專利名稱：一種用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase，EC3. 1. 1. 3)，又稱甘油酯水解酶，可作用于脂肪分子中的羧酸酯鍵，催化脂肪水解為脂肪酸和二酰甘油、單酰甘油或甘油，也可催化甘油酯及水不溶性酯類的醇解、酯化、酯交換以及合成等反應(yīng)。催化反應(yīng)不需要輔酶，且反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少， 反應(yīng)通常具有高度立體異構(gòu)專一性和化學(xué)選擇性。脂肪酶廣泛存在于自然界中，是最早被研究的酶類之一。20世紀(jì)初國外的研究人員首次發(fā)現(xiàn)了微生物脂肪酶，由于微生物資源豐富，同時(shí)微生物脂肪酶相對(duì)于動(dòng)物、植物脂肪酶而言，具有種類繁多、反應(yīng)條件和底物的專一性類型廣泛、便于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)、容易獲得高純度的酶制劑以及制取成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因而微生物脂肪酶研究受到各國研究人員的廣泛關(guān)注，并極大的帶動(dòng)了其在基礎(chǔ)和實(shí)際應(yīng)用方面的的研究。由于國內(nèi)產(chǎn)脂肪酶的方法大多還是液態(tài)產(chǎn)脂肪酶，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的報(bào)道較少，因此，用篩選得到的產(chǎn)脂肪酶菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶，不僅可作為今后生產(chǎn)和工業(yè)化生產(chǎn)上的出發(fā)菌株，而且也為脂肪酶基因的克隆、工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決菌種在固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)脂肪酶的問題，而采用在油廠附近土壤里提取出的菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶。用油廠附近的土壤來提取菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將從大慶油廠附近的土壤，取2g 土樣與9ml無菌水混合，加玻璃珠振蕩搖勻后靜置片刻，取5ml上清液加入到富集培養(yǎng)基中，28°C 31°C，160r/min 190r/min振蕩培養(yǎng)2d 5d。取IOml培養(yǎng)液加到另一新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，重復(fù)此操作兩次后，涂布在含有溴甲酚紫的固態(tài)脂肪酶篩選平板上。^TC倒置培養(yǎng)4d 5d， 可觀察到菌落周圍形成黃色變色圈，表明該菌株可產(chǎn)脂肪酶。并篩選生長狀況良好的菌株 5株；二、將初篩到的5株菌株純化后的斜面菌株接種至脂肪酶液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，按 0. 3%的接種量將液體菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，將三角瓶置于 31°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，結(jié)果測(cè)得發(fā)酵液中XjA的脂肪酶活力最高，為3. lU/ml ；將XjA轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)2d 5d，再將菌株以同樣的接種量(0.3%)轉(zhuǎn)接到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)種齡為3 時(shí)脂肪酶活力最高為1450U/g，確定產(chǎn)酶量最高的菌株為XjA ；三、把篩選得到產(chǎn)酶量最高的菌株XjA進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，分別考查了當(dāng)碳氮比為0 5，1 4,2 3,3 2,4 1， 5 0，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1.5,1 2,1 2. 5 (培養(yǎng)基水)，發(fā)酵溫度為25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件；四、在最佳碳氮比、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的條件下接入XjA菌株， 固體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，對(duì)此時(shí)生產(chǎn)出的脂肪酶檢測(cè)其活力，并測(cè)定此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)出的脂肪酶活
4力為 1450U/g。在采用固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)脂肪酶的方法中，由于水分活度低，基質(zhì)水不溶性高，微生物易生長，酶活力高，而且固態(tài)基質(zhì)中氣、液、固三相并存的優(yōu)勢(shì)，因此，本文篩選的脂肪酶菌株可作為今后生產(chǎn)和工業(yè)化生產(chǎn)上的出發(fā)菌株，為脂肪酶基因的克隆、工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一用油廠附近的土壤來提取菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將從大慶油廠附近的土壤，取2g 土樣與9ml無菌水混合，加玻璃珠振蕩搖勻后靜置片刻，取5ml上清液加入到富集培養(yǎng)基中 3rC，160r/min 190r/min 振蕩培養(yǎng)2d 5d。取IOml培養(yǎng)液加到另一新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，重復(fù)此操作兩次后，涂布在含有溴甲酚紫的固態(tài)脂肪酶篩選平板上。^TC倒置培養(yǎng)3d 5d，可觀察到菌落周圍形成黃色變色圈，表明該菌株可產(chǎn)脂肪酶。并篩選生長狀況良好的菌株5株；二、 將初篩到的5株菌株純化后的斜面菌株接種至脂肪酶液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，按0. 3%的接種量將液體菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，將三角瓶置于26°C 33°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)， 結(jié)果測(cè)得發(fā)酵液中XjA的脂肪酶活力最高，為3. lU/ml ；將XjA轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)2d 5d，再將菌株以同樣的接種量(0.3%)轉(zhuǎn)接到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)種齡為36h時(shí)脂肪酶活力最高為1450U/g，確定產(chǎn)酶量最高的菌株為XjA ；三、把篩選得到產(chǎn)酶量最高的菌株XjA進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，分別考查了當(dāng)碳氮比為0 5，1 4，2 3,3 2,4 1， 5 0，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1，1 1.5，1 2，1 2. 5 (培養(yǎng)基水)，發(fā)酵溫度為25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件；四、在最佳碳氮比、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的條件下接入XjA菌株， 固體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，對(duì)此時(shí)生產(chǎn)出的脂肪酶檢測(cè)其活力，并測(cè)定此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)出的脂肪酶活力為 1450U/g。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟一中將土壤與水混合后的上清液在富集培養(yǎng)基中，以 30°C，160r/min 180r/min振蕩培養(yǎng)2d 5d。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟一中將土壤與水混合后的上清液在富集培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)3d 5d，^rc倒置培養(yǎng)4d 5d。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟二中將初篩到的5株菌株，按0. 3 %的接種量將液體菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，置于^TC 31°C培養(yǎng)箱中振蕩。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟二中將將XjA 轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)3d 5d。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中在調(diào)節(jié)碳氮比為 1 4，2 3,3 2,4 1，培養(yǎng)基含水量為 1 0. 5，1 1，1 1. 5，1 2，1 2. 5， 發(fā)酵溫度為25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d等固態(tài)發(fā)酵參數(shù)。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中將調(diào)節(jié)碳氮比為1 4，2 3,3 2,4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1.5，發(fā)酵溫度在 25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間Id 8d等固態(tài)發(fā)酵參數(shù)。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)碳氮比為1 4，2 3，3 2，4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1.5，發(fā)酵溫度在27°C 31°C，發(fā)酵時(shí)間Id 8d，等固態(tài)發(fā)酵參數(shù)。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟三中調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)碳氮比為1 4，2 3，3 2，4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1.5，發(fā)酵溫度在27°C 31°C，發(fā)酵時(shí)間2d 5d等固態(tài)發(fā)酵參數(shù)。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟四中選用最佳固態(tài)發(fā)酵參數(shù)產(chǎn)脂肪酶，并測(cè)定其脂肪酶活力。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.一種在大慶日月星油廠附近土壤里提取出的菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于用大慶日月星油廠附近土壤篩選得到的菌株固態(tài)發(fā)酵的方法產(chǎn)脂肪酶，其最佳發(fā)酵參數(shù)的確定通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、將從大慶油廠附近的土壤，取2g 土樣與9ml無菌水混合，加玻璃珠振蕩搖勻后靜置片刻，取5ml上清液加入到富集培養(yǎng)基中，28°C 31°C，160r/ min 190r/min振蕩培養(yǎng)2d 5d。取IOml培養(yǎng)液加到另一新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，重復(fù)此操作兩次后，涂布在含有溴甲酚紫的固態(tài)脂肪酶篩選平板上。^rc倒置培養(yǎng) 4d 5d，可觀察到菌落周圍形成黃色變色圈，表明該菌株可產(chǎn)脂肪酶。并篩選生長狀況良好的菌株5株；二、將初篩到的5株菌株純化后的斜面菌株接種至脂肪酶液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，按0. 3%的接種量將液體菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，將三角瓶置于 31°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，結(jié)果測(cè)得發(fā)酵液中XjA的脂肪酶活力最高，為3. lU/ml ；將XjA轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)2d 5d，再將菌株以同樣的接種量(0.3% )轉(zhuǎn)接到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)。當(dāng)種齡為36h時(shí)脂肪酶活力最高為1450U/g，確定產(chǎn)酶量最高的菌株為 XjA ；三、把篩選得到產(chǎn)酶量最高的菌株XjA進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，分別考查了當(dāng)碳氮比為0 5，1 4,2 3， 3 2,4 1,5 0，培養(yǎng)基含水量為 1 0. 5，1 1，1 1. 5，1 2，1 2. 5 (培養(yǎng)基 水)，發(fā)酵溫度為25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件；四、在最佳碳氮比、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的條件下接入XjA菌株，固體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，對(duì)此時(shí)生產(chǎn)出的脂肪酶檢測(cè)其活力，并測(cè)定此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)出的脂肪酶活力為1450U/g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟一中將土壤與水混合的5ml上清液加入到培養(yǎng)基中，28°C 31°C，160r/min 180r/min振蕩培養(yǎng)2d 5d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟一中將土壤與水混合的5ml上清液加入到培養(yǎng)基中，28°C 31°C，160r/min 180r/min振蕩培養(yǎng)3d 5d。取IOml培養(yǎng)液加到另一新鮮富集培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，重復(fù)此操作兩次后，涂布在含有溴甲酚紫的固態(tài)脂肪酶篩選平板上。^TC倒置培養(yǎng)3d 5d， 可觀察到菌落周圍形成黃色變色圈，表明該菌株可產(chǎn)脂肪酶。并篩選生長狀況良好的菌株 5株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟二中將按0. 3%的接種量將液體菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，將三角瓶置于 ^TC 31°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，結(jié)果測(cè)得發(fā)酵液中XjA的脂肪酶活力最高，為3. lU/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟二中將按0. 3%的接種量將液體菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，將三角瓶置于 ^TC 31°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，結(jié)果測(cè)得發(fā)酵液中XjA的脂肪酶活力最高，為3. lU/ml，將 XjA轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)3d 5d，再將菌株以同樣的接種量(0.3%)轉(zhuǎn)接到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟三中將在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，當(dāng)碳氮比為1 4，2 3,3 2,4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1，1 1. 5，1 2，(1 2.5(培養(yǎng)基水)，發(fā)酵溫度為25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟三中將在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，當(dāng)碳氮比為1 4，2 3，3 2，4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1. 5，(培養(yǎng)基水)，發(fā)酵溫度為25°C 33°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟三中將在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，當(dāng)碳氮比為1 4，2 3,3 2,4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1. 5，(培養(yǎng)基水)，發(fā)酵溫度為27°C 31°C，發(fā)酵時(shí)間為Id 8d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟三中將在種齡為36h，以0. 3%接種量，在碳源和氮源為麩皮和豆粕的培養(yǎng)基上，當(dāng)碳氮比為1 4，2 3,3 2,4 1，培養(yǎng)基含水量為1 0. 5，1 1,1 1. 5，(培養(yǎng)基水)，發(fā)酵溫度為27°C 31°C，發(fā)酵時(shí)間為2d 5d時(shí)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的活力，確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用油廠土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，其特征在于步驟四中在最佳的固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)脂肪酶，對(duì)此時(shí)生產(chǎn)出的脂肪酶檢測(cè)其活力，并測(cè)定此時(shí)發(fā)酵產(chǎn)出的脂肪酶活力為1450U/g。
全文摘要
一種用大慶日月星油廠附近土壤中篩選的菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的方法，本發(fā)明涉及采用篩選分離的方法從土壤中提取產(chǎn)脂肪酶的菌株，并對(duì)其采用固態(tài)發(fā)酵的方法生產(chǎn)脂肪酶。將分離純化后的該菌接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在此過程中確定產(chǎn)脂肪酶獲利最高的發(fā)酵參數(shù)在種齡36h，接種量0.3％的脂肪酶固態(tài)發(fā)酵條件下，麩皮和豆粕的比為1∶4，含水量為50％(V/W)，發(fā)酵溫度29℃，發(fā)酵時(shí)間3d。此時(shí)，固態(tài)培養(yǎng)基中脂肪酶的活力可達(dá)1450U/g。
文檔編號(hào)C12N9/20GK102191232SQ20111008248
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者于殿宇, 劉晶, 張佳寧, 徐速, 時(shí)敏, 李志平, 李越, 江連洲, 陳曉惠, 韓春然 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)