專利名稱：：蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物防治和農(nóng)業(yè)微生物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)具有殺線蟲活性的殺蟲晶體蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在微生物殺蟲劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蘇云金芽胞桿菌(5a"7/船A"ri/^Zera&，Bt)是一類廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性細(xì)菌，在其生長發(fā)育過程中，能夠形成內(nèi)生芽胞，因其伴隨芽胞形成而產(chǎn)生對昆蟲具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCiystalProteins,ICPs)，而有別于分泌腸毒素的蠟狀芽胞桿菌(5a"7to和引起炭疽病的炭疽芽胞桿菌(5ac說wa"AracW。研究表明，蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生的晶體蛋白可以對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆蟲綱10個(gè)目500多種昆蟲以及原生動(dòng)物、線形動(dòng)物門、扁形動(dòng)物門中某些有害種類也有特異的生物活性(Schn印fHE，CrickmoreN，RieJV，LereclusD，BaumJ,FeitelsonJ，ZeiglerD民DeanDH.1998.Sacz7Zws//!M/7."g/e"sfsanditspesticidalcrystalproteins.AficroZn'o/Afo/5Zo/iev，62:775-806)。Aroian的實(shí)驗(yàn)室用實(shí)驗(yàn)充分證明了蘇云金芽胞桿菌對線蟲的特異活性(Wei*J.Z.，Hale*K.，CartaL.，PlatzerE.，WongC.，F(xiàn)angS.C.,andAroianR.V.(2003).萬"c飾5Ciystalproteinsthattargetnematodes.Ato/.Jcai100:2760-2765)。蘇云金芽胞桿菌野生菌株一般含有多個(gè)編碼殺蟲晶體蛋白的基因。自1981年Schnepf和Whiteley從庫斯塔克亞種(subsp.bratofo')菌株HD-1中克隆得到第一個(gè)殺蟲晶體蛋白基因以來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并鑒定了許多新的殺蟲晶體蛋白基因。此后，新的殺蟲晶體蛋白基因的克隆一直是蘇云金芽胞桿菌研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。因此在1995年的無脊椎病理學(xué)年會(huì)上成立了由Crickmore等學(xué)者組成的殺蟲晶體蛋白基因命名委員會(huì)，并于1996年正式提出了蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白按氨基酸序列同源性進(jìn)行分類的新的分類系統(tǒng)，規(guī)定了命名規(guī)則和分類原則。其規(guī)定cjj基因是來自蘇云金芽胞桿菌編碼伴胞晶體蛋白的殺蟲基因或者與已知C7基因有明顯的序列相似性的基因，C^基因是編碼具有溶細(xì)胞活性的伴胞晶體蛋白基因或與已知編碼Cyt蛋白有明顯的序列相似性的基因。根據(jù)全長基因推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分為四個(gè)等級。級與級之間的界限為同源性95%、78%和45%。截至2008年12月，蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因已累計(jì)達(dá)到55類436種oy基因和2類27個(gè)cj^基因(CrickmoreN，ZeiglerDR，F(xiàn)eitelsonJ,SchnepfE,vanRieJ,LereclusD,BaumJ,DeanDH.1998.Revisionofthenomenclatureforthe5a"7/wspesticidalcrystalproteins.A/z'cro6z'o/.Afo/.Zev.62:807-813)。3一種重要的植物寄生線蟲，主要寄生于被感染植物的塊根、塊莖、鱗莖或球莖上，從寄主體內(nèi)吸取營養(yǎng)，造成寄主植物的生長發(fā)育不良、畸形、矮化甚至死亡，每年都給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。它們可以寄生于110多種植物，包括大豆、花生、煙草、黃瓜、牡丹等，而茄科、葫聲科、十字花科等植物的受害尤其嚴(yán)重(劉維志，植物病原線蟲學(xué)，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2000)。由于其生活史短，分布面廣，目前已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最重要的病原生物之一(WidmerTL，AbawiGS.MechanismofsuppressionofAfe/oW柳"ehaplaanditsdamagebyagreenmanureofSudangrass._P/awfIfeeose，2000，85(5):562-568.)。同時(shí)又由于根結(jié)線蟲的侵入往往會(huì)使真菌和細(xì)菌更易侵染植物，是誘發(fā)植物病害的重要原因之一(江來發(fā)等.根結(jié)線蟲生物防治研究進(jìn)展.yfjT^ej^丈學(xué)^^f^^^^^^j,2002,26(1):64-68.)。傳統(tǒng)的防治根結(jié)線蟲的方法主要包括輪作、休耕和化學(xué)防治。但是在許多的發(fā)展中國家，人們必須依靠多年生作物和作物連作，輪作和休耕都很難用于防治根結(jié)線蟲；而化學(xué)防治的方法又會(huì)給環(huán)境帶來很大污染。因此，通過生物的方法防治根結(jié)線蟲逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。關(guān)于蘇云金芽胞桿菌對植物寄生線蟲防治的研究，最早的報(bào)道為1972年P(guān)rasad等首次發(fā)現(xiàn)該菌的p-外毒素即蘇云金素對根結(jié)線蟲的卵和幼蟲有較高的毒殺作用(PrasadSSV,TilakKVBR,GollakotaKG.Roleof5ac,7/w說w!'"g/em^var.onthelarvalsurvivabilityandegghatchingof她/oW。gy朋spp.,thecausativeagentofroot-knotdisease./wertek尸加to/.，1972,20:377-378.)。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)蘇云金素可以明顯降低線蟲對植物的侵染(IgnoffoCM，DropkinVH.Deleteriouseffectsofthermostabletoxinof_80<^7/1toxinof丑ac/〃ws^wv'"g/e"w'sonspeciesofsoil-inhabitingwyce/Zop/zagjiy,andplant-parasiticnematodes.■/A^"j.五w,o/wo/.5bc,1977，50:394-398.;DevidasP，CibulskiRJ，RehbergerL.Evaluationof5acz7/usf/wri"gz'es/i:exotoxinfornematodecontrol.A^wto/ogz'ca,1988，34(3):249-301.)。上個(gè)世紀(jì)80年代Bone等人的研究首次證實(shí)了蘇云金桿菌晶體蛋白對線蟲的殺蟲活性(BoneLW,BottjerKP,GilSS.Trichostrongyluscolubriformis:Egglethalitydueto5ac"/MS//!""'"g/e"57'scrystaltoxin.￡x/>.尸oras〖to/.,1985，60:314-322.)。之后，美國Mycogen公司的大量研究工作也進(jìn)一歩證實(shí)了蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體對線蟲的作用(BradfishGA(1992).Processforcontrolling印idopteranpests.EP19920920639.)。此外他們還克隆了多個(gè)具有線蟲活性的毒素蛋白的編碼基因并申請了相關(guān)專利，而我們所能看到的關(guān)于蘇云金芽胞桿菌對線蟲的防治的報(bào)道也多見于這些專利中的描述。目前，已經(jīng)有越來越多的抗線蟲的蘇云金桿菌制劑在田間應(yīng)用。Sharma等用蘇云金亞種(subsp.f/!W/7力g/eM^)和以色列亞種(subsp.菌劑處理大麥根際土壤對南方根結(jié)線蟲(Me/o/(to幼wei"cogwY為起到了一定的防效；此外，他們還發(fā)現(xiàn)，用以色列亞種菌株Bti-H14的毒素蛋白處理大豆和玉米種子，能夠使大豆胞囊線蟲的寄生率顯著降低(SharmaRD.5ac///w^^7'"gfe"sfe:abiocontrolagentofAfe/oz,fitogy"e/"cogw-caonbarely.iVewato/ogi'a_Bro7era，1994,18:79-84.)。Ivanova貝ll報(bào)道某種蘇云金芽胞桿菌制劑能夠用于防治黃瓜和番茄上的根結(jié)線蟲；而Ensard則用蘇云金桿菌制劑在防治香蕉穿孔線蟲方面也取得了顯著效果(IvanovaTS.Efficiencyofbiopreparationincontrolofgallnematodeinprotectedsoil.々to版附—,1996,3:101-106.;EnsardJ.Effectsofthreemicrobialbrothculturesongrowthandpopulationsoffreelivingandplant-parasiticnematodesonbanana,fwc;pea"/。w"a/。//Vt,/WAo/。gy,1998，104(5):457-463.)。然而，隨著Bt殺蟲劑應(yīng)用的推廣和使用強(qiáng)度的不斷增加，目標(biāo)害蟲的抗性現(xiàn)象陸續(xù)被科學(xué)家們4所報(bào)道。研究人員從目標(biāo)害蟲對Bt殺蟲劑的抗性機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，昆蟲對Bt殺蟲劑的抗性的產(chǎn)生與受體的識(shí)別與結(jié)合密切相關(guān)。因此，新的殺蟲晶體蛋白基因的克隆和應(yīng)用已經(jīng)成為預(yù)防與控制目標(biāo)害蟲對Bt殺蟲劑產(chǎn)生抗性的關(guān)鍵途徑，是各種防治策略的核心內(nèi)容。而目前殺線蟲晶體蛋白基因資源十分有限，因此，尋找與克隆新的殺線蟲晶體蛋白基因已經(jīng)成為蘇云金芽胞桿菌研究領(lǐng)域中最活躍的部分之一。蘇云金芽胞桿菌YBT-1518菌株是由申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存的無鞭毛菌株(文獻(xiàn)見實(shí)施例)，它能夠在其芽胞形成過程中形成米粒狀的伴胞晶體，生物測定表明，它的晶體蛋白對秀麗小桿線蟲(CaewoWza6c/"isefegara)和北方根結(jié)線蟲(Afe/oWgye/w//a)具有較高的活性。在進(jìn)一步的基因克隆中在該菌株中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)殺線蟲活性的晶體蛋白基因ciy5B和cry6Aa2，但是該菌中是否還存在著其他的具有殺蟲活性的基因，前人的研究還不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于從蘇云金芽胞桿菌中分離、克隆一個(gè)新的具有殺線蟲活性的晶體蛋白基因，利用其編碼的蛋白應(yīng)用于微生物殺蟲劑中。本發(fā)明從報(bào)道的蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中分離并克隆了一種新型的殺線蟲晶體蛋白基因^0;"/(§-_5，驗(yàn)證它對北方根結(jié)線蟲具有高毒力，并揭示了該晶體蛋白在防治根結(jié)線蟲領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的申請人從報(bào)道的蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1518(菌株來源參見實(shí)施例l)中分離到一個(gè)新的晶體蛋白基因《7""-"。經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的晶體蛋白基因CTj""-J5其編碼區(qū)由861個(gè)堿基組成，具有序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的c77"/S-35基因編碼的蛋白Ciyl518-35是由286個(gè)氨基酸殘基組成，具有序列表SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，預(yù)計(jì)分子量人小為34kDa。通過原核表達(dá)和室內(nèi)生物測定證實(shí)本發(fā)明的基因c7^WS-"在微生物中表達(dá)的Cryl518-35蛋白，能夠?qū)Ρ狈礁Y(jié)線蟲有毒殺作用，這就預(yù)示著該基因可以用于構(gòu)建抗線蟲的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供的上述基因序列是一種新的殺線蟲晶體蛋白基因，該基因可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表達(dá)出Cryl518-35，使受體生物表現(xiàn)出對線蟲的毒殺活性，在寄生線蟲的生物防治方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。更詳細(xì)的技術(shù)方案參考實(shí)施例部分的描述。序列表SEQIDNO:l是本發(fā)明分離克隆的蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質(zhì)序列；圖l:是本發(fā)明實(shí)施例中殺線蟲晶體蛋白基因C7"M-35所在的BAC克隆子的物理圖譜；圖2:是本發(fā)明實(shí)施例中克隆載體pUC18-co^57S-35的構(gòu)建圖及其物理圖譜5圖3:是本發(fā)明實(shí)施例中超量表達(dá)載體pEMB0225的構(gòu)建圖及其物理圖譜；圖4:是本發(fā)明實(shí)施例中殺線蟲晶體蛋白基因CTy""-h在重組菌EMB0225中表達(dá)純化的SDS-PAGE電泳分析；圖中M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:純化后的Cryl518-35殺線蟲晶體蛋白。具體實(shí)施方案以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。有關(guān)DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法和所使用的藥品均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所描述的內(nèi)容(參見薩姆布魯克和拉塞爾，2001，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學(xué)出版社，北京)。本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊等加以實(shí)施。實(shí)施例1蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中殺線蟲晶體蛋白基因c/^5M-35的克隆本發(fā)明以蘇云金芽胞桿菌YBT-1518作為殺線蟲晶體蛋白基因C77"/S-J5的來源菌株，該菌株的來源見文獻(xiàn)Yu，Z.,P.Bai，W.Ye，F(xiàn).Zhang，L.Ruan，Z.Yu，andM.Sun.ANovelNegativeRegulatoryFactorforNematicidalCryProteinGeneExpressionin￡ac!7ZiAi/n>jg!'era&.Mcroto/.傷ofec/jno/.18(6):1033-1039。該菌株無鞭毛，能形成典型的長米粒狀晶體，對根結(jié)線蟲和秀麗小桿線蟲具有高毒力。1.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518總質(zhì)粒的抽提將蘇云金芽胞桿菌菌株YBT-1518過夜活化，按1/100(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的LB培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基配方胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉0.5%，pH7.0)，28°C，200rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。STE(10mMTris.HCl，1mMEDTApH8.0)洗滌菌體1次；加入90溶液1(50mM蔗糖，25mMTris.HCl(pH8.0)，10mMEDTA)懸浮菌體，再加100mg/mL的溶菌酶(在溶液I中加溶菌酶)10pL，冰浴2h以上；加入200pL新鮮配制的溶液11(0.2MNaOH，1%十二烷基硫酸鈉，即SDS),輕緩混勻后置冰上冰浴510min;力B150nL溶液111(5MKAc60mL，冰乙酸11.5mL,定容至100mL)，混勻后置冰上放5min;以12,000rpm離心5min，吸取上清液到一個(gè)新的離心管，苯酚/氯仿/異戊醇溶液(體積比為25:24:1,v:w)抽提2次；上清液中加入2倍體積的無水乙醇或等體積的異丙醇，于室溫靜置510min;12,000離心5min，棄上清，加入70%乙醇，離心洗滌沉淀1次；真空干燥沉淀，用30含有20pg/mLRNase的TE溶液(lmMEDTA，10mMTris-HCl，pH8.0)溶解沉淀。2.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518總質(zhì)粒文庫的構(gòu)建將上步制備的質(zhì)粒加入適量歷'"dIII進(jìn)行不完全酶切，冋收5-12kb片段連接于載體pHT304(載體來源見ArantesOandLereclusD.1991.ConstructionofcloningvectorsforBacillusthuringiensis.Gene108:115-119)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ou并涂布氨芐青霉素抗性平板(含有IOOng/mL的氨節(jié)青霉素，100pg/mLIPTG和80pg/mL的X-gal)，抗性平板置于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h后，挑取白斑于新鮮的LB平板(含有100ng/mL的氨芐青霉素)，即得菌株YBT-1518的質(zhì)粒文庫，隨機(jī)挑取1000個(gè)克隆保存于-80'C冰箱，從中隨機(jī)挑取12個(gè)克隆抽取質(zhì)粒之后進(jìn)行///"(1111酶切和0.8%瓊脂糖電泳檢測得該文庫的平均插入片段大小為8]*，1000個(gè)克隆大約可以覆蓋整個(gè)質(zhì)?；蚪M的23倍(假設(shè)質(zhì)?；蚪M總大小為300kb,每個(gè)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3個(gè))。3.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中殺線蟲晶體蛋白基因c/7/57S-35的克隆禾擁基因《76.4的特異片段為探針，從上述構(gòu)建好的總質(zhì)粒文庫中篩選到了一個(gè)陽性克隆子EMB0229，對該克隆子的測序(由Invitrogen公司完成)表明該重組子中所含有一個(gè)大小為10kb左右的質(zhì)粒pBMB0229(見圖l)。對該質(zhì)粒進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒上除了編碼有基因c/:y6A^外，在這個(gè)基因的卜游還存在一個(gè)同co^4a2高度相似的基因。申請人依據(jù)該基因的特異序列并在兩端引入酶切位點(diǎn)5awHI和歷"dUl設(shè)計(jì)上游引物P1(引物序列為5'-CGC^fA甲芒feATGAATAATATTAATAAGAAG-3，)和下游引物P2(引物序列為5'-CCC^40^BCTAAGATATATAAGCATTTAAAG-3')，并以重組質(zhì)粒pBMB0229為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得目標(biāo)基因，PCR反應(yīng)的體系和程序如下25nL反應(yīng)體系包含2.5jiL10xPCR反應(yīng)緩沖液，1pLdNTP(各2.5mM),0.5特異性上游引物Pl(20mM)，0.5nL特異性下游引物P2(20mM)，0.2nL模板(質(zhì)粒pBMB0229)，0.25nLExT叫酶，加滅菌去離子水至25nL。PCR反應(yīng)參數(shù)和程序?yàn)?4'C，5min，1個(gè)循環(huán)；94'C,20s，52°C，20s，72'C，1.5min，30個(gè)循環(huán)；72°C，10min，1個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增到的目標(biāo)片段通過PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購自O(shè)mega生物技術(shù)公司)純化回收后通過T/A克隆連接到T載體pMD18-TSimpleVector上(購自TaKaRa公司)，得到含有c""7S-JJ全長序列的重組質(zhì)粒pUC18-coJ5/S-J5(見圖2).。之后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡co/Z)DH5a，并涂布氨芐青霉素抗性平板(AmpK,終濃度為100pg/mL)。將抗性平板置于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，待轉(zhuǎn)化子長到一定大小以后，通過質(zhì)粒快檢(大腸桿菌質(zhì)?？鞕z方法參考張桂敏等，一種簡便快速篩選重組子的方法，湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,27(3):280-281.)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。將篩選到的轉(zhuǎn)化子用5mL的液體LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切片段大小與預(yù)期大小一致。最后將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子用5mL的液體LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，取lmL的過夜培養(yǎng)物送樣測序(由Invitrogen公司完成)。測序結(jié)果顯示該基因具有如序列表SEQIDNO:l中所示的核苷酸序列，申請人將該基因命名為^y"M-"(在本發(fā)明中，被命名的基因以斜體小寫表示)。通過軟件分析預(yù)測此段編碼序列可編碼一個(gè)如序列表SEQIDNO:l中所示的由286個(gè)氨基酸組成的多肽片段，預(yù)測其分子量為34kDa，申請人將其命名為Ciyl518-35(在本發(fā)明中，被命名的蛋白以正體大寫表示)。74.蘇云金芽胞桿菌YBT-1518中殺線蟲晶體蛋白基因CTy"/S-"的序列分析對co^i"-"的進(jìn)一步序列分析表明，該基因由861個(gè)核苷酸組成，編碼一個(gè)由286個(gè)氨基酸組成的多肽，其理論分子量為34-kDa，在GenBank上進(jìn)行的BlastP分析發(fā)現(xiàn)，同該多肽最相似的蛋白質(zhì)為Cty6Aa2蛋白，其氨基酸序列的一致性為29.7%，相似性為40.4%，依據(jù)晶體蛋白基因的命名原貝U(參見文獻(xiàn)(CrickmoreN，ZeiglerDR，F(xiàn)eitelsonJ，SchnepfE，vanRieJ，LereclusD,BaumJ，DeanDH.1998.Revisionofthenomenclatureforthe5a"7/uyAwr/Mg-e,wispesticidalcrystalproteins.Af/cro6/o/.Afci/.5z'o/.Zev.62:807-813)，該基因?qū)⒈粴w為I類新型c"基因。實(shí)施例2殺線蟲晶體蛋白基因c/j^5M-35在大腸桿菌JM109中的表達(dá)純化及生物活性測定1.殺線蟲晶體蛋白基因cv^A57S-J5在大腸桿菌中超量表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例l中獲得的含有基因co^57S-35的重組質(zhì)粒pUC18-cJ7/5/S-35經(jīng)過AjmHI和歷"c/ffl雙酶切，同時(shí)將質(zhì)粒載體pQE30進(jìn)行相同的雙酶切，然后將上述載體和外源的酶切產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠分離后，切下目標(biāo)片段并通過DNA凝膠回收試劑盒(購自O(shè)mega生物技術(shù)公司)純化回收。之后將兩者通過T4DNA連接酶(購自TaKaRa生物技術(shù)公司)連接，從而獲得了含有基因c^v""-"全長ORF的重組表達(dá)質(zhì)粒pEMB0225(見圖3),將該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌五.co//DH5a(購自Tiangen公司)，并抽提質(zhì)粒分別進(jìn)行￡^^^1和///"必//雙酶切驗(yàn)證，酶切片段大小與預(yù)期大小一致。進(jìn)一步的測序結(jié)果表明c^/5/S-15基因被正確地插入了到了表達(dá)載體pQE30中。2.殺線蟲晶體蛋A基因C77W7S-"在大腸桿菌JM109中的表達(dá)和純化為了大量表達(dá)Cryl518-35蛋白，中請人將上述攜帶有其編碼序列的重組表達(dá)質(zhì)粒pEMB0225轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(購自Tiangen公司)中，得到了重組菌JM109/pEMB0225。將該重組菌株接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中(另外附加終濃度為100ng/mL氨芐青霉素)，過夜活化。以1:100(v/v)轉(zhuǎn)接至50mLLB液體培養(yǎng)基中，置于37。C搖床培養(yǎng)至OD6Q。為0.5-0.8左右以后，加入1.0mmol/L的異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(即IPTG，購自sigma公司)于37'C誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。將上述50mL重組菌JM109/pEMB0225的3h誘導(dǎo)培養(yǎng)物經(jīng)過12000rpm離心30s收集菌體，利用超聲波(技術(shù)參數(shù)功率400W，破碎30s，間歇30s)將細(xì)胞破碎后12000rpm離心15min取上清。然后將上清液過Ni-iDA親和jS析柱(His鎳tt)(購自Novagen公司)提純該特異蛋白Cryl518-35(具體的純化步驟按照試劑盒操作說明書進(jìn)行)。對最終的純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖4所示，提純的蛋白與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)比對，估算分子量為35kDa，與預(yù)計(jì)的晶體蛋白Ciyl518-35分子量大小35.2kDa基本吻合，證明本發(fā)明的殺線蟲晶體蛋白Ciyl518-35在大腸桿菌JM109中得到了成功的表達(dá)。申請人將上述的表達(dá)殺線蟲晶體蛋白基因的coJ5/S-35游重組大腸桿菌命名為(Esc/ien'c/n'aco")EMB0225，于2009年1月8日將該重組大腸桿菌送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(hào)為CCTCCMO:M20卯09。重組大腸桿菌emb0225的生物學(xué)及遺傳學(xué)特性①生物學(xué)特性菌體直桿狀，營養(yǎng)體呈鏈狀或單生，長l-3微米，寬0.4-0.7微米，革蘭氏染色陰性，無芽胞，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中容易分散。生長溫度范圍為15-46°C,最適生長溫度為37°C。兼性厭氧，在有氧條件下生長良好。在含0.5°/。NaCl的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長，最適生長pH為6.8-8.0。在葡萄糖、麥芽胞、甘露醇、木膠糖、阿拉伯膠等培養(yǎng)基中產(chǎn)酸產(chǎn)氣，甲基紅反應(yīng)陽性。②遺傳學(xué)特性本發(fā)明是以大腸桿菌^&cfen'cWaco/ZB121為出發(fā)菌株得到的基因工程菌，含有本發(fā)明得到的殺線蟲晶體蛋白基因《yU/s-"。經(jīng)繼代培養(yǎng)，殺線蟲晶體蛋白基因c/t"M-W能夠在工程菌中穩(wěn)定存在，表達(dá)正常，對受體菌的生長無重大影響。3.殺線蟲晶體蛋白Cryl518-35對北方根結(jié)線蟲生物活性的測定以北方根結(jié)線蟲(We/oWogy^/zap/fl)的二齡幼蟲作為靶標(biāo)線蟲檢測Cry蛋白對線蟲的生物活性。取被北方根結(jié)線蟲感染的番茄根，用自來水沖洗干凈。從根部取下根結(jié)線蟲卵塊，用0.5%NaC10消毒2次，然后25°C孵化35d，孵化山的線蟲即作為生物測定的靶標(biāo)。生物測定在96孔板上進(jìn)行，每孔吸入40頭2齡幼蟲(具體方法參考文獻(xiàn)余子全等，蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白對植物寄生線蟲生物測定方法的建立和高毒力菌株的篩選，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007(15):867-871)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)57個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，用20ng/mLBSA作為陰性對照，純化的Cry6Aa2蛋白作為陽性對照。5天后統(tǒng)計(jì)死亡率，將死亡率校正后換算成幾率值，蛋白濃度換算成對數(shù)值，求出二者之間回歸方程計(jì)算LC50，結(jié)果見表l。從表1中可以看出，本發(fā)明得到的殺線蟲晶體蛋白Ciyl518-35對北方根結(jié)線蟲顯示出了很高的殺蟲活性，半致死濃度為7.43ng/mL,而且與已知的殺線蟲晶體蛋白Ciy6Aa2的殺線蟲活性相當(dāng)。這些結(jié)果證明本發(fā)明得到的殺線蟲晶體蛋白Cryl518-35對北方根結(jié)線蟲具有高活性。表1:殺線蟲晶體蛋白Cryl518-35和Cry6Aa2對北方根結(jié)線蟲的活性檢測晶體蛋白回歸方程R2值半致死濃度Oig/mL)Cry6Aa2y=1.0297x+4.09610.98967.55Cryl518-35y=1.1067x+4.03590.96587.43本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的晶體蛋白Cryl518-35對北方根結(jié)線蟲具有高毒力，為北方根結(jié)線蟲的生物防治提供了一種新的基因資源。9〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>蘇云金芽胞桿菌殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35及應(yīng)用<130><141〉2009-01-09<160〉2<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉861<212>DNA〈213〉蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>gene<222>(1)..(861)<223><220><221〉CDS<222>(1)..(861)<223><400>1atgaataatattaataagaagtatagacttaatgatatgattaataaa48MetAsnAsnlieAsnLysLysTyrArgLeuAsnAspMetlieAsnLys151015aatcaatttattattteaaaaacagaatgggttactataagaacatat恥AsnGinPhelielieSerLysThrGluTrpValThrlieArgThrTyr202530attg朋attggattaactttsccagtsa^tgaacaageitttscgaa犯144lieGlulieGlyLeuThrLeuProValAsnGluGinAspLeuArgLys35404510tatttcaatttaaatccagatataacaetatctaatgatttttctgaa192TyrPheAsnLeuAsnProAsplieThrLeuSerAsnAspPheSerGlu505560ttatttgatatttgttattctattaaaaatttagetcaatggtggaat240LeuPheAsplieCysTyrSerlieLysAsnLeuAlaGinTrpTrpAsn65707580accactatacttcctttaattattaaatctgttaataatattacatea288ThrThrlieLeuProLeulielieLysSerValAsnAsnlieThrSer859095tatggatttaaaattgetggtaatccttttaataataaagaaggatac336TyrGlyPheLyslieAlaGlyAsnProPheAsnAsnLysGluGlyTyr100105110tttteaaaattacaaaatgaattscatattatt幼taattataattct384PheSerLysLeuGinAsnGluLeuHislielieAsnAsnTyrAsnSer115120125aat肌aeicbaca肌elactatt333caatttceieitcteggtgtaacatt432AsnLysThrThrLysThrlieLysGinPheGinSerArgCysAsnlie130135140ttaattaaggaagttaaacaatatgaagatgttaccaaaaatattgta480LeulieLysGluValLysGinTyrGluAspValThrLysAsnlieVal145150155160atattattaaataaacttttatatggtaatcagcaaaaattagaaggg528lieLeuLeuAsnLysLeuLeuTyrGlyAsnGinGinLysLeuGluGly165170175att3ttaatsttcaaaascgattoaaagtggttcaascsactttt犯t576lielieAsnlieGinLysArgLeuLysValValGinThrThrPheAsn180185190ccgatatctaatg肌set肌tttsatttat肪a3幼ctetttg犯s肌624ProlieSerAsnGluThrAsnUulieTyrLysLysLeuPheGluLys195200205ataaaaaaaataaatattggtttttttgaatgcgtaaataaatatata672lieLysLyslieAsnlieGlyPhePheGluCysValAsnLysTyrlie210215220agtatatttaacaaaataattattptgtggteaaatactgaacaacaa720SerliePheAsnLyslielielieMetTrpSerAsnThrGluGinGin225230235240attatagattttaaateaattttatttcaagaatttaaaaatataaat768lielieAspPheLysSerlieLeuPheGinGluPheLysAsnlieAsn245250255gaaacagttsttgaatttgaagat8ttsttgagstttggtt3att3t3816GluThrVallieGluPheGluAsplielieGlulieTrpLeulielie260265270getaaaaaatctcgtgaatttactttaaatgettatatatcttag861AlaLysLysSerArgGluPheThrLeuAsnAlaTyrlieSer275280285〈210〉2<211>286<212>PRT<213>蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)<400>2MetAsnAsnlieAsnLysLysTyrArgLeuAsnAspMetlieAsnLys151015AsnGinPhelielie'SerLysThrGluTrpValThrlieArgThrTyr202530lieGlulieGlyLeuThrLeuProValAsnGluGinAspLeuArgLys354045TyrPheAsnLeuAsnProAsplieThrLeuSerAsnAspPheSerGlu50556012<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>權(quán)利要求1、一個(gè)來自于蘇云金芽胞桿菌的殺線蟲晶體蛋白基因cry1518-35，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、一個(gè)來自于蘇云金芽胞桿菌的殺線蟲晶體蛋白基因cr少"M-W的編碼蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。3、一株轉(zhuǎn)殺線蟲晶體蛋白基因tr少"M-"的重組大腸桿菌(Esc/zen'c&aco//)EMB0225，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M209009。4、權(quán)利要求2所述的編碼蛋白在制備微生物殺蟲劑中的應(yīng)用。5、權(quán)利要求2所述的編碼蛋白在轉(zhuǎn)基因微生物或轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌EMB0225在制備微生物殺蟲劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于微生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。公開了一種來自于蘇云金芽胞桿菌的殺線蟲晶體蛋白基因的分離、克隆及其對線蟲的生物活性。本發(fā)明從對北方根結(jié)線蟲有活性的蘇云金芽胞桿菌YBT-1518菌株中分離得到一個(gè)新的殺蟲晶體蛋白基因cry1518-35；該基因的編碼產(chǎn)物為一種新的殺蟲晶體蛋白Cry1518-35；該蛋白Cry1518-35對北方根結(jié)線蟲有很高的殺蟲活性。本發(fā)明還包括表達(dá)殺蟲晶體蛋白基因cry1518-35的大腸桿菌重組菌EMB0225的制備，該重組大腸桿菌菌已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號(hào)為CCTCCNOM209009。文檔編號(hào)C12N15/32GK101492686SQ200910060470公開日2009年7月29日申請日期2009年1月9日優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日發(fā)明者喻子牛,明孫,彭東海,王鵬霞,郭素霞,阮麗芳申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)