專利名稱：用于降解黃曲霉毒素的枯草芽孢桿菌及其分泌的活性蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌，特別是涉及一種用于降解黃曲霉毒素B1、G1和Ml的枯 草芽孢桿菌及其所分泌的活性蛋白。
背景技術：
霉菌毒素是霉菌生長過程中產生的次級代謝產物。霉菌毒素污染一直是全球畜牧 業(yè)和食品工業(yè)的重大威脅。霉菌毒素具有高毒性，嚴重威脅動物的生產性能和人類健康，每 年給飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產帶來巨大的經濟損失。據(jù)聯(lián)合國糧農組織(FAO)估計，全世界 谷物供應25%受真菌毒素污染而不能食用。目前對畜牧業(yè)威脅最大的霉菌毒素有黃曲霉 毒素、單端孢霉烯族毒素以及玉米赤霉烯酮等。霉菌毒素對畜牧業(yè)及人類產生如此嚴重的 危害，因此自上個世紀被發(fā)現(xiàn)以來，科學工作者便不斷地研究霉菌毒素的預防和解毒、去毒 方法。傳統(tǒng)的霉菌毒素去毒方法有物理和化學方法，包括氨化法、堿法、高溫法、紫外線照射 法、超濾-滲濾法等，這些方法存在效果不穩(wěn)定，營養(yǎng)成分損失較大，難以規(guī)?；a等缺 點；目前還有添加霉菌吸附劑的辦法，這種方法在吸附毒素的同時會吸附一些營養(yǎng)成分，也 不能徹底去除黃曲霉毒素的毒性，動物生產性能仍然受到很大的影響。因此，霉菌毒素污染 的控制急切需要一種高效率、特異性強、以及對飼料和環(huán)境沒有污染的技術。微生物或生物 酶因其反應的準確性、有效性和環(huán)保性而成為人們關注的熱點。
利用微生物脫毒的報道，多集中在近十年。國內研究不多，只有劉大嶺等(真菌提 取液對黃曲霉毒素解毒作用的研究[J].廣東藥學院學報，1995，11 O) :92 94.)發(fā)現(xiàn)一 種真菌代謝產物具有降解黃曲霉毒素的作用。國外對黃曲霉毒素的研究報道比較多的集中 在乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌和白腐真菌等，還有橙色黃桿菌、紅球菌、假密環(huán)菌、根霉菌等。 對于乳酸菌、雙歧桿菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50%以下，而且最關 鍵的是這種去除機制是可逆的結合，而不是對毒素的降解。其他一些細菌和真菌的解毒研 究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率受作用時間、溶液PH值、菌體數(shù)量、毒素濃度、 金屬離子濃度等影響，尚未發(fā)現(xiàn)一種微生物能完全的不可逆的降解飼料中的黃曲霉毒素。
至今為止，未見關于枯草芽孢桿菌及其所產胞外酶能同時降解黃曲霉毒素Bi、Gl 和Ml的相關報道。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用于降解黃曲霉毒素的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其保藏號為CGMCC No. 3609。及其所分泌的活性蛋白，
本發(fā)明的另一目的是提供上述枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法及其所分泌的活性蛋白 的制備方法。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述枯草芽孢桿菌及其所分泌的活性蛋白在降解黃曲霉毒素中應用。
所述枯草芽孢桿菌是從發(fā)霉飼料、深海土壤、海洋生物消化道中分離并篩選得到的Bacillus subtilis ANSB324。其分離篩選方法為以香豆素為唯一碳源進行初篩、再用 黃曲霉毒素Bl進行復篩得到。其細胞理化特征見表1:
表1.細胞理化特征
權利要求
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubti 1 is)ANSB324，其保藏編號為 CGMCC No. 3609。
2.權利要求1所述枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，取所述枯草芽孢桿菌種 子液0. 5-2. 5ml，接種到50-100ml培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基由如下組分組 成胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏l(xiāng)_3g、葡萄糖l-30g、牛肉膏2-5g、氯化鈉3_6g、磷酸氫二鈉 2_5g、七水硫酸鎂 0. 5-1. 5g、硫酸錳 l_3g、蒸餾水 800-1200mL, pH 值為 7. 0-7. 4。
3.根據(jù)權利要求2所述的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述搖瓶發(fā)酵的條 件為發(fā)酵溫度為30-40°C，發(fā)酵時間20-30h，pH值7. 0-7. 4，轉速180-220r/min。
4.權利要求1所述枯草芽孢桿菌分泌的活性蛋白，其通過以下方法制備得到1)對枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)；2)發(fā)酵結束后，離心除菌體，用萃取劑提取上清液中的活性蛋白，在0°C沉淀114h，然 后離心得到沉淀；其中，所用萃取劑為95 %甲醇、95 %乙醇、40 %硫酸銨溶液、60 %硫酸銨溶液或80 %硫 酸銨溶液；3)將得到的沉淀溶于PBS緩沖液，凍干濃縮即得活性蛋白。
5.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌或權利要求4所述的活性蛋白在降解黃曲霉毒素中 的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述應用為降解飼料或食品中的黃曲霉 毒素BUGl和Ml0
7.一種降解黃曲霉毒素Bl的方法，其特征在于，取權利要求1所述枯草芽孢桿菌 的發(fā)酵液或權利要求6所述活性蛋白的PBS溶液600-900 μ 1，加入黃曲霉毒素Bl溶液 100-400 μ 1，將反應體系的pH值調節(jié)為6. 5-7. 5，在30_40°C反應2_72h。
8.一種降解黃曲霉毒素Gl的方法，其特征在于，取權利要求1所述枯草芽孢桿菌 的發(fā)酵液或權利要求6所述活性蛋白的PBS溶液600-900 μ 1，加入黃曲霉毒素Gl溶液 100-400 μ 1，將反應體系調整至pH值為6. 5-7. 5，在25_45°C反應48_72h。
9.一種降解黃曲霉毒素Ml的方法，其特征在于，取權利要求1所述枯草芽孢桿菌 的發(fā)酵液或權利要求6所述活性蛋白的PBS溶液600-900 μ 1，加入黃曲霉毒素Ml溶液 100-400 μ 1，將反應體系調整至pH值為6. 5-7. 5，在20-40°C反應36_72h。
10.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在抑制雞白痢沙門氏菌和/或大腸桿菌和/或金 黃色葡萄球菌中的應用。
11.根據(jù)權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在模擬胃液和/或模擬膽鹽和/或75-90°C 高溫環(huán)境中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于降解黃曲霉毒素的枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis ANSB324 CGMCC No.3609，其所分泌的蛋白及應用。本發(fā)明還提供了所述菌株的發(fā)酵液或其分泌的蛋白用于降解黃曲霉毒素B1、G1和M1的方法，通過所述方法，枯草芽孢桿菌與黃曲霉毒素B1反應48小時后對B1的降解率達到85％，枯草芽孢桿菌與黃曲霉毒素G1反應72小時后對G1的降解率達到66％左右，枯草芽孢桿菌與黃曲霉毒素M1反應72小時后對M1的降解率達到68％左右，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌及其所分泌的活性蛋白解毒活性高、特異性強、作用效果溫和，適用于降解及去除飼料中的黃曲霉毒素。同時，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌具有生物活性強、益生性和抗逆性能好等優(yōu)點，不會破壞飼料中的營養(yǎng)成分。
文檔編號A61K35/74GK102031234SQ20101053998
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權日2010年11月9日
發(fā)明者計成, 趙麗紅, 雷元培, 馬秋剛, 高欣 申請人:中國農業(yè)大學