專利名稱：一種降解aml1－eto融合蛋白的方法及所用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種降解AML1-ETO融合蛋白的方法及所用試劑。
背景技術(shù)：
白血病的發(fā)生多與基因組的異常改變有關(guān)，某一種(或一些)異常分子可通過多種機(jī)制最終引起白血病細(xì)胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑制而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。靶向降解這種(或這些)異常分子自然成為白血病治療的一種策略，而且這種靶向療法往往具有療效高而毒副作用低的特點(diǎn)，是人類賴以征服白血病的有力工具。典型的例子是全反式維甲酸(ATRA)、三氧化二砷(ATO)通過降解PML-RARα融合蛋白誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)白血病細(xì)胞的分化與凋亡，大大改善了APL患者的預(yù)后，使APL成為一種有希望被治愈的白血病。M2型急性髓性白血病(AML M2)占所有急性髓性白血病(AML)的25％，以具有t(8；21)染色體易位為特征，其形成的AML1-ETO融合蛋白是AML M2的發(fā)病原因。該病臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、出血及粒細(xì)胞肉瘤等癥狀體征，而外周血中常有白細(xì)胞增高，紅細(xì)胞、血小板減少。治療上以阿糖胞苷、柔紅霉素等化療為主，而缺少特異針對(duì)AML1-ETO融合蛋白的有效治療方法。開發(fā)靶向降解AML1-ETO融合蛋白并誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡/分化的藥物，對(duì)進(jìn)一步改善AML M2患者的臨床療效具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種降解AML1-ETO融合蛋白的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提出一種降解AML1-ETO融合蛋白所用的試劑。
本發(fā)明的技術(shù)特征是，采用0.5～10μM濃度的冬凌草甲素處理含有t(8；21)染色體易位的Kasumi-1細(xì)胞，2～72小時(shí)后可引起AML1-ETO融合蛋白的降解；用0.5～10μM濃度的冬凌草甲素處理轉(zhuǎn)染過AML1-ETO融合基因的U937細(xì)胞2～72小時(shí)，也可引起AML1-ETO融合蛋白的降解。冬凌草甲素降解AML1-ETO融合蛋白的途徑有兩種，一是活化通過caspases，二是通過ubiquitin途徑。
研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素對(duì)Kasumi-1、NB4、HL-60、U937、K562等白血病細(xì)胞均有增殖抑制作用，但對(duì)具有AML1-ETO融合蛋白的Kasumi-1細(xì)胞作用最為明顯，IC50最低；且冬凌草甲素對(duì)BCR-ABL融合蛋白無降解作用，說明其對(duì)AML1-ETO融合蛋白的降解有一定的特異性。
以上發(fā)現(xiàn)為開發(fā)具有t(8；21)染色體易位的白血病的靶向療法奠定了基礎(chǔ)，也為研究AML1-ETO融合蛋白的生物學(xué)功能提供了新的途徑與試劑。
比較現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下技術(shù)特點(diǎn)1，提出一種降解AML1-ETO融合蛋白的方法和降解AML1-ETO融合蛋白所用的試劑，揭示了四環(huán)二萜類化合物新的生物學(xué)功能。為開發(fā)具有t(8；21)染色體易位的白血病的靶向治療藥物奠定了基礎(chǔ)；為研究AML1-ETO融合蛋白的生物學(xué)功能提供了新的途徑與試劑。
2，發(fā)現(xiàn)了冬凌草甲素新的生物學(xué)效應(yīng)。冬凌草甲素可降解AML1-ETO融合蛋白并誘導(dǎo)AML M2白血病細(xì)胞凋亡，加上其毒副作用低而且價(jià)格低廉，因此有較為廣闊的臨床應(yīng)用前景。


圖1冬凌草甲素對(duì)AML1-ETO融合蛋白的降解作用圖2冬凌草甲素對(duì)BCR-ABL融合蛋白的作用。示冬凌草甲素不能降解BCR-ABL融合蛋白，而ATO可對(duì)其進(jìn)行降解。
具體實(shí)施例方式
I、我們用不同濃度的冬凌草甲素(0.5～5μM濃度)處理Kasumi-1細(xì)胞24、48小時(shí)后提取其蛋白質(zhì)，進(jìn)行Western印跡雜交，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可將94kDa的AML1-ETO蛋白降解，降解片段大小分別為70kDa、25kDa左右(見圖1)。(1為對(duì)照，2～4分別為0.5、2、5μM冬凌草甲素作用24小時(shí)后Kasumi-1細(xì)胞AML-ETO蛋白的變化，5～7為0.5、2、5μM冬凌草甲素處理48小時(shí)后Kasumi-1細(xì)胞AML-ETO蛋白的變化。上方箭頭所示為AML1-ETO融合蛋白，中下方箭頭所示為降解產(chǎn)物。)II、我們用免疫熒光的方法檢測(cè)經(jīng)冬凌草甲素處理后Kasumi-1細(xì)胞內(nèi)AML1-ETO及ETO蛋白的分布情況，發(fā)現(xiàn)Kasumi-1細(xì)胞內(nèi)AML1-ETO、ETO蛋白的表達(dá)明顯降低。
III、用冬凌草甲素處理轉(zhuǎn)染過AML1-ETO融合基因的U937細(xì)胞，再提取其蛋白并進(jìn)行Western印跡雜交試驗(yàn)，亦發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可降解AML1-ETO融合蛋白。
IV、我們比較了冬凌草甲素對(duì)Kasumi-1、NB4、HL-60、U937、K562等細(xì)胞的增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對(duì)具AML1-ETO融合蛋白的Kasumi-1細(xì)胞作用最為明顯，IC50最低(表1)。且冬凌草甲素對(duì)BCR-ABL融合蛋白無降解作用(圖2)，說明其對(duì)AML1-ETO融合蛋白的降解有一定的特異性。
表1 冬凌草甲素對(duì)不同白血病細(xì)胞的增殖抑制作用

V、我們用冬凌草甲素(0.5～5μM濃度)處理Kasumi-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體與DNA“梯形”條帶，磷脂酰絲氨酸表化與末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位凋亡檢測(cè)陽(yáng)性，細(xì)胞周期出現(xiàn)亞G1峰，這種效應(yīng)呈劑量-時(shí)間依賴性。冬凌草甲素還可引起Kasumi-1細(xì)胞線粒體跨膜電位的崩解、caspases的活化及bcl-2癌蛋白表達(dá)下降等。對(duì)其它白血病細(xì)胞株如NB4、HL-60、K562、U937等細(xì)胞，冬凌草甲素也可誘導(dǎo)其凋亡，但所需濃度較高，在5～15μM間。
權(quán)利要求
1，一種降解AML1-ETO融合蛋白的方法，其特征在于，采用0.5～10μM濃度的冬凌草甲素處理Kasumi-1細(xì)胞或轉(zhuǎn)染了AML1-ETO融合基因的U937細(xì)胞，2～72小時(shí)后可引起AML1-ETO融合蛋白的降解。
2，如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于冬凌草甲素對(duì)AML1-ETO融合蛋白的降解作用包括其對(duì)AML1蛋白家族成員的降解作用。
3，如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于冬凌草甲素對(duì)AML1-ETO融合蛋白的降解作用包括其對(duì)ETO蛋白家族成員的降解作用。
4，如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于冬凌草甲素對(duì)AML1-ETO融合蛋白的降解作用可有通過活化caspases或ubiquitin兩種途徑。
5，一種降解AML1-ETO融合蛋白所用的試劑，其特征在于其主要成份為冬凌草甲素，濃度為0.5～10μM。
6，如權(quán)利要求5所述的降解AML1-ETO融合蛋白所用的試劑，其特征在于其為具有環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的四環(huán)二萜類化合物。
全文摘要
本發(fā)明是一種降解AML1－ETO融合蛋白的方法及所用的試劑。應(yīng)用0.5～10μM濃度的冬凌草甲素處理Kasumi－1細(xì)胞，2～72小時(shí)后可引起AML1－ETO融合蛋白的降解。在轉(zhuǎn)染了AML1－ETO融合基因的U937細(xì)胞，冬凌草甲素同樣可降解AML1－ETO融合蛋白。本發(fā)明為開發(fā)具有t(8；21)染色體易位的白血病靶向治療藥物奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為AML1－ETO融合蛋白的生物學(xué)功能研究提供了新的途徑與試劑，還為拓寬冬凌草甲素的臨床/實(shí)驗(yàn)研究用途提供了依據(jù)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1666780SQ20041001689
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者陳賽娟, 周光飚, 王振義, 陳竺 申請(qǐng)人:上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院