專利名稱：一種玉米赤霉烯酮毒素降解酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種玉米赤霉烯酮降解酶及其編碼基因，以及玉米赤霉烯酮降解酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，^N)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種雌激素類真菌毒素。 1999年，D. Mello等人研究發(fā)現(xiàn)，ZEN能降低懷孕動物的胚胎成活率及新生胎兒的出生重。ZEN對人體的影響主要是引發(fā)腫瘤、誘導(dǎo)DNA收縮、導(dǎo)致染色體失常等，此外，ZEN可與 17 β -雌二醇受體結(jié)合，導(dǎo)致脂肪氧化反應(yīng)、細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA合成的抑制，還可抑制其它大分子的生物合成。國內(nèi)外大量文獻(xiàn)表明ZEN對動物、人類都會產(chǎn)生毒害，人們食用被其污染的食物會導(dǎo)致肝癌、睪丸癌、食道癌及青春期早熟等疾病。主要影響動物繁殖機(jī)能，導(dǎo)致動物繁殖機(jī)能紊亂。玉米赤霉烯酮還具有免疫毒性、肝毒性、遺傳毒性，對腫瘤發(fā)生也有一定的影響。ZEN的去毒方法可以分為物理、化學(xué)和生物三大類，其中輻照技術(shù)、吸附技術(shù)和臭氧去毒效果都很明顯，是降低谷物中玉米赤霉烯酮污染的重要技術(shù)。用臭氧(O3)和雙氧水處理染毒的谷物，可以顯著降低谷物中^NW毒性，并且隨著臭氧(O3)和雙氧水的濃度、溫度上升以及處理時(shí)間的延長，谷物中ZEN的毒性有下降趨勢。但傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法有一定的局限性，隨著生物技術(shù)的應(yīng)用，對^N的降解有了新的進(jìn)展。Makoto Kimara等發(fā)現(xiàn)，Clonostachys Rosea菌株對玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)有破壞作用，該菌株作用于玉米赤霉烯酮后，其雌激素的性質(zhì)遠(yuǎn)弱于玉米赤霉烯酮。[Makoto Kimara, Naoko Takahashi-Ando, Takumi Nishiuchi Molecular Biology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology 2006 86( 3) 117-123. (Makoto Kimara 等，減少鐮刀霉菌毒素污染的分子生物學(xué)和生物技術(shù)，農(nóng)藥生物化學(xué)和生理學(xué)，2006)]。Naoko等從粉紅粘帚霉霉中克隆了 ^N內(nèi)酯水解酶基因zhdlOl并在大腸菌表達(dá)， 結(jié)果重組的大腸桿菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的水解內(nèi)酯酶的能力，該酶把^N降解。Tomok等把ZhdlOl 轉(zhuǎn)化到玉米中，結(jié)果玉米也表現(xiàn)出對ZEN的降解能力。[Naoko Takahashi-Ando, Makoto Kimura, Hideaki Kakeya et al, A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone :enzyme purification and gene cloning[J]. Journal of Biochemistry, 2002, 365:1-6. (Naoko等，一種新的玉米赤霉烯酮降解內(nèi)酯酶的純化和克隆，生物化學(xué)雜志，2002) ；Tomoko I，Naoko T A, Noriyuki O, et al. Reduced contamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with a detoxification gene[ J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007，73(5) : 1622-1629. (iTomok等，通過降解基因來減少玉米籽粒中真菌毒素玉米赤霉烯酮的污染，應(yīng)用與環(huán)境微生物，2007 )]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種玉米赤霉烯酮降解酶及其編碼基因，該酶對玉米赤霉烯酮(ZEN)可以完全降解。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
本發(fā)明所提供的玉米赤霉烯酮降解酶被命名為zlhy-6，來源于粉紅粘帚霉 {Gliocladium roseum) ACCC No. 31535 (中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，簡稱ACCC)。所述玉米赤霉烯酮降解酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
(a)由序列表中的SEQID NO 1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列表中的SEQID NO :1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加具有降解玉米赤霉烯酮活性的由SEQ ID NO 1衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的SEQ ID NO :1由264個(gè)氨基酸殘基組成。上述玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它可具有下述核苷酸序列之一
(a)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；
(b)編碼序列表中SEQID NO 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。其中，序列表中的SEQ ID NO 2由795個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5，端第1到第795位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系、工程菌及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)所述玉米赤霉烯酮降解酶的方法，是將含有上述玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到玉米赤霉烯酮降解酶。其中，所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為酵母菌。所述酵母菌優(yōu)選為巴氏德畢赤酵母O0Zdia /^1Stori1S),更優(yōu)選為巴氏德畢赤酵母GS115。用于構(gòu)建所述重組大腸桿菌及重組酵母表達(dá)載體的出發(fā)載體可為在上述宿主中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如可在大腸桿菌及巴氏德畢赤酵母O0ZcAia pas tori s)中表達(dá)的 pEB、pPIC9K、pPIC9、pPIC3. 5K 等。上述重組表達(dá)載體均可按常規(guī)方法構(gòu)建。本發(fā)明還提供了所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)的玉米赤霉烯降解酶可以對糧食中真菌毒素玉米赤霉烯酮進(jìn)行消減，對控制糧食污染起到有效的作用。


圖1重組質(zhì)粒pPIC9K-zlhy_6的表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖(白光掃描)， 泳道1，表達(dá)產(chǎn)物；泳道M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，
圖2玉米赤霉烯酮降解酶能力測定圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6的獲得及玉米赤霉烯酮降解酶的表達(dá)1.玉米赤霉烯酮降解酶基因質(zhì)粒文庫的建立
將標(biāo)準(zhǔn)菌株粉紅粘帚霉ACCC No. 31535 (購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心) 的安培管管口打碎后加入300-500μ 液體PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂 20g/L, PH自然)，然后將菌株的懸浮液接入IOOml同樣的培養(yǎng)基，搖床條件為220轉(zhuǎn)/分鐘，30°C，72小時(shí)。培養(yǎng)完成后用離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心收集菌體。提取RNA (Trizol 法)；
(2)以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA序列；
2、玉米赤霉烯酮降解酶基因的獲得
以步驟1中獲得的cDNA序列為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。引物 1 :5，-CCGGAATTCATGCGCACTCGCAGCACAATC-3'(劃線部分堿基為 EcoR I 識別位點(diǎn))和
引物 2 :5，-ATAAGAATGCGGCCGCAAGATGCTTCTGCGTAGTTTC-3'(劃線部分堿基為 Not I 識別位點(diǎn))
在PCR反應(yīng)中，PCR反應(yīng)的溫度變化過程為先升溫至94°C，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環(huán)30次升溫至94°C，保持1分鐘，降溫至M°C，保持1分鐘，升溫至 68°C，保持1分鐘；然后于68°C，保持10分鐘，最后于4°C保溫10分鐘，結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增之后的PCR產(chǎn)物檢測之后將目的帶大小的擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收， 并檢測其濃度。回收PCR產(chǎn)物連接pMD19-T Vector轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得重組質(zhì)粒 pMD19-T-zlhy-6測序鑒定。則該玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列為序列表SEQ ID NO 2，其對應(yīng)的氨基酸序列為序列表SEQ ID NO :1。3、含有玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因序列的重組表達(dá)載體的構(gòu)建
所獲得的PCR產(chǎn)物兩端具有(EcoR I)和(Not I )限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，用(EcoR I) 和(Not I)限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9K(北京茂健聯(lián)星科技有限公司)同時(shí)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切體系20 PL:目的片段或質(zhì)粒8 μ ,Ο. 1%BSA 2yL,10XH Buffer 2 μ , EcoR I 1 μ ,Νο I 1 μ ，ddH206 μ L，酶切條件是37°C反應(yīng)汕。經(jīng)瓊脂糖電泳后載體?；厥盏哪康钠魏洼d體片段定量并按摩爾比為3:1的比例用T4DNA連接酶進(jìn)行體外連接，連接反應(yīng)體系10 μ L :目的片段3 μ L，pPIC9k載體5 μ L 10ΧΤ4 DNA連接緩沖液1 μ L，Τ4 DNA連接酶(350U/yL) lyL。4°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取菌落37°C振蕩培養(yǎng)6-8h，分別進(jìn)行PCR鑒定和重組質(zhì)粒的酶切鑒定。獲得的重組表達(dá)載體命名為pPIC9k-zlhy-6。對pPIC9K-zlhy-6進(jìn)行測序，證明融合連接入質(zhì)粒pPIC9K的DNA序列與序列表 SEQ ID N0:2相同，構(gòu)建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重組表達(dá)載體pPIC9K-zlhy-6 正確。4、玉米赤霉烯酮降解酶在畢赤酵母中的表達(dá)
將重組表達(dá)載體pPIC9K-zlhy-6用Ml I限制性內(nèi)切酶酶切使之線性化后，采用電擊方式，將線性化的載體pPIC9K-zlhy-6導(dǎo)入畢赤酵母GS115 (北京茂健聯(lián)星科技有限公司) 中，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選His+和抗G418的高表達(dá)菌株。挑取選擇性培養(yǎng)基上長出的單菌落接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基(酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，30°C培養(yǎng)12- 小時(shí)后，轉(zhuǎn)入500ml BMGY培養(yǎng)基(1%酵母膏、洲蛋白胨、酵母氮源(YNB) 1. 34%、 IOOmM磷酸緩沖液PH6.0、4X10_5生物素，1%甘油)中繼續(xù)培養(yǎng)至菌液的0D_=2-3，離心收集菌體，再用無碳源BMMY培養(yǎng)基(1%酵母膏、洲蛋白胨、酵母氮源(YNB) 1. 34%、100mM磷酸緩沖液PH6. 0、4X 10_5生物素，0. 5%甲醇)將稀釋至OD600=I后加入0. 5%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 培養(yǎng)期間每隔M小時(shí)補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5%，培養(yǎng)至118小時(shí)即可停止培養(yǎng)。離心收集上清，取上清用SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖1所示(泳道1為表達(dá)產(chǎn)物，箭頭表示目的條帶，泳道 2 為 Marker (71KDa, 50KDa, 37KDa, 25KDa, 16KDa, 8KDa, 2KDa))表明重組菌株在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)的蛋白質(zhì)的分子量約^KDa，與從氨基酸推段出的理論分子量 (28kDa)大小一致。4、玉米赤霉烯酮降解酶表達(dá)產(chǎn)物的純化
宿主為大腸桿菌時(shí)進(jìn)行表達(dá)的玉米赤霉烯酮降解酶使用GE公司組氨酸標(biāo)記親和柱純化目的蛋白。具體的方法參照HisTrap FF組氨酸標(biāo)簽融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)流程的說明書進(jìn)行；而在畢赤酵母中表達(dá)的玉米赤霉烯酮降解酶可以直接分泌到培養(yǎng)液的上清中，直接用于酶活性測定。實(shí)施例2玉米赤霉烯酮降解酶的活性檢測
樣品處理重組的畢赤酵母菌株(實(shí)驗(yàn)組)和野生型畢赤酵母菌株(對照組，空質(zhì)粒整合的畢赤酵母菌株)接入BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至菌液的0D_=2-3，室溫離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，每天取出ImL培養(yǎng)液，12000rpm離心5min，收集上清。取上清液 980 PL置1.5 mL離心管中，再加入20μ IOOOppm的^Ν，使終濃度達(dá)到20ppm。添加后 30°C反應(yīng)ai-10h后處理放到4°C中等待檢測。取處理好的樣品20μ 進(jìn)高效液相色譜檢測 ZEN的殘留。檢測方法按照GB/T 23504-2009方法進(jìn)行。高效液相色譜檢測條件Agilent Eclipse XDB-C18, 150 mmX4. 6 mm(5 μ m)色譜柱，流動相水/ 乙腈/ 甲醇=46%/46%/8%， 熒光檢測器檢測Ex=274 nm Em=440 nm，柱溫30 °C，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量20 μ L。通過高效液相色譜檢測得知經(jīng)過在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)的酶液與ZEN處理后沒有檢測到^N 的殘留，如圖2所示，而對照組控制質(zhì)粒的發(fā)酵液上清中ZEN基本上沒有降解。可以表明， zlhy-6基因克隆表達(dá)出的降解酶具有降解^NW活性。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
權(quán)利要求
1.一種玉米赤霉烯酮降解酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中的SEQID NO 1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中的SEQID NO :1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和 /或缺失和/或添加具有降解玉米赤霉烯酮活性的由SEQ ID NO 1衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一(a)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；(b)編碼序列表中SEQID NO 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
4.含有權(quán)利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
5.權(quán)利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。
7.—種表達(dá)權(quán)利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶的方法，是將含有權(quán)利要求2或3 所述的玉米赤霉烯酮降解酶編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到玉米赤霉烯酮降解酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌；用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為PEB、pPIC9K、 pPIC9、pPIC3. 5k0
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主為巴氏德畢赤酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述宿主為巴氏德畢赤酵母GS115。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玉米赤霉烯酮降解酶及其編碼基因與應(yīng)用，該酶來源于粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中的SEQIDNO1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中的SEQIDNO1氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加具有降解玉米赤霉烯酮活性的由SEQIDNO1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述的玉米赤霉烯酮降解酶對玉米赤霉烯酮(ZEN)具有高效降解作用。
文檔編號C12R1/84GK102199581SQ201110082679
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者伍松陵, 吳子丹, 孫長坡, 路子顯 申請人:國家糧食局科學(xué)研究院