專利名稱：高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌突變株bmb181的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)突變株的分離、黑色素鑒定及該突變株作為宿主菌的轉(zhuǎn)化性能和表達(dá)性能測(cè)定及應(yīng)用。本發(fā)明與微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域有關(guān)。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)是一類廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，它的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是能夠在芽胞期產(chǎn)生對(duì)昆蟲具有特異毒殺作用的晶體蛋白(Insecticidal crystal Proteins, ICPs),從而有別于分泌腸毒素的臘狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)和引起炭疽病的炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)。由于蘇云金芽胞桿菌對(duì)目標(biāo)生物具有特異、高效、對(duì)人畜無(wú)毒、不污染環(huán)境、不殺傷昆蟲天敵等優(yōu)點(diǎn)，并且 用農(nóng)副產(chǎn)品作原料易于工業(yè)化生產(chǎn)，目前蘇云金芽胞桿菌已經(jīng)成為世界上應(yīng)用最廣泛、最成功的生物殺蟲劑(喻子牛，孫明，陳亞華，等.蘇云金芽胞桿菌生物活性蛋白基因在動(dòng)、植物病蟲害防治中的應(yīng)用綜述.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1995，3 (2) :100-110)。黑色素由各種類型的酚類或吲哚單體組成，通常包含一些蛋白質(zhì)分子或者摻雜一些碳水化合物分子，在微生物、動(dòng)物、原生動(dòng)物以及植物中均可產(chǎn)生。不同生物黑色素之間單體的類型可能存在差異，一些生物物質(zhì)被劃分為黑色素很大程度上依賴于其物理或化學(xué)性質(zhì)(Nicolaus R A, Piatelli M and Fattorusso E. Thestructure of melanins andmelanogenesis-IV. On some natural melanins. Tetrahedron, 1964, 20 :1163-1172)。黑色素具有防止蛋白質(zhì)降解、光子屏蔽、化學(xué)保護(hù)等作用，特別是它對(duì)紫外線和輻射具有抵抗性。蘇云金芽胞桿菌能夠形成具有殺蟲活性伴胞晶體，作為廣泛應(yīng)用的生物殺蟲劑有其自身的缺陷。其一，殺蟲晶體蛋白在施用時(shí)易受到陽(yáng)光中紫外線的破壞，影響效果，黑色素成為解決晶體蛋白陽(yáng)光損害這一問(wèn)題的有效辦法；其二，B. thuringiensis可以形成多種晶體蛋白，但每一種都有其自身特定殺蟲范圍，人們期待按照需要構(gòu)建具有特定殺蟲活性的重組菌。因此，獲得既產(chǎn)黑色素又可按照需要表達(dá)各種晶體蛋白的菌株成為解決這一問(wèn)題的可行辦法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，分離篩選高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌突變株，并將該突變株作為宿主菌的轉(zhuǎn)化性能和表達(dá)性能進(jìn)行測(cè)定和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下申請(qǐng)人:按照高溫誘導(dǎo)產(chǎn)黑色素突變株操作流程，以蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株BMB171為出發(fā)菌株，獲得一株在28°C條件下高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌突變株，申請(qǐng)人將該菌株命名蘇云金芽胞桿菌庫(kù)斯塔克亞種(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)BMB181 (為了方便敘述，在本說(shuō)明書中將該菌株簡(jiǎn)稱為蘇云金芽胞桿菌BMB181)，蘇云金芽胞桿菌庫(kù)斯塔克亞種 BMB181 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki BMB181)于 2011年I月11日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為 CCTCC NO M2011016o本發(fā)明的突變株蘇云金芽胞桿菌BMB181具有下列明顯特征(I)本發(fā)明的突變株蘇云金芽胞桿菌BMB181能夠大量生產(chǎn)黑色素，該突變株最高產(chǎn)黑色素量比已經(jīng)報(bào)道的蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)黑色素量均高，而且在沒(méi)有額外添加底物酪氨酸的情況下仍然產(chǎn)生大量黑色素，并且這種性狀可穩(wěn)定遺傳。(2)本發(fā)明的突變株蘇云金芽胞桿菌BMB181能夠作為宿主菌，具有良好的轉(zhuǎn)化性能和表達(dá)性能。(3)本發(fā)明的突變株蘇云金芽胞桿菌BMB181所產(chǎn)黑色素具有保護(hù)晶體蛋白免受紫外線破壞作用。
本發(fā)明的蘇云金芽胞桿菌BMB181的菌學(xué)特征如下?tīng)I(yíng)養(yǎng)細(xì)胞粗短桿狀，兩端鈍圓，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，通常2 4個(gè)連在一起，大多數(shù)為兩連。個(gè)體大小為I. OX (2. 4 4. 4) u m，革蘭氏染色陽(yáng)性，芽胞呈圓柱狀或近似橢圓，偏端生，芽胞囊不膨大，在LB固體培養(yǎng)基上菌落邊緣不整齊，成粗布狀向外展開(kāi)，略呈放射狀；菌苔豐滿呈蠟質(zhì)狀，生長(zhǎng)溫度10_45°C，最適生長(zhǎng)溫度26-32°C，適宜pH6. 8-7. 4，兼性嫌氣，無(wú)伴胞晶體生成，產(chǎn)生可溶性黑色素。該菌株按照常規(guī)甘油管保藏方法(王婭等，幾種簡(jiǎn)易的菌種保存方法.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，41 (6) =451-452)保藏。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)實(shí)施例部分的描述。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明篩選的高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌突變株BMB181的csab基因(編碼多糖丙酮酸轉(zhuǎn)移酶)的部分序列。圖I :本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 :不同培養(yǎng)基上本發(fā)明的突變株蘇云金芽胞桿菌BMB181與出發(fā)菌株蘇云金芽胞桿菌BMB171產(chǎn)黑色素情況比較。圖中A :ICPM培養(yǎng)基，上部為出發(fā)菌株蘇云金芽胞桿菌BMB171，下部為本發(fā)明分離的蘇云金芽胞桿菌BMB181 ；B :LB培養(yǎng)基，上部為蘇云金芽胞桿菌BMB171，下部為本發(fā)明分離的蘇云金芽胞桿菌BMB181 ；C :LB+tyr0Sine培養(yǎng)基，上部為蘇云金芽胞桿菌BMB171，下部本發(fā)明分離的蘇云金芽胞桿菌BMB181 ；D :發(fā)酵培養(yǎng)基，左圖為蘇云金芽胞桿菌BMB171，右圖為本發(fā)明分離的蘇云金芽胞桿菌BMB181。圖3 :蘇云金芽胞桿菌BMB181黑色素紅外譜圖。圖4:黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5 LB中蘇云金芽胞桿菌BMB171與BMB181生長(zhǎng)及產(chǎn)黑色素曲線圖；圖中生長(zhǎng)曲線BMB171 ，BMB181 □;產(chǎn)黑曲線BMB171 ▲, BMB181X。圖6 :質(zhì)粒pHT304(6. 7kb)物理圖譜，該質(zhì)粒帶有紅霉素和氨芐青霉素抗性基因。圖7 :質(zhì)粒pBMB1251 (IOkb)物理圖譜，該質(zhì)粒帶有紅霉素、卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因，具有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)。圖8 :質(zhì)粒pBMB625(17kb)物理圖譜，該質(zhì)粒帶有紅霉素抗性基因，具有ori60復(fù)制起點(diǎn)。圖9 :質(zhì)粒pBMB292 (38kb)物理圖譜，該質(zhì)粒帶有紅霉素抗性基因，具有ori60復(fù)制起點(diǎn)。圖10 BMB32晶體光學(xué)顯微鏡圖。圖 11 BMB32 殺蟲晶體蛋白 SDS-PAGE 圖。圖中M，protein marker ; 1-3，小牛血清白蛋白;4-6，BMB32。圖12 :小牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方案以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例，詳細(xì)技術(shù)流程參照?qǐng)DI。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明只有說(shuō)明作用，而沒(méi)有限制作用。有關(guān)DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和所使用的藥品或試劑均參考J.薩姆布魯克等著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所描述的內(nèi)容 (參見(jiàn)J.薩姆布魯克等，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)。本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒(méi)有特別說(shuō)明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書、手冊(cè)等等加以實(shí)施。實(shí)施例I I、蘇云金芽胞桿菌高產(chǎn)黑色素突變菌株的分離篩選本發(fā)明以蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)無(wú)晶體突變株BMB171 (李林等，蘇云金芽胞桿菌無(wú)質(zhì)粒突變株BMB171的轉(zhuǎn)化和表達(dá)性能.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1999,5(4) =395-399)為出發(fā)菌株，通過(guò)高溫誘導(dǎo)，獲得一株在28°C條件下高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌突變株BMB181。具體方法以蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株BMB171為出發(fā)菌株接種LB液體培養(yǎng)基中(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 1(^，補(bǔ)充蒸餾水至10001^，調(diào)培養(yǎng)基的？11至7.0-7.2，在121°C下滅菌30min)，28°C培養(yǎng)轉(zhuǎn)接一次，至對(duì)數(shù)期0D_為I左右，按1% (v/v)轉(zhuǎn)接，42°C培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(0D_為I左右轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接多次。取一定量菌液用無(wú)菌水按10倍系列梯度稀釋，涂布于添加I % (w/v)的酪氨酸的LB平板，在28°C和42°C下分別篩選黑色素表型差異菌株。通過(guò)上述方法篩選得到的蘇云金芽胞桿菌突變株的候選株，在28°C培養(yǎng)能夠在多種培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色素，其結(jié)果見(jiàn)附圖2。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，本發(fā)明突變菌株的候選株在LB液體培養(yǎng)基中黑色素產(chǎn)量可達(dá)4. 81mg/mL。在ICPM培養(yǎng)基(ICPM培養(yǎng)基配方蛋白胨6g，葡萄糖 5g，CaCO3Ig, MgSO4 7H20 0. 5_lg，KH2PO4O. 5_lg，補(bǔ)充蒸餾水至 lOOOmL，調(diào) pH 至 7. 0，在115°C下高壓蒸汽下滅菌20min)上產(chǎn)量達(dá)到3. 91mg/mL ;在發(fā)酵培養(yǎng)基(黃豆餅粉22. 5g，玉米漿20g，淀粉15g，CaCO3L 5g ;加蒸餾水至IOOOmL,調(diào)培養(yǎng)基的pH至7. 0，在121°C下滅菌30min)中黑色素產(chǎn)量達(dá)到4.66mg/mL。在加入1% (w/v)酪氨酸LB培養(yǎng)基上產(chǎn)量高達(dá)8. 55mg/mL,比已經(jīng)報(bào)道的蘇云金芽胞桿菌黑色素產(chǎn)量均高，而且在沒(méi)有添加酪氨酸的情況下仍然產(chǎn)生大量黑色素，并且這種性狀可穩(wěn)定遺傳。2、蘇云金芽胞桿菌高產(chǎn)黑色素突變菌株的分子生物學(xué)方法鑒定為了驗(yàn)證BMB181為BMB171突變株，抽提這兩株菌(BMB181和BMB171的總DNA，利用PCR方法擴(kuò)增兩株菌的csab基因，其中BMB171的csab基因可通過(guò)登錄網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/296321890 report = gbwithparts&from =887269&to = 888357&RID = SYAff6H8T011獲得。csab基因編碼多糖丙酮酸轉(zhuǎn)移酶，可以用來(lái)作為蠟狀芽胞桿菌群中菌種分類。本發(fā)明的蘇云金芽胞桿菌BMB171和BMB181菌株驗(yàn)證所用引物序列如表I所示。表I本發(fā)明分離的BMB181菌株驗(yàn)證引物
引物編號(hào)引物序列.
P2-15 ’-TTGGAGGAGATTTAGGGTGC-3 ’ P2-35 ’ -ATC AAATGGC AC ATGC ATTGGA-3，蘇云金芽胞桿菌BMB171和BMB181總DNA的抽提方法分別挑取BMB171和BMB181的單菌落，分別接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中置于28°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)過(guò)夜；然后將50ii L的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至5mL的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)3_4小時(shí)；然后以12000rpm, 0. 5min 離心收集菌體，用 ImLSTE (0. lmol/L NaCl, 10mmol /T, Tris-HCl (pH 8. 0),lmmol/L EDTA (pH8. 0))洗滌一次，加 100 U L 溶液 I (lmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 0. 5mol/LEDTA (pH8)，50mmol/L葡萄糖)和IOy L溶菌酶(濃度50mg/mL)，在冰上靜置2_3小時(shí)或過(guò)夜；加入200 u L2%的十二烷基磺酸鈉(SDS)于55°C水浴30min ;加入100 u L5mol/L NaCl混勻，室溫或者冰上靜置5-10min，12000rpm離心5min取上清；再加入500 u L苯酚/氯仿/異戊醇(按體積比25 24 I),離心12000rpm，5min,吸取上清液，重復(fù)抽提1-2次；將上層DNA溶液轉(zhuǎn)移至I. 5ml離心管，加兩倍體積無(wú)水乙醇于_20°C靜置15min-2hrs后以12000rpm離心5min,沉淀用200 ii L70*% (v/v)乙醇洗漆一次后冷凍抽干,用20 y L RNase液中(20 u g/ml)溶解沉淀，該沉淀即為蘇云金芽胞桿菌BMB171和BMB181菌株的DNA。PCR 反應(yīng)體系為10Xbuffer 2iil，2mmol/L dNTP 0. 5 y 1，10 y mol/L 引物各
0.3 u I, pfu酶0. 2 u I,總DNA 0. 2ul,補(bǔ)加滅菌去離子水至20 y I。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)榈贗步94°C預(yù)變性5min ;第2步94°C變性0. 5min，第3步52°C復(fù)性0. 5min，第4步72°C延伸0. 5min ;第5步轉(zhuǎn)到第2步繼續(xù)運(yùn)行30個(gè)重復(fù)；第6步72°C 延伸 5min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切下需要的DNA片段所在的瓊脂糖塊，使用OMEGA公司DNA片段回收試劑盒回收DNA片段。將回收的PCR產(chǎn)物送至北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。通過(guò)測(cè)序獲得全長(zhǎng)664bp的序列，測(cè)序結(jié)果輸入NCBI，用Blastn程序交送GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示上述蘇云金芽胞桿菌BMB171和BMB181兩株菌csab基因同源性為100% (與登錄號(hào)CP001903報(bào)道的序列相比)，因此確定本發(fā)明制備的蘇云金芽胞桿菌BMB181為蘇云金芽胞桿菌BMB171的突變株。3、蘇云金芽胞桿菌高產(chǎn)黑色素突變菌株BMB181黑色素紅外鑒定

挑取本發(fā)明實(shí)施例的BMB181單菌落，接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。然后將500 u L的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50mL的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)36小時(shí)，12000rpm離心收集上清。上清液用濾紙過(guò)濾后，濾液用5mol/L HCI調(diào)培養(yǎng)基的pH至3. 0，3000rpm離心10分鐘收集沉淀黑色素，將沉淀重新溶入pH8. 0的蒸餾水中，重復(fù)此步驟3次。最后所得的沉淀于80°C干燥后研成粉末。將提純的黑色素粉末與溴化鉀在餅缽中充分混勻，然后取一部分混勻后的粉末用壓片機(jī)壓成薄片，進(jìn)行紅外光譜掃描。紅外光譜掃描是利用物質(zhì)分子對(duì)紅外光的吸收特征進(jìn)行分析鑒定的一種方法。黑色素是一個(gè)無(wú)定形物質(zhì)，基本結(jié)構(gòu)單元是由共價(jià)相連的吲哚表示。紅外光譜掃描在一定程度上可作為黑色素定性的一個(gè)指標(biāo)(Hoti S L, Balaraman K. Formation of melaninpigment by a mutant of Bacillus thuringiensis H-14. J GenMicrobiol. 1993,139 2365-9)，圖3是本發(fā)明制備的高產(chǎn)黑色素突變菌株BMB181所產(chǎn)色素紅外光譜掃描圖。從圖中可以看出，該色素在波數(shù)約340001^1處和165501^1都有吸收峰,這與Saxena等(SaxenaD 等，AUV tolerant mutant of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki ProducingMelanin. Curr Microbiol, 2002,44 :25-3)報(bào)道的蘇云金芽胞桿菌中的黑色素的吸收峰一致，所以把本實(shí)施例產(chǎn)生的色素鑒定為黑色素。4、蘇云金芽胞桿菌BMB181產(chǎn)黑色素的曲線將出發(fā)菌株BMB171和本發(fā)明篩選的BMB181菌株同時(shí)接種在LB培養(yǎng)基上，于28 °C 培養(yǎng)測(cè)定產(chǎn)黑色素曲線。具體方法是分別挑取BMB171和BMB181的單菌落，接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。然后按1% (v/v)接種量轉(zhuǎn)接至50mL的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)。利用721型紫外分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)物600nm吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)物離心后測(cè)定上清中黑色素OD4tltl的吸光值，根據(jù)黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黑色素的濃度，繪制黑色素產(chǎn)生曲線。黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定分別取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg黑色素加去離子水定容至lmL，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在400nm光波下吸光值，將黑色素濃度與OD■制作黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線中溶液的OD■值與黑色素的濃度呈線性關(guān)系，算出其斜率如圖4。通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)黑曲線見(jiàn)圖5，可以得到蘇云金芽胞桿菌BMB181同BMB171生長(zhǎng)情況一致，說(shuō)明產(chǎn)黑色素性狀對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有影響。從產(chǎn)黑色素趨曲線看出，在LB培養(yǎng)基上BMB181菌株黑色素的產(chǎn)生是從對(duì)數(shù)后期(0D_約為4.0)開(kāi)始的，進(jìn)入穩(wěn)定期后同出發(fā)菌株BMB171菌株產(chǎn)黑色素差距非常明顯，而BMB171中則檢測(cè)不到黑色素的產(chǎn)生。5、BMB181轉(zhuǎn)化效率的測(cè)定蘇云金芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化一般采用電轉(zhuǎn)化方法。其具體實(shí)施方法如下所述。蘇云金芽胞桿菌感受態(tài)制備挑取芽胞桿菌BMB181單菌落接種LB培養(yǎng)基過(guò)夜活化，按1% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至IOOmL新鮮的含2% (w/v)甘氨酸的LB培養(yǎng)液(28°C,220r/min)培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4，將培養(yǎng)液冰浴30min后，4°C離心(4000r/min, 5min)收集菌體，并用預(yù)冷的EP buffer (每500ml EP buffer中包含SG緩沖液500ml, 0. 1M/L憐酸鉀緩沖液 2. 5ml, 1M/L MgCl2250ul ;其中 0. 1M/L 磷酸鉀緩沖液配方(IOOmL) :1. 4gKH2P04，
0.52gK2HP04，121°C高壓蒸汽滅菌 30 分鐘；lM/LMgCl2 (100ml) :20. 33gMgCl2，121°C高壓蒸汽滅菌30分鐘；SG緩沖液配方272mM/L蔗糖，15%甘油，115°C高壓蒸汽滅菌20分鐘)洗滌菌體3-4次，最后I次重懸于適量預(yù)冷的SG緩沖液中，并以每管100 u L分裝至I. 5mL離心管。質(zhì)粒DNA的純化首先將等體積的5M/L LiCl溶液加入質(zhì)粒DNA，冰上放置10-20min,冷凍離心(12000r/min, 5min),棄沉淀吸取上清液加入2-2. 5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒，放置25min后冷凍離心,所得沉淀即為純化后的質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的脫鹽質(zhì)粒DNA純化后用1.0% (w/v)瓊脂糖/0. IM葡萄糖進(jìn)行脫鹽。具體操作步驟是0. IM葡萄糖/I. 0%瓊脂糖加熱溶解之后取出0. 75mL加入I. 5mL離心管中，然后在上面放置一個(gè)裝滿水的0. 5mL離心管,凝固之后將0. 5mL離心管取出，風(fēng)干幾分鐘后，將質(zhì)粒溶液加入孔中，在冰上靜置l_2h，然后將DNA溶液取出于_20°C保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化時(shí),在預(yù)冷的轉(zhuǎn)化杯(2mm, Bio-Rad產(chǎn)品)中,加入上述蘇云金芽胞桿菌感受態(tài)細(xì)胞100 u L，再加入I y g按上述方法純化的質(zhì)粒DNA，混勻后在冰上放置30min，用電脈沖儀進(jìn)行電脈沖。電擊條件為2. Okv/cm，電擊I次。電脈沖完畢后，加入預(yù)熱的0. 8mL LB培養(yǎng)液于電轉(zhuǎn)化杯中，轉(zhuǎn)移至PA瓶恢復(fù)培養(yǎng)2h后，涂布LB抗性平板(因轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的不同而涂布于不同抗生素抗性平板，具體方案見(jiàn)下文)皿涂100-200ii L，培養(yǎng)12h-16h，以挑取相應(yīng)抗性菌落(Peng D,rt al. Elaboratio of an electroporation protocolfor largerplasmids and wild-typ strains in Bacillus thuringiensis. J Appl Microbiol，2009，106(6) :1849-58)。 根據(jù)電轉(zhuǎn)化步驟,利用微量核酸蛋白測(cè)定儀(GeneQuuantlOO)測(cè)定質(zhì)粒的濃度后，取I U g不同大小的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化蘇云金芽胞桿菌BMB181，LB液體培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)2h后，將恢復(fù)培養(yǎng)產(chǎn)物用無(wú)菌水10倍梯度稀釋，涂布相應(yīng)抗性平板，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板生長(zhǎng)的菌落數(shù)，計(jì)算BMB181菌株的轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明采用不同大小的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化桿菌BMB181來(lái)驗(yàn)證蘇云金芽胞驗(yàn)證蘇云金芽胞桿菌BMB181的轉(zhuǎn)化效率。具體實(shí)施步驟如上文所述。轉(zhuǎn)化pHT304(6. 7kb)至蘇云金芽胞桿菌BMB181中時(shí)，選用含有紅霉素抗生素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子(紅霉素濃度25ii g/mL)。轉(zhuǎn)化pBMB1251 (IOkb)至蘇云金芽胞桿菌BMB181中時(shí)，選用含有紅霉素和卡那霉素抗生素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子(紅霉素濃度25 ii g/mL,卡那霉素濃度50 ii g/mL)。轉(zhuǎn)化pBMB292(17kb)至蘇云金芽胞桿菌BMB181中時(shí)，選用含有紅霉素抗生素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子(紅霉素濃度25ii g/mL)。轉(zhuǎn)化pBMB625 (38kb)至蘇云金芽胞桿菌BMB181中時(shí)，選用含有紅霉素抗生素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子(紅霉素濃度25 u g/mL)。結(jié)果如表I所示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用Excel 2003 For Windows軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(x+s)的形式顯示。表2本發(fā)明分離的BMB181菌株的轉(zhuǎn)化效率測(cè)定
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis),其特征在于該菌株是蘇云金芽胞桿菌庫(kù)斯塔克亞種BMB181，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為 CCTCCNO M2011016o
2.權(quán)利要求I所述菌株在制備殺蟲微生物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于包含制備蘇云金芽胞桿菌菌劑的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述菌株作為宿主菌的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。公開(kāi)了一株高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)突變株BMB181。本發(fā)明以蘇云金芽胞桿菌無(wú)晶體突變株BMB171為出發(fā)菌進(jìn)行高溫誘導(dǎo)，獲得一株在28℃條件下高產(chǎn)黑色素的蘇云金芽胞桿菌突變株BMB181(保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM2011016)，該菌能夠作為宿主菌，具有良好的轉(zhuǎn)化性能和表達(dá)性能，對(duì)紫外具有明顯抗性作用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102732438SQ20111008319
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者劉風(fēng)俠, 孫明, 彭東海, 楊文君, 阮麗芳 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)