactaatgttaagactggagaca-3' ；SEQ ID No. 3)和反向引物 (5' -CAAGAAAGCTGGGTN gatagagttgatcccagaaatcct-3‘ ； SEQ ID No. 4) 利用Clonetech公司的advantage〗聚合酶進行了 PCR，并利用pGEMeasy克隆載體 (promega)將具有目的片段大小的PCR產(chǎn)物克隆后進行測序(sequencing)，進而確認了堿基序列。番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的cDNA片段長度為439bp，編碼146個氨基酸(圖1)。 將基因在數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，表現(xiàn)出了與各個植物中的番茄紅素環(huán)化酶高度同源(圖2)。并且，對本發(fā)明中的番茄紅素ε -環(huán)化酶的編碼片段通過BlastX和ClustalW程序(http://align, genome, jp/)，對氨基酸序列進行分析后，結(jié)果為，與牽?；ǖ膒utative 基因有97%最高的同源性，與胡蘿卜(Daucus carota)，、大麥(Hordeum vulgare)、水稻 (Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、香蕉(Musa acuminate)等也有80%以上的很高的同源性(圖3)。實施例2按組織分類分析甘薯番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的表達為了分析本發(fā)明中的甘薯番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的按組織區(qū)別的表達模式，進行了 RT-PCR。利用QIAGEN 公司的 RNeasy Mini Kit,分離了總 RNA，利用 hvitrogen 公司的 RT-PCR 用 Superscript III 第一鏈-Strand SynthesisSystem 合成了第一鏈 cDNA。引物的堿基序列為番茄紅素ε -環(huán)化酶正方向引物(5 ‘ -CAAAAAAGCAGGCTNNgaa caaactaatgttaagactggagaca-3 ‘ ；SEQ ID No. 5)和反向引物(5 ‘ -CAAGAAAGCTGGGTN gatagagttgatcccagaaatcct-3 ‘ ；SEQ IDNo. 6)。結(jié)果為，本發(fā)明所涉及的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因確認為在植物體的葉子中具有特異性的表達(圖4)。實施例3甘薯番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化體的獲得構(gòu)建了旨在抑制本發(fā)明中的番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達的RNAi載體(圖 5)。先將克隆的有番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的PGEMeasy載體進行BP反應(yīng)，將基因克隆到 PD0NR207載體上。之后通過pD0NR207和作為RNAi載體的pH7GWIWG2 (I)的LR反應(yīng)構(gòu)建了克隆的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因的RNAi載體。將RNAi載體以農(nóng)桿菌(Agrobacterium) 為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘薯品種栗米(Ym)的愈傷組織，選取了抗生素。用htronBIOtechnology公司的G-spin IIp基因組DNA提取試劑盒(植物用)，將轉(zhuǎn)化的愈傷組織作為對象提取出基因組DNA后，用基因特異引物進行了 PCR分析。在番茄紅素ε-環(huán)化酶RNAi轉(zhuǎn)化體中，從 11、12、13、17、18、19、觀、29的轉(zhuǎn)化愈傷組織中確認了 PCR產(chǎn)物(圖6)。并且已確認轉(zhuǎn)化的愈傷組織中已被導(dǎo)入番茄紅素ε -環(huán)化酶RNAi載體。實施例4由番茄紅素ε -環(huán)化酶基因抑制表達引起的β -胡蘿卜素含量增加為了確認本發(fā)明中的胡蘿卜素羥化酶基因的表達受到抑制，是否實際上引起了 β-胡蘿卜素含量的增加。在表現(xiàn)型方面，與作為對照的愈傷組織的栗米進行了比較，結(jié)果為，通過基因組DNA PCR確認的轉(zhuǎn)化愈傷細胞的顏色呈現(xiàn)深黃色(圖7)。此外，為確認番茄紅素ε -環(huán)化酶基因是否得到了實際抑制，用上述實施例1的方法從轉(zhuǎn)化的愈傷組織中提取出RNA，進行了 RT-PCR。結(jié)果為，轉(zhuǎn)化愈傷組織11、12、17與對照栗米愈傷組織相比，基因的表達顯著地被抑制，轉(zhuǎn)化愈傷組織13的基因的表達減小到一半以下(圖8)。因此，可以確認由于本發(fā)明中的番茄紅素ε-環(huán)化酶RNAi載體的導(dǎo)入使番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達受到抑制。實施例5由轉(zhuǎn)化愈傷組織的β -胡蘿卜素含量增加引起的抗氧化活性增加
以本發(fā)明中的番茄紅素ε -環(huán)化酶基因轉(zhuǎn)化愈傷組織為對象，對表現(xiàn)出低分子抗氧化活性的DPPH自由基消除活性進行了研究。著眼于β-胡蘿卜素的抗氧化活性高這一特點，為了確認轉(zhuǎn)化愈傷組織是否實際上由胡蘿卜素含量增加引起了抗氧化活性的提高，以栗米愈傷組織和轉(zhuǎn)化愈傷組織作為對象，測定了 DPPH自由基消除活性，對低分子抗氧化活性進行了分析，分別進行150mM和200mM的NaCl處理后，做了抗氧化活性比較。將栗米和轉(zhuǎn)化愈傷組織用100%甲醇提取后，在IOmM的DPPH溶液中反應(yīng)30分鐘后，計算剩余的DPPH量，測定了低分子抗氧化活性，活性表現(xiàn)為與抗壞血酸具有相應(yīng)的值。 其結(jié)果為，比對照的栗米活性高出2 4倍以上，可知達到了相似于β -胡蘿卜素含量很高的新黃美(Hm)品種的活性水準(圖9)。并且，可以確認本發(fā)明中胡蘿卜素含量增加的轉(zhuǎn)化體，實際上其低分子抗氧化活性也一同增加了。并且，以進行了 NaCl處理的愈傷組織作為對象，與活性氧進行反應(yīng)而被氧化后， 再用褐變的DAB進行染色，對表型進行了比較。結(jié)果為，對照的栗米愈傷組織內(nèi)的由活性氧的增加引起的DAB的褐變的多于轉(zhuǎn)化愈傷組織中(圖10Α)。具體地，對氧化的DAB的量進行測定的結(jié)果，總體上，200mM的NaCl的處理中由細胞內(nèi)氧化壓力引起的DAB的氧化程度要高于在150mM的NaCl處理中的DAB的氧化度。并且對氧化的DAB的量進行測定的結(jié)果為，與對照相比，可以確認由減少1/2變成減小為1/5以上(圖10B)。并且，抑制β-胡蘿卜素氧化酶基因表達的轉(zhuǎn)化愈傷組織，隨著胡蘿卜素含量的增加，抗氧化活性也增加， 并能夠確認細胞內(nèi)去除活性氧的能力也得到了增加。
權(quán)利要求
1.由SEQID No. 2所示的氨基酸序列構(gòu)成的甘薯(Ipomoeabatatas)番茄紅素ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1中所述的番茄紅素ε-環(huán)化酶蛋白質(zhì)的基因。
3.如權(quán)利要求2中所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQIDNo. 1所示的的堿基序列構(gòu)成。
4.含有權(quán)利要求2中所述的基因的重組載體。
5.轉(zhuǎn)化權(quán)利要求4中所述的重組載體的宿主細胞。
6.含有權(quán)利要求2中所述基因的重組植物RNAi載體。
7.轉(zhuǎn)化重組植物RNAi載體的，使植物中番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的表達受到抑制，增加胡蘿卜素含量的方法。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物為甘薯。
9.轉(zhuǎn)化權(quán)利要求6中所述的重組植物RNAi載體的，β-胡蘿卜素含量增加的植物體。
10.如權(quán)利要求9所述的植物體，其特征在于，所述植物體為甘薯。
11.權(quán)利要求9中所述的植物體的種子。
全文摘要
本發(fā)明提供來源于甘薯的番茄紅素ε-環(huán)化酶(lycopeneε-cyclase)蛋白質(zhì)，編碼上述蛋白質(zhì)的基因，包括上述基因的重組載體，轉(zhuǎn)化上述重組載體的宿主細胞，含有上述基因的重組植物RNAi載體，并且提供轉(zhuǎn)化上述重組植物RNAi載體來增加植物β-胡蘿卜素含量的方法，還提供轉(zhuǎn)化上述重組植物RNAi載體的，β-胡蘿卜素含量增加的植物體及其種子。
文檔編號C12N15/82GK102191230SQ201010548018
公開日2011年9月21日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者安榮玉, 李幸順, 鄭在哲, 郭尙洙, 金善荷 申請人:韓國生命工學(xué)研究院