專利名稱：一種融合蛋白tat-nanog及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白TAT-NAN0G及其編碼基因與應用。
背景技術：
0CT4與NANOG是參與胚胎干(ES)細胞多能性維持和自我更新的兩個核心轉錄因子。同時也在體外誘導成體細胞向誘導性多潛能干細胞(iPS cell)重編程過程中起著關鍵作用。在早期的iPS細胞誘導研究中，大都采用病毒轉染等基因修飾的方法，但此方法存在著很大安全隱患。在09年底有文獻報道，利用多精氨酸蛋白跨膜肽與誘導因子0CT4， S0X2，c-MYC，KLF4也可以成功的誘導出人類和小鼠的iPS細胞。但是目前關于單獨誘導因子在重編程中功能的研究很少。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白，命名為TAT-NAN0G。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括TAT跨膜肽以及結合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的細胞重編程相關因子；所述細胞重編程相關因子為NANOG轉錄因子、c-myc因子、klf4因子或S0X2因子； 所述NANOG轉錄因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示。上述TAT跨膜肽可以是如下1)或2)所述的多肽1)序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端和/或C末端加上1-10個任意氨基酸殘基且具有跨膜功能的由1)衍生的多肽；所述TAT跨膜肽2)優(yōu)選是如下a)或b)或c):a)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的 HA標簽；b)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標簽；c)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的 HA標簽并在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標簽。進一步，上述蛋白是如下I)或II)的蛋白質I)其氨基酸序列如序列表中序列8的第22-348位所示；II)其氨基酸序列如序列表中序列8所示。上述的蛋白的編碼基因屬于本發(fā)明的保護范圍。進一步講，上述基因是如下1)或2)1)其核苷酸序列如序列表中序列7的第64-1047位；2)其核苷酸序列如序列表中序列7所示。含有上述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
具體地講，上述重組表達載體可以是將上述的基因插入載體pET18a的多克隆位點得到的載體。上述的蛋白或上述的基因在制備如下(1)44)中任一所述產品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(1)促進細胞向誘導性多潛能干細胞轉變的產品；(2)促進細胞增殖的產品；(3)促進細胞中內源NANOG轉錄因子或0CT4轉錄因子表達量增強的產品；(4)促進細胞中細胞周期蛋白表達量增強的產品。上述0CT4轉錄因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示，所述0CT4轉錄因子的編碼基因如序列表中序列9所示。上述細胞周期蛋白優(yōu)選是CDC25A或CDK6。上述細胞均是成纖維細胞，優(yōu)選是HAF細胞。實施例5證明HAF細胞內源性的0CT4和NANOG的轉錄均可被外源加入的 TAT-0CT4和TAT-NAN0G融合蛋白所激活。實施例6證明融合蛋白TAT-NAN0G進入成纖維細胞后，可以在低血清培養(yǎng)條件下可以顯著的提高細胞的增殖速度，TAT-NAN0G組的細胞密度已達到14. 22X104cells/mm2，顯著高于空白對照組的9. MX104cells/mm2。實施例7證明 TAT-NAN0G處理后HAF細胞中⑶C25A的表達相對于TAT-0CT4組和對照組顯著上調，⑶K6 的表達也略有上調。TAT跨膜肽輸送核轉錄因子蛋白可作為一個細胞重編程的方法，將在 iPS細胞誘導和臨床上具有重要的應用前景。可見，我們制備的導肽融合蛋白TAT-0CT4和 TAT-NAN0G均可以激活成纖維細胞內源的0CT4與NANOG表達，這也反應了在iPS重編程過程中轉錄因子0CT4和NANOG的自我調控與相互調控。而且TAT-NAN0G可以在體外顯著的提高細胞的增殖速度，這樣為細胞的體外擴增及組織工程的臨床應用提供了一種更加可控， 更加安全的有效途徑。


圖1為目的蛋白結構示意圖，及其表達純化的SDS-PAGE電泳檢測與western blot 鑒定；A，融合蛋白結構示意圖；B，目的蛋白表達的SDS-PAGE電泳檢測1，Marker ；2，5， 空白對照的上清液和包涵體沉淀；3，6，TAT-0CT4表達菌株的上清液和包涵體沉淀；4，6， TAT-NAN0G表達菌株的上清液和包涵體沉淀；C，D，分別為TAT-NAN0G和TAT-0CT4的鎳柱純化及western blot鑒定。圖2為免疫熒光的方法對TAT融合蛋白的跨膜效率檢測。圖3為TAT-0CT4和TAT-NAN0G細胞內轉錄活性檢測。圖4為空白對照組，TAT-NAN0G組，TAT-0CT4組HAF細胞中0CT4的內源表達。圖5為空白對照組，TAT-NAN0G組，TAT-0CT4組HAF細胞中NANOG的內源表達。圖6為融合蛋白TAT-NAN0G進入成纖維細胞后提高細胞的增殖速度。圖7為TAT-NAN0G處理后HAF細胞中CDC25A的表達相對于TAT-0CT4組和對照組顯著上調，而⑶K6的表達略有上調。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、TAT跨膜肽核轉錄因子構建利用TRIZOL試劑盒(購自hvitrogen公司)提取PA-1細胞(購自ATCC) 的總RNA，用Dnase 1(購自Invitrogen)消化后，用反轉錄酶Super Transcript III (Invitrogen)將上述PA-I細胞的總RNA反轉錄為cDNA，以該cDNA為模板，分別設計 0CT4 的上游引物 5，-GCGGAGCTCATGGCGGGACACCTGG-3，和下游引物 5，-ATAGCGGCCGCTTAT CAGTTTGAATGCA-3，，NANOG 的上游引物 5，-GAGCTCATGAGTGTGGATCCAGCTT-3，和下游引物 5，-GCGGCCGCTCACACGTCTTCAGGTT-3，，用Platinum Pfx DNA 聚合酶(購自 hvitrogen 公司)進行PCR反應?；厥丈鲜鯬CR反應產物，進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果分別獲得1090bp 的0CT4擴增產物和918bp的NANOG擴增產物，回收該條帶連入pMD18_T克隆載體中并進行序列測定。測序結果表明，獲得條帶與0CT4 GenBank Accession Number :NM_002701. 4和 NANOG GenBank Accession Number :NM_024865. 2 的序列一致。也即所述的 918bp 的 NANOG 擴增產物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，可編碼序列表中序列6所示的蛋白。然后我們又通過搭橋PCR的方法將跨膜肽TAT與標簽HA分別構建在轉錄因子 0CT4和NANOG的5’末端?？缒る腡AT的編碼基因如序列表中序列1所示，可編碼序列表中序列2所示的蛋白。標簽HA的編碼基因如序列表中序列3所示，可編碼序列表中序列4所示的蛋白。具體方法如下第一輪PCR反應分別用0CT4內部上游引物5’ CGCCGC TATCCGTATGATGTGCCGGATGTGGCGGAGCTCATGGCGGGACACCTGG 3，，和 0CT4 下游引物 5，ataGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA 3，以上述所得正確的0CT4序列為模板得到擴增產物 1，然后再以擴增產物1為模板分別用0CT4外部上游引物5，ataCATATGTATGGCCGCAAAAAACG CCGCCAGCGCCGCCGCTATCCGTATG3，與 0CT4 下游引物 5，ataGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA 3， 進行第二輪PCR擴增反應得到TAT-HA-0CT4的DNA序列。我們用同樣的方法得到了 TAT-HA-NAN0G的DNA序列，接著我們利用設計在引物上的NdeI (5，端)與NotI (3，端)酶切位點使用這兩種限制性內切酶(Takara公司)進行雙酶切反應，然后連入原核表達載體pET28a中，然后進行測序鑒定，結果顯示序列正確，將這兩種表達載體分別命名為PET-TAT-0CT4，PET-TAT-NAN0G。融合蛋白的結構示意圖如圖1所示。經(jīng)測序驗證表達載體PET-TAT-NAN0G是將序列表中序列7的自5，端第64-1047位所示的DNA片段插入到pET28a中構建而成的，其中，序列表中序列7的自5’端第64-1047位所示的DNA片段可編碼序列表中序列8的第22-348位所示的蛋白。實施例2、TAT跨膜肽核轉錄因子的表達純化將表達載體PET-TAT-0CT4，PET-TAT-NAN0G和對照空載體pET28a轉入大腸桿菌E. coli的BL21 Rostta-Gami (購自hvitrogen公司)菌株中，在37 °C的條件下用 ImMIPTG(購自Sigma公司)誘導表達5小時后，離心收集菌體，進行超聲破碎，通過鎳柱(購自GE公司)利用HIS標簽對目的蛋白進行了純化，最后分別用0CT4的抗體(購自Santa Cruze公司)和NANOG的抗體對目的蛋白進行了 western blot鑒定。表達純化及鑒定的結果如圖1所示。其中表達載體PET-TAT-NAN0G表達出的融合蛋白(TAT-NAN0G)的氨基酸序列如序列表中序列8所示。序列表中序列8的第1-21位是pET28a載體上自帶的基因所編碼的包括His標簽在內的蛋白。實施例3、TAT跨膜肽核轉錄因子的細胞轉染檢測分別將終濃度為0. 2M的TAT-NAN0G和TAT-0CT4加入到HAF細胞的培養(yǎng)基中，2小時后我們通過免疫熒光的方法用HA的抗體(購自Sigma公司)對TAT融合蛋白的跨膜效率進行了檢測。結果表明TAT融合蛋白已穿過細胞膜進入胞質中，并且已有部分蛋白定位在細胞核中(圖2)。實施例4、TAT跨膜肽核轉錄因子轉錄活性檢測對進入細胞核的轉錄因子TAT-0CT4和TAT-NAN0G，我們分別利用帶有0CT4和 NANOG特異結合序列的報告質粒進行了雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析，來對其轉錄活性進行了檢測。與陰性對照相比，TAT-0CT4和TAT-NAN0G組均有顯著上調(圖3)。 實施例5、內源性的0CT4和NANOG的轉錄活性檢測0CT4, NANOG和S0X2是調控ES細胞多能型維持以自我更新的核心因子，文獻報道它們可以通過自調控和互調控的方式來維持在細胞內的平衡。因此我們使用 STORGreen (購自Applied Biosystems公司)通過定量PCR方法來檢測用跨膜肽融合蛋白刺激后HAF細胞內源相關基因的表達變化。處理組與對照組的cDNA制備與實施例1中方法相同。檢測序列表中序列9所示的0CT4基因和序列表中序列5所示的NANOG基因的所用引物如表2所示。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，HAF細胞內源性的0CT4和NANOG的轉錄均可被外源加入的TAT-0CT4和TAT-NAN0G融合蛋白所激活(圖4，圖5)。表 權利要求
1.一種蛋白，包括TAT跨膜肽以及結合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的細胞重編程相關因子；所述細胞重編程相關因子為NANOG轉錄因子、c-myc因子、klf4因子或S0X2因子；所述NANOG轉錄因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
2.如權利要求1所述的蛋白，其特征在于所述TAT跨膜肽是如下1)或2)所述的多肽1)序列表中序列2所示的氨基酸殘基組成的多肽；2)序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端和/或C末端加上1-10個任意氨基酸殘基且具有跨膜功能的由1)衍生的多肽；所述TAT跨膜肽2、優(yōu)選是如下a)或b)或c)a)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA 標簽；b)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標簽；c)在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA 標簽并在序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列的N末端加上His標簽。
3.如權利要求1或2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是如下I)或II)的蛋白質I)其氨基酸序列如序列表中序列8的第22-348位所示；II)其氨基酸序列如序列表中序列8所示。
4.權利要求1-3中任一所述的蛋白的編碼基因。
5.如權利要求4所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)1)其核苷酸序列如序列表中序列7的第64-1047位；2)其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
6.含有權利要求4或5所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.如權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將權利要求4 或5所述的基因插入載體pET-28a的多克隆位點得到的載體。
8.權利要求1-3中任一所述的蛋白或權利要求4或5所述的基因在制備如下(1)-(4) 中任一所述產品中的應用(1)促進細胞向誘導性多潛能干細胞轉變的產品；(2)促進細胞增殖的產品；(3)促進細胞中內源NANOG轉錄因子或0CT4轉錄因子表達量增強的產品；(4)促進細胞中細胞周期蛋白表達量增強的產品。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述0CT4轉錄因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示，所述0CT4轉錄因子的編碼基因如序列表中序列9所示；所述細胞周期蛋白是 CDC25A 或 CDK6。
10.如權利要求8或9所述的應用，其特征在于所述細胞均是成纖維細胞，優(yōu)選是HAF 細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合蛋白TAT-NANOG及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括TAT跨膜肽以及結合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的細胞重編程相關因子。將本發(fā)明的融合蛋白TAT-NANOG處理HAF細胞后，促進了成纖維細胞增殖，促進成纖維細胞中細胞周期蛋白表達量增強。TAT跨膜肽輸送核轉錄因子蛋白可作為一個細胞重編程的方法，將在細胞誘導和臨床上具有重要的應用前景。
文檔編號C12N5/074GK102212141SQ20111008405
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權日2010年5月5日
發(fā)明者戴建武, 曹佳妮, 肖志峰, 陳冰 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所