專利名稱：一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒orf2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株、疫苗及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物細(xì)菌基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬2 型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌活疫苗菌株的構(gòu)建、疫苗制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella Bronchis印tica，Bb)是一種革蘭氏陰性菌，其宿主范圍廣泛，大多數(shù)哺乳動物和鳥類都可以被感染。該菌是引起豬萎縮性鼻炎(Atroptic Rhinitis, AR)的主要病原菌之一，單獨(dú)的恥常常引起豬只的隱性感染，發(fā)病豬臨床表現(xiàn)為生長緩慢，育肥延遲，極大地降低了飼料報酬和生產(chǎn)效率；而恥和產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌 (Pasteurella multocida, Pm)共同作用引起的豬萎縮性鼻炎，在臨床上以出現(xiàn)鼻炎、鼻甲骨萎縮和生長性能下降為特征。恥可通過飛沫傳播，并經(jīng)動物的呼吸運(yùn)動而侵入機(jī)體，該菌侵入機(jī)體后，能夠破壞局部的纖毛或上皮，同時恥分泌的各種毒素可引起機(jī)體呼吸道粘膜上皮細(xì)胞發(fā)炎、增生和纖毛脫落。如果機(jī)體的鼻粘膜出現(xiàn)急性炎癥的繼續(xù)發(fā)展，則常有部分粘膜上皮受損脫落，進(jìn)而鼻粘膜的屏障作用遭到破壞，大量細(xì)菌及其毒素就會趁機(jī)迅速進(jìn)入粘膜下組織，造成骨組織明顯損傷，引起豬鼻甲骨病變。同時，恥粘膜上皮細(xì)胞受損脫落后可為其它呼吸道病原菌的侵入提供了條件，造成其它多種病原的繼發(fā)感染，對鼻腔和整個呼吸道造成更嚴(yán)重的損傷(斯特勞，2000)。從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失(Straw et al.，2000 ;Karen，2000 ;Borckmeier，2003)。以 AR 為代表的豬波氏菌病現(xiàn)已遍布養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國家，已成為豬的重要呼吸道傳染病之一(Straw et al. ，2000 ；Dugal et al. ,1992 ；Vecht et al. , 1992 ；Brockmeier,2004 ；Brockmeier et al.，2000)。由于恥屬豬鼻腔中的一種常在細(xì)菌，因此從機(jī)體中根除該菌的可能性不大， 但是恥對豬群的危害又不容忽視，所以防制工作就顯得尤為重要，目前主要采取綜合防控措施控制該菌，其中對豬群進(jìn)行免疫接種是主要手段?，F(xiàn)今市場上已有針對恥的相關(guān)滅活疫苗，但其使用效果并不明顯，效力也普遍較低，這可能與恥滅活苗不能有效引起局部粘膜免疫，不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性抗體IgA有關(guān)(Bercovich et al. , 1977 ；Giles et al.， 1982)。另外，有研究報道有部分恥弱毒疫苗和亞單位苗在研制中，但尚未被大規(guī)模臨床推廣應(yīng)用(Kruger et al.，1992 ；Kang et al. ,2007) 豬2型圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)是當(dāng)前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。該病毒與豬的多種疾病綜合征有關(guān)，特別是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及黃疸等。PCV2基因組全長為1767或1768bp，共編碼11個開放閱讀框架(Open reading frames, ORFs)，閱讀框之間相互重疊，使病毒可以充分利用有限的遺傳物質(zhì)傳遞大量的遺傳信息。0RF2編碼病毒的核衣殼(Cap)蛋白，是病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，含有234個氨基酸，分子量大小為27.8kDa。由基因組的互補(bǔ)鏈合成。Cap蛋白轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在1238位核苷酸，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物內(nèi)含有由119個核
3苷酸(1238nt-1120nt)組成的非編碼前導(dǎo)序列，Cap啟動子精確定位于1353nt-1168nt核苷酸區(qū)域，與R印基因有重疊(Mankertz et al.，1998)。Cap蛋白在圓環(huán)病毒感染細(xì)胞后 6-12小時即可表達(dá)，在12-24小時定位于細(xì)胞核中(Meertset al. ,2005) 0RF2基因在圓環(huán)病毒中變異比較大，同源性約為70%。Cap蛋白端的41個氨基酸序列高度保守，富含堿性氨基酸(如精氨酸)，編碼病毒的核定位信號，與病毒在細(xì)胞核內(nèi)的定位有關(guān)，其中第12-18 位和第34-41位氨基酸殘基對0RF2的定位起著至關(guān)重要的作用。Cap蛋白間不存在交叉反應(yīng)，具有良好的免疫原性，產(chǎn)生的抗體在血清中維持時間長，因此0RF2基因是進(jìn)行病毒控制和構(gòu)建重組疫苗的首選基因。PCV2在豬群中的感染率非常高，但多為隱性感染，且主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，造成繼發(fā)感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要采取疫苗接種的方法控制該病，但PCV2在體外細(xì)胞上增殖滴度不高，用全病毒來制備滅活疫苗或弱毒疫苗操作繁瑣，成本高，因此DNA疫苗、亞單位疫苗及活載體疫苗等將是研制PCV2疫苗的主要方向。隨著人們對流行病學(xué)、病原菌致病機(jī)理的深入了解，以及免疫學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，學(xué)術(shù)界已形成了有關(guān)免疫調(diào)節(jié)和疫苗遞呈系統(tǒng)的新概念，為新型疫苗的設(shè)計(jì)提供了新思路。其中，以細(xì)菌為活載體的疫苗被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的研究領(lǐng)域之一，該類疫苗是將致病菌的特異性抗原基因插入減毒的細(xì)菌載體中，以遞呈表達(dá)所編碼的異源抗原，以期達(dá)到預(yù)防一種或多種疾病的作用。研究表明許多傳染性疾病是由于病原菌在粘膜表面(如呼吸道、胃腸道)的定居或者侵入引起的，因此，刺激機(jī)體的粘膜免疫在保護(hù)機(jī)體免受病原菌的侵?jǐn)_和毒素作用方面則顯得尤為重要。細(xì)菌載體活疫苗能將特異的免疫抗原遞呈到粘膜表面，使其有效接觸，基于其共同的粘膜免疫系統(tǒng)，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不僅發(fā)生在接觸抗原的誘導(dǎo)部位，而且也發(fā)生在較遠(yuǎn)的粘膜部位，進(jìn)而誘導(dǎo)強(qiáng)有力的全身免疫。細(xì)菌與病毒都可作為重組疫苗載體，與病毒載體不同，細(xì)菌疫苗載體有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)，例如細(xì)菌疫苗載體基因組容量大，可以攜帶許多不同的外源基因片段，易于構(gòu)建多價基因工程疫苗；具有免疫佐劑的作用，提高了外源蛋白的免疫活性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的系統(tǒng)和粘膜免疫反應(yīng)，具有良好的免疫效果；誘導(dǎo)作用位點(diǎn)比較明確，更安全可靠。另外，細(xì)菌載體疫苗生產(chǎn)成本相對低廉，可以通過口服或者鼻腔噴霧接種，方法簡便易行，適合大范圍免疫預(yù)防。因此，減毒細(xì)菌作為疫苗載體已成為醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前有關(guān)細(xì)菌載體的研究越來越多，減毒沙門氏菌是最早用作疫苗載體的病原菌，也是目前研究最深入的細(xì)菌載體。重組卡介苗(rBCG)是牛分支桿菌的減毒疫苗，它是世界上應(yīng)用最廣泛的疫苗，自1948年以來全球已有30億人接種重組卡介苗，其安全性已被證實(shí)，而且BCG是WHO推薦的兩種嬰兒出生時接種的活疫苗之一?？梢姡衬っ庖吲c多價基因工程疫苗是未來有效預(yù)防控制人、畜傳染病的主要研究方向；同時，這些細(xì)菌載體疫苗在控制相關(guān)動物疫病方面具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。支氣管敗血波氏桿菌與大多數(shù)細(xì)菌呼吸道病原體不同，該菌能有效、快速的定殖于豬的呼吸道粘膜，持久刺激機(jī)體的粘膜免疫反應(yīng)。因此，若在試驗(yàn)中用安全性高、減毒的恥作為疫苗或活菌疫苗載體具有很多優(yōu)點(diǎn)，通過鼻腔接種，使其直接進(jìn)入豬的呼吸系統(tǒng)，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有效的粘膜免疫和全身體液免疫及細(xì)胞免疫抗體。另外，恥基因組相對高等， 目前已經(jīng)對其全基因組進(jìn)行了測序并有了較為全面深入的功能基因組學(xué)研究，操作起來相對簡單，有相對比較好的動物模型來評價候選疫苗菌株。而且恥具備所有已知的細(xì)菌蛋白
4分泌系統(tǒng)，因此可用作細(xì)菌載體以遞呈其它呼吸道致病菌的免疫基因，達(dá)到一次接種就能持久預(yù)防多種疫病的目的，使豬群獲得更好的保護(hù)。目前，國際上構(gòu)建細(xì)菌突變株所缺失的靶基因主要有兩類，一類是缺失相關(guān)毒力基因，如毒素和粘附素；另一類是缺失細(xì)菌代謝途徑或適應(yīng)環(huán)境調(diào)節(jié)中的“看家”基因。由于 Bb含有多個毒力因子，不同的毒株之間，存在明顯的毒力和致病差異，且目前還未見哪一個或一類毒力相關(guān)基因在致病與免疫相關(guān)功能上起著決定性的作用，因此，選擇缺失某一個或幾個靶基因，有一定的盲目性。而代謝途徑或環(huán)境調(diào)節(jié)中的看家“基因”是每一個細(xì)菌都含有的，通過分子遺傳學(xué)方法缺失該類基因，進(jìn)而達(dá)到使野毒株致弱，具有更好的普適性； 并且已有學(xué)者應(yīng)用這種減毒策略在鼠傷寒沙門氏菌中獲得滿意結(jié)果。芳香族(aro)生物合成途徑是革蘭氏陰性菌和陽性菌共有的代謝途徑。aroA編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸合成酶，缺失該基因可影響芳香族氨基酸、氨基苯甲酸及其它芳香族化合物的合成，使細(xì)菌在宿主內(nèi)有限繁殖，進(jìn)而使其毒力減弱；同時，該類基因缺失突變株可能具有其它優(yōu)點(diǎn)， 如可有效表達(dá)恥的各種免疫原性基因；在宿主體內(nèi)定殖的數(shù)周內(nèi)，既可激發(fā)機(jī)體強(qiáng)大的免疫應(yīng)答，又能及時被宿主清除，具有更好的安全性和免疫效力；通過鼻腔粘膜免疫途徑，可局部逃避肌注或口服抗生素所帶來抑制作用。盡管波氏桿菌疫苗作為載體有諸多的無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，但各種問題也很多，如外源抗原的表達(dá)量低而不能激發(fā)免疫反應(yīng)，外源抗原高水平的表達(dá)可能對波氏桿菌載體有毒性，外源基因表達(dá)不穩(wěn)定，免疫原性低等，這些原因均可導(dǎo)致免疫效果差。如果疫苗的免疫原性很弱，可以使用穩(wěn)定的高拷貝的質(zhì)粒以增加重組抗原的產(chǎn)量，提高免疫原性，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答(Galen and Levine，2001)。除了外源抗原在波氏桿菌中表達(dá)量低以外，常常遇到的另一個問題是外源基因表達(dá)不穩(wěn)定，特別是在體內(nèi)。研究者們研究了各種方法來解決遺傳不穩(wěn)定問題，較為有效的方法之一是將編碼外源基因的DNA通過同源重組整合到波氏桿菌載體染色體上。目前國外已有學(xué)者開始對支氣管敗血波氏桿菌弱毒活疫苗作為載體進(jìn)行研究，但迄今為止還沒有一個較為成熟的產(chǎn)品問世。目前報道的研究大都普遍采用攜帶抗性基因的表達(dá)質(zhì)粒，因存在生物安全問題而不被人們所接受。因此，通過同源重組構(gòu)建不含抗性標(biāo)記的，缺失支氣管敗血波氏桿菌的營養(yǎng)代謝基因的弱毒菌株，既可以用來作為預(yù)防波氏菌病的疫苗，也可以用來作為載體表達(dá)外源基因，有著較好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室用此方法已經(jīng)成功構(gòu)建了支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失株，此基因缺失株不含任何抗性基因，有著較好的免疫原性，能夠提供針對波氏桿菌野毒株攻擊的保護(hù)。參見中國發(fā)明專利《一種支氣管敗血波氏桿菌基因缺失疫苗及應(yīng)用》，授權(quán)公告號CN101575586B和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全性評價在湖北省的環(huán)境釋放試驗(yàn)(農(nóng)基安辦字2009第015號)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以我國地方流行恥菌株(QH0814)為材料，利用負(fù)向篩選技術(shù)構(gòu)建不含抗性標(biāo)記的支氣管敗血波氏桿菌aroA基因缺失突變株，將豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因在其基因組中進(jìn)行表達(dá)，并對其遺傳穩(wěn)定性、生長特性、對小鼠的致病性和免疫保護(hù)效力等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。該疫苗菌株不攜帶任何外源基因、抗生素抗性基因或者基因轉(zhuǎn)移原件，所以菌株對動物、環(huán)境和人均是安全的，且具有很好的免疫效果。鑒于此前提，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，獲得一種免疫原性更好和安全性更強(qiáng)的表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒 0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株；本發(fā)明的第二個目的是利用表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株制備豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌二價基因工程疫苗；本發(fā)明的第三個目的是表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株在制備豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌二價基因工程疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)利用基因工程技術(shù)將支氣管敗血波氏桿菌野生菌株QH0814的一個主要芳香烴氨基酸代謝基因aroA部分缺失后，使整個芳香基團(tuán)的生化代謝途徑被阻斷。將aroA基因的上游、下游各1380bp的序列通過分子克隆技術(shù)克隆至pBlUesCriptIISK(+)載體上，通過酶切位點(diǎn)拼接在一起，構(gòu)成重組所必需的上下游同源臂，并將0RF2基因的582bp的序列插入到上下同源臂之間。將含有插入基因0RF2基因的上下游同源臂片段轉(zhuǎn)移至自殺性載體pRE112 (徐引弟，郭愛珍，陳煥春.豬霍亂沙門氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的構(gòu)建及鑒定，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2008，16 O) =196-201)上。然后將有上下游同源臂自殺性載體通過結(jié)合轉(zhuǎn)移至支氣管敗血波氏桿菌野生菌株QH0814中，通過自殺性載體PRE112上的氯霉素抗性基因和針對aroA基因的PCR方法來篩選同源臂和同源基因的第一次同源重組(單交換)。篩選所得單交換克隆通過對氯霉素抗性的消除和PCR驗(yàn)證來篩選aroA缺失的重組菌株(QH0814AaroA/0R^)。本發(fā)明設(shè)計(jì)人將篩選所得的表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒 0RF2基因片段的重組菌株，于2011年3月M日已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO :M2011093，保藏命名支氣管敗血波氏桿菌Bordetella bronchiseptica QH0814AaroA/0RF2o本發(fā)明所述的該菌株缺失了支氣管敗血波氏桿菌對芳香族氨基酸代謝所必須的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶aroA基因，并含有能在該菌株基因組中穩(wěn)定表達(dá)的豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因，該菌株具有針對豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌的免疫保護(hù)力。本發(fā)明還包含應(yīng)用所述一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌制備基因工程疫苗。本發(fā)明還包含所述的重組支氣管敗血波氏桿菌株QH0814A aroA/0RF2在制備豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌病疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明通過大量的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明本發(fā)明制備的重組菌株可用于制備針對豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌的二價疫苗。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明制備的基因工程菌株表達(dá)的豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段為豬圓環(huán)病毒2型的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保護(hù)性。使用滴鼻途徑進(jìn)行免疫操作方便，能刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜應(yīng)答。因此，用本發(fā)明的基因工程菌株制成的疫苗具有廣闊的市場應(yīng)用前景。2、本發(fā)明所用的材料為支氣管敗血波氏桿菌野生致病菌株QH0814，具有全部的毒力因子和其他免疫原性良好的抗原。因此，芳香烴氨基酸代謝途徑中的重要基因aroA缺失后，獲得的aroA缺失株毒力大大降低而其免疫原性未發(fā)生改變，可以保護(hù)多種異源波氏桿菌野毒菌株的攻擊。3、本發(fā)明制備的基因工程菌株可以同時提供針對豬2型圓環(huán)病毒和支氣管敗血
6波氏桿菌兩種病原的保護(hù)。4、本發(fā)明制備的基因工程菌株不含抗性標(biāo)記，完全符合疫苗生物安全性要求。


圖1 是本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE Δ aroA/0RF2的物理圖譜。圖2 是本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pREAaroA/0RF2的酶切鑒定結(jié)果。圖中Ml =DNA marker(DL 2,000) ；M2 :DNA marker(DL 15，000) 1-3 :pREΔaroA/0RF2(KpnI 和 SacI)。圖3 是本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pRE Δ aroA/0RF2構(gòu)建的流程圖。圖4 是本發(fā)明中的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒整合至基因組后用引物A5/A6進(jìn)行的PCR鑒定。圖中 M:DNA Ladder (DL 2，000) ； 1-3 單交換子；4 親本菌株 QH0814 ;5 :ddH20 對照。圖5 是本發(fā)明中的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒整合至基因組后用引物Cml/Cm2進(jìn)行的PCR鑒定。圖中 M =DNA Ladder (DL 8，000) ； 1-5 單交換子；6 質(zhì)粒 pRE112 ；7 :ddH20 對照。圖6 用引物A5/A6對本發(fā)明中的重組菌株QH0814 Δ aroA/0RF2進(jìn)行的PCR 鑒定。圖中M:DNA Ladder (DL 2，000) ； 1-2 重組菌株；3 親本菌株QH0814 ;4 質(zhì)粒 pRE Δ aroA/0RF2 ；5 單交換子；6 :ddH20 對照。圖7 用引物C1/C2對本發(fā)明中的重組菌株QH0814 Δ aroA/0RF2進(jìn)行的PCR 鑒定。圖中 M =DNALadder (DL 2，000) ； 1-2 重組菌株；3 :PMD_PCV2 基因組；4 質(zhì)粒 pRE Δ aroA/0RF2 ；5 (MH2O 對照。圖8 用引物Cml/Cm2對本發(fā)明中的重組菌株QH0814 Δ aroA/0RF2進(jìn)行的 PCR 鑒定。圖中 M =DNA Ladder (DL 2，000) ； 1-2 重組菌株；3 質(zhì)粒 pRE112 ；4 質(zhì)粒 pRE Δ aroA/0RF2 ；5 (MH2O 對照。圖9 用引物A5/A6對本發(fā)明中的重組菌株QH0814 Δ aroA/0RF2遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行 PCR鑒定。圖中M:DNA Ladder (DL 2，000) ； 1-7 分別為重組菌株的第1代、5代、10代、15 代、20 代、25 代、30 代；8 親本菌株 QH0814 ；9 :ddH20 對照；10 質(zhì)粒 pRE Δ aroA/0RF2。圖10 用引物C1/C2對本發(fā)明中的重組菌株QH0814AaroA/0RF2遺傳穩(wěn)定性的 PCR鑒定。圖中M:DNA Ladder (DL 2，000) ； 1-7 分別為重組菌株的第1代、5代、10代、15 代、20 代、25 代、30 代；8 :PMD-PCV2 基因組；9 :ddH20 對照。 圖11 是本發(fā)明中的重組菌株QH0814 Δ aroA/0RF2分泌表達(dá)0RF2基因的 western-blot鑒定。圖中M 蛋白Ladder ； 1-2 重組菌株；3 親本菌株QH0814對照。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不是限制本發(fā)明。實(shí)施例11、引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增根據(jù)已報道的支氣管敗血波氏桿菌RB50株全基因組序列(參照GenBank登錄號為AF315119的基因序列)設(shè)計(jì)兩對引物(所有引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)分別擴(kuò)aroA基因的上游同源臂和下游同源臂，擴(kuò)增片段大小分別為1388bp和138;3bp， 上游臂兩端分別設(shè)計(jì)KpnI和MlI酶切位點(diǎn)，下游臂兩端分別設(shè)計(jì)HindIII和McI酶切位點(diǎn)。根據(jù)已報道的豬圓環(huán)病毒2型WH株全基因組序列(參照GenBank登錄號為FJ598044 的基因序列)設(shè)計(jì)一對引物擴(kuò)增0RF2基因，擴(kuò)增片段大小為582bp，兩端分別設(shè)計(jì)MlI和 HindIII酶切位點(diǎn)。所述引物序列如下表1:PCR 引物
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株，其特征在于該菌株于2011年3月M日已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號CCTCC NO M2011093，保藏命名支氣管敗血波氏桿菌QH0814AaroA/0RF2。
2.按權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株，其特征在于該菌株缺失了支氣管敗血波氏桿菌對芳香族氨基酸代謝所必須的 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶aroA基因，并含有能在該菌株基因組中穩(wěn)定表達(dá)的豬 2型圓環(huán)病毒0RF2基因，該菌株具有針對豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌的免疫保護(hù)力。
3.按權(quán)利要求1或2所述的一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌，其特征在于應(yīng)用所述一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌制備基因工程疫苗。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的一種表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒0RF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌，其特征在于所述的重組支氣管敗血波氏桿菌株QH0814AaroA/0RF2在制備豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌病疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
一種不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒ORF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株的構(gòu)建、疫苗的制備與應(yīng)用，屬基因工程領(lǐng)域。得到一株不含抗性標(biāo)記的表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒ORF2基因片段的重組支氣管敗血波氏桿菌株QH0814ΔaroA/ORF2。該菌株缺失了支氣管敗血波氏桿菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)基因，含有豬2型圓環(huán)病毒ORF2基因片段。公開了該重組株及疫苗的制備以及在制備豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的基因工程疫苗可以刺激豬產(chǎn)生抵抗豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌野毒株的保護(hù)性免疫反應(yīng)，能有效防止豬2型圓環(huán)病毒和豬源支氣管敗血波氏桿菌的感染。
文檔編號C12N15/34GK102199571SQ20111008515
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者何啟蓋, 余騰, 劉文靜, 吳斌, 吳磊, 夏欣, 李倫勇, 湯細(xì)彪, 胡睿銘, 金梅林, 陳冬煥, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司