專利名稱：與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量及果肉顏色性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β胡蘿卜素是類胡蘿卜素家族中的典型代表，是人體健康不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素之一。在絕大部分黃瓜品種中，果實(shí)中的β胡蘿卜素含量非常低，但在適應(yīng)西雙版納地區(qū)種植的黃瓜品種中，果實(shí)β胡蘿卜素的含量非常高，果肉顏色呈橙黃色。果實(shí)顏色與β胡蘿
卜素的含量呈正相關(guān)，β胡蘿卜素含量高，則果肉顏色深。為了提高黃瓜果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，育種家們一直在努力嘗試將西雙版納黃瓜品種高β胡蘿卜素含量這一特性轉(zhuǎn)入其它黃瓜品種中。傳統(tǒng)的遺傳研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)顏色是由一個(gè)隱形ore基因控制的(Cuevas等)。在黃瓜全基因組和高分辨率SSR遺傳圖譜陸續(xù)公布之后，研究人員將ore基因定位在3號(hào)染色體的SSR20710-SSR11633之間(Bo等)。然而由于尚未找到控制果肉顏色的ore基因，因此有關(guān)β胡蘿卜素如何在西雙版納黃瓜果實(shí)中大量積累等分子機(jī)制還不清楚，導(dǎo)致相關(guān)的分子育種工作進(jìn)展緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量及果肉顏色性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種黃瓜Csa3G183920蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示 ，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供編碼所述Csa3G183920蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明還提供含有編碼所述Csa3G183920蛋白的基因的載體。本發(fā)明還提供含有編碼所述Csa3G183920蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明還提供含有編碼所述Csa3G183920蛋白的基因的工程菌。本發(fā)明還提供含有編碼所述Csa3G183920蛋白的基因的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。本發(fā)明還提供編碼所述Csa3G183920蛋白的基因在下調(diào)黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量中的應(yīng)用。 本發(fā)明還提供編碼所述Csa3G183920蛋白的基因在調(diào)控黃瓜果肉顏色性狀中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記，其位于黃瓜Csa3G183920基因序列第770bp處，此處堿基為A的黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量高，果肉顏色呈橙黃色；此處堿基為C的黃瓜β胡蘿卜素含量低，果肉顏色為白色；所述黃瓜Csa3G183920基因序列如SEQ ID N0.2所示。
本發(fā)明還提供用于檢測(cè)上述述與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對(duì)，包括正向引物 F5’ -GGCTTGTTCCTGGACTCTGCTTTGG-3’和反向引物 R5’ -AAGAAAAGTTTACCTGGTGAGCAGC-3，。本發(fā)明還提供上述與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定黃瓜品種中的應(yīng)用，其包括步驟:I)提取待測(cè)黃瓜的基因組DNA ;2)以待測(cè)黃瓜的基因組DNA為模板，利用上述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列第338bp處堿基為A，則待測(cè)黃瓜屬于富含β胡蘿卜素的黃瓜品種，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列第338bp處堿基為C (SEQ ID N0.3)，則待測(cè)黃瓜屬于果實(shí)中β胡蘿卜素含量低的黃瓜品種。本發(fā)明還提供含有上述引物F和R的用于檢測(cè)黃瓜品種的試劑盒。優(yōu)選所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。更優(yōu)選所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。本發(fā)明提供了一種與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量及果肉顏色性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，即根據(jù)基因型進(jìn)行富含β胡蘿卜素黃瓜品種的選育，從而加快黃瓜育種進(jìn)程。首先對(duì)114份黃瓜核心種質(zhì)資源進(jìn)行重測(cè)序分析。該114份黃瓜根據(jù)各自基因組的特點(diǎn)可以分為4個(gè)群體:印度、西雙版納、東亞、歐美型(Lv等)。其中印度群體是野生型黃瓜，其它3個(gè)群體均從印度黃瓜進(jìn)化而來(lái)(圖1)。為了適應(yīng)當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境以及受到人文因素影響，不同群體的黃瓜以各自不同的方式進(jìn)化。其中西雙版納黃瓜果實(shí)中β胡蘿卜素含量非常高，果肉呈現(xiàn)橙紅色。為了尋找控制黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量及果肉顏色性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，首先利用生物信息學(xué)分析，尋找西雙版納群體與其它3個(gè)群體中存在的異義突變。通過(guò)這種方法，一共發(fā)現(xiàn)有49個(gè)SNP符合篩選標(biāo)準(zhǔn)。而其中一個(gè)SNP就位于之前定位的ore基因范圍內(nèi)(圖2)。該SNP導(dǎo)致Csa3G183920蛋白257位的氨基酸發(fā)生改變。在西雙版納群體中，該位點(diǎn)為天冬氨酸，而在其它3個(gè)群體中則均為丙氨酸。因此Csa3G183920基因極有可能是之前要找的ore基因。進(jìn)一步`利用生化實(shí)驗(yàn)，證明了 Csa3G183920蛋白是β胡蘿卜素羥化酶，能夠通過(guò)降解β胡蘿卜素生成玉米黃質(zhì)導(dǎo)致果肉顏色發(fā)生改變(圖
3)。此外，在西雙版納群體中，果實(shí)成熟時(shí)Csa3G183920基因的表達(dá)量幾乎沒(méi)有變化。而在其它3個(gè)群體中，果實(shí)成熟時(shí)Csa3G183920基因表達(dá)量迅速上升，加快了 β胡蘿卜素的降解過(guò)程，最終導(dǎo)致果實(shí)中β胡蘿卜素含量下降，果肉顏色變淺。圖4為本發(fā)明利用qPCR檢測(cè)黃瓜果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期Csa3G183920基因的表達(dá)情況?？梢钥闯觯诠麑?shí)發(fā)育后期，Csa3G183920基因在西雙版納群體中表達(dá)變化不大，果肉呈橙黃色；而在東亞群體中迅速增加，最終導(dǎo)致黃瓜果實(shí)無(wú)β胡蘿卜素積累，呈白色。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，闡明了 β胡蘿卜素在西雙版納黃瓜中大量積累導(dǎo)致果實(shí)顏色呈現(xiàn)橙紅色的分子機(jī)制。同時(shí)開(kāi)發(fā)出與β胡蘿
卜素含量及果肉顏色共分離的SNP標(biāo)記，可用于后期分子育種。本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的鑒定黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量以及果實(shí)顏色的方法。在黃瓜果實(shí)未成熟前，即可根據(jù)基因型進(jìn)行判斷，完全排除人為因素的影響，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠?？捎糜诖笠?guī)模篩選育種材料，大大加快高營(yíng)養(yǎng)黃瓜的育種進(jìn)程。本發(fā)明首次克隆了控制黃瓜果實(shí)顏色性狀相關(guān)的ore基因，闡明了黃瓜果實(shí)中β胡蘿卜素含量積累及果實(shí)顏色改變的分子機(jī)制。而以往的研究?jī)H確定了 ore基因在染色體上的位置，并不清楚基因的序列及功能。本發(fā)明還開(kāi)發(fā)了與β胡蘿卜素含量及黃瓜果肉顏色性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記。與之前開(kāi)發(fā)的與果肉顏色性狀相關(guān)的SSR標(biāo)記(Bo等)相比，SNP標(biāo)記的遺傳穩(wěn)定性比SSR等遺傳標(biāo)記高得多，在進(jìn)行遺傳分析或基因診斷時(shí)的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性都優(yōu)于SSR，適于更準(zhǔn)確、更加快捷的用于后期分子輔助育種工作中。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用生物信息學(xué)方法分析黃瓜核心種質(zhì)資源重測(cè)序的數(shù)據(jù)結(jié)果。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的西雙版納群體與其它3個(gè)群體完全不同的異義突變?cè)邳S瓜染色體上的分布情況(菱形點(diǎn))，其中一個(gè)SNP就位于之前定位的ore基因范圍內(nèi)。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中利用HPLC檢測(cè)含有野生和突變的Csa3G183920基因大腸桿菌工程菌中的化學(xué)成分。Csa3G183920蛋白催化菌內(nèi)β胡蘿卜素降解生成玉米黃質(zhì)。而突變后β胡蘿卜素不能夠被降解，菌體內(nèi)無(wú)玉米黃質(zhì)或隱黃質(zhì)生成。正對(duì)照樣品為表達(dá)擬南芥中的β胡蘿卜素羥化酶，它催化β胡蘿卜素降解生成隱黃質(zhì)。圖4為本發(fā)明利用qPCR檢測(cè)果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期Csa3G183920基因的表達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。實(shí)施例1與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量及果肉顏色性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的獲得從世界各地采集了 3000多份黃瓜資源，從其中挑選114份作為黃瓜核心種質(zhì)資源，它們代表了 80%的遺傳多樣性(Lv等)。對(duì)每份資源進(jìn)行重測(cè)序，產(chǎn)生5G左右的數(shù)據(jù)量，平均覆蓋IOx的黃瓜基因組。根據(jù)計(jì)算出的Fst值的大小，可以將世界上的黃瓜資源分為3個(gè)栽培群體和I個(gè)野生群體(圖1)。為了適應(yīng)當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境以及受到人文因素影響，這3個(gè)栽培群體發(fā)生了各自獨(dú)立的進(jìn)化。其中，西雙版納群體中果實(shí)β胡蘿卜素含量很高，果肉顏色呈現(xiàn)橙紅色，其它群體均沒(méi)有這種特點(diǎn)。因此利用生物信息學(xué)，設(shè)定Fst=I，進(jìn)一步尋找西雙版納群體與其它3個(gè)群體之間不同的異義突變。通過(guò)這種方法，共發(fā)現(xiàn)有49個(gè)SNP符合篩選標(biāo)準(zhǔn)。Bo等利用SSR標(biāo)記，通過(guò)圖位克隆的方法把控制果肉顏色的基因定位在3號(hào)染色體的SSR20710-SSR11633之間。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的49個(gè)SNP中有一個(gè)SNP位于該區(qū)間(圖2)，因此，該SNP與果肉顏色性狀共分離。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該SNP位于Csa3G183920基因外顯子上，導(dǎo)致Csa3G183920蛋白257位的氨基酸發(fā)生改變。在19份西雙版納群體中，重測(cè)序結(jié)果顯示在Csa3G183920基因第770bp處堿基均為A，相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸為天冬氨酸，而在其它3個(gè)群體，對(duì)95份黃瓜材料重測(cè)序結(jié)果顯示該位點(diǎn)為C，相應(yīng)地，氨基酸變?yōu)楸彼?，因此推測(cè)Csa3G183920基因極有可能就是之前尋找的ore基因。實(shí)施例2黃瓜Csa3G183920基因的獲得利用引物5 ’ -GCCTCTCCGCCGCCACTCTC-3 ’和 5 ’ -TCAAGAACCATCTATTGATTTTCGAGCCGT-3’，分別從西雙版納和東亞黃瓜果實(shí)cDNA中擴(kuò)增出突變的和野生型Csa3G183920基因，連接到T載體(TAKARA)上，測(cè)序保證無(wú)突變。
黃瓜Csa3G183920基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。實(shí)施例3利用生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Csa3G183920基因的功能利用引物5 ’ -CGGGATCCATGGCGGCCGGCCTCTCCGCCGCCACTC-3 ’和 5 ’ -ACGCGTCGACTCAAGAACCATCTATTGATTTTCGAGCCGT-3’，將野生型和突變的Csa3G183920基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET32 (Novogen)上,測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)入工程改造后的大腸桿菌中(Schwartz等)。這種大腸桿菌可以表達(dá)β胡蘿卜素合成酶，使菌體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的β胡蘿卜素，菌體顏色呈橙黃色。誘導(dǎo)Csa3G183920基因在菌體內(nèi)表達(dá)，Csa3G183920蛋白具有β胡蘿卜素羥化酶的活性，則可以降解β胡蘿卜素，導(dǎo)致菌的顏色變淺。進(jìn)一步用HPLC檢測(cè)菌的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)有玉米黃質(zhì)產(chǎn)生，確定Csa3G183920可以降解β胡蘿卜素生成玉米黃質(zhì)，而突變的Csa3G183920則完全喪失催化功能(圖3)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所 做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.黃瓜Csa3G183920蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
4.含有權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.權(quán)利要求2所述基因在下調(diào)黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的基因在調(diào)控黃瓜果肉顏色性狀中的應(yīng)用。
7.一種與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于，其位于編碼黃瓜Csa3G183920蛋白的基因序列第770bp處，此處堿基為A的黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量高，果肉顏色呈橙黃色；此處堿基為C的黃瓜β胡蘿卜素含量低，果肉顏色為白色；所述編碼黃瓜Csa3G183920蛋白的基因序列如SEQ ID N0.2所示。
8.用于檢測(cè)權(quán)利要求7所述與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記的引物對(duì)，其特征在于，包括正向引物 F5’ -GGCTTGTTCCTGGACTCTGCTTTGG-3’ 和反向引物 R5’ -AAGAAAAGTTTACCTGGTGAGCAGC-3，。
9.權(quán)利要求7所述與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在鑒定富含β胡蘿卜素黃瓜品種中的應(yīng)用，其包括步驟: 1)提取待測(cè)黃瓜的基因組DNA； 2)以待測(cè)黃瓜的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求8所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列第338bp處堿基為A，則待測(cè)黃瓜屬于富含β胡蘿卜素的黃瓜品種，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列第338bp處堿基為C，則待測(cè)黃瓜屬于果實(shí)中β胡蘿卜素含量低的黃瓜品種。
10.權(quán)利要求7所述與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記在黃瓜分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量相關(guān)的SNP標(biāo)記及其應(yīng)用，其位于編碼黃瓜Csa3G183920蛋白的基因序列第770bp處，此處堿基為A的黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量高，果肉顏色呈橙黃色；此處堿基為C的黃瓜β胡蘿卜素含量低，果肉顏色為白色。本發(fā)明利用變異組學(xué)和群體遺傳學(xué)等方法篩選到與黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量及果肉顏色性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記，并通過(guò)生物化學(xué)方法闡明了Csa3G183920通過(guò)降解β胡蘿卜素調(diào)控果實(shí)顏色的分子機(jī)制。通過(guò)測(cè)序或dCAPS等方法檢測(cè)待測(cè)黃瓜的基因型，根據(jù)基因型即可判斷黃瓜果實(shí)β胡蘿卜素含量高低以及果肉顏色，從而加快高營(yíng)養(yǎng)黃瓜品種的培育進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103146659SQ20131004873
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者黃三文, 張忠華, 尚軼, 沈嫡 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所