專利名稱：一種洛伐他汀的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及一種洛伐他汀的制備方法，尤其涉及一種通過發(fā)酵法制備洛伐他汀的方法。
背景技術(shù)：
洛伐他汀(Iavostatin)是HMG-CoA (3_羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A)還原酶抑制劑(HMG-CoA-RI)類微生物藥物，它可以有效的降低冠心病和心肌梗塞的發(fā)病率和死亡率。洛伐他汀主要用土曲霉(aspergillus terreus)和紅曲霉(monascus rubber)經(jīng)深層發(fā)酵制取。紅曲霉在我國有著廣泛的應(yīng)用，紅曲霉(monascus rubber)不僅產(chǎn)生洛伐他汀(也稱莫那可林K，monacolin K)，而且產(chǎn)生據(jù)推測為洛伐他汀生物合成的中間產(chǎn)物的聚酮類物質(zhì)莫那可林J、L、X，這些物質(zhì)都是HMG-CoA-RI類物質(zhì)，具有很強的降低膽固醇、調(diào)節(jié)血 脂的功能。土曲霉是現(xiàn)在國內(nèi)生產(chǎn)洛伐他汀的原始出發(fā)菌，它具有優(yōu)良的發(fā)酵性能、較高的洛伐他汀產(chǎn)生能力、成熟的發(fā)酵工藝。但是目前生產(chǎn)中普遍存在產(chǎn)量偏低、生產(chǎn)成本偏高等問題。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種洛伐他汀的制備方法，從而有效提高產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的一種洛伐他汀的制備方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對土曲霉菌種進(jìn)行發(fā)酵以獲得洛伐他汀的步驟，其特征在于，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸。優(yōu)選的，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸，所述苯丙氨酸的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)基的0.001-0. 05% (w/w)，優(yōu)選的為0.01-0.03% (w/w)，所述酪氨酸的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)基的0.005-0. 05% (w/w)，優(yōu)選的為0.01-0. 03% (w/w) 0根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，在發(fā)酵的過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸，添加時間為發(fā)酵后的0-110小時，更優(yōu)選的為發(fā)酵后72-96小時。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式，在發(fā)酵的過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸，添加時間為發(fā)酵后的0-110小時，更優(yōu)選的為發(fā)酵后0-96小時。申請人:發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中，添加苯丙氨酸和/或酪氨酸，均能提高洛伐他汀的產(chǎn)量，但是在發(fā)酵后的上述添加時間加入苯丙氨酸和/或酪氨酸，效果更好。其它發(fā)酵的條件本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)常規(guī)發(fā)酵方法進(jìn)行選擇。例如，可在發(fā)酵藥瓶中，以200r/min在26± I°C的旋轉(zhuǎn)式搖床中進(jìn)行發(fā)酵180-230小時。本發(fā)明的洛伐他汀的制備方法中，通常還包括在發(fā)酵之前將菌種在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，然后再將培養(yǎng)后獲得的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵。優(yōu)選的，在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為在在溫度26±1°C下培養(yǎng)90-96h。優(yōu)選的，將培養(yǎng)后獲得的種子液以5-15%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的洛伐他汀的制備方法中，通常還包括在發(fā)酵之后對發(fā)酵液進(jìn)行分離提純的步驟。例如對發(fā)酵液進(jìn)行過濾、萃取、結(jié)晶、干燥，以獲得洛伐他汀成品。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，可以先將菌種接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度26土 1°C下培養(yǎng)90-96h，然后按10%接種量將培養(yǎng)后獲得的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，200r/min，26土 1°C旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵后0_96小時的過程中，添加占發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比的0. 001-0. 05%的已滅菌苯丙氨酸，或者在發(fā)酵后0-110小時的過程中，添加占發(fā)酵培養(yǎng)基的重量百分比的0. 005-0. 05%已滅菌的酪氨酸。培養(yǎng)216h ;將所得發(fā)酵液按常規(guī)處理，過濾、萃取、結(jié)晶、干燥，即得洛伐他汀成品。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基可以按照常規(guī)配制方法進(jìn)行配制。例如，發(fā)酵培養(yǎng)基可以為(按重量百分比計)20%葡萄糖，4%豆柏，0.5%麥精，1%蛋白胨，0. 1% NaCl，0.05%MgSO4,0. 05% KH2PO4,0. 1% NaNO3,余量為水，pH6. 8。本申請的發(fā)明人在研究提高洛伐他汀產(chǎn)量的過程中驚奇的發(fā)現(xiàn)，向土曲霉的發(fā)酵 培養(yǎng)基中加入苯丙氨酸和/或酪氨酸，能顯著提高洛伐他汀的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。除特別說明外，以下實施例中所使用的％、％。均為重量比。在本發(fā)明的實施例中，將土曲霉菌(Aspergillus terreus)斜面(即菌種)接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中，26±0. 5°C搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，周期90-96小時；按10%接種量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基按常規(guī)配制方法配制，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為20%葡萄糖，4%豆柏，0. 5%麥精，1%蛋白胨，0. 1% NaCl,0. 05% MgSO4,0. 05% KH2PO4,0. 1% NaNO3，余量為水，PH6.8，發(fā)酵溫度為26±1°C。在本發(fā)明的實施例中，洛伐他汀的含量測定采用HPLC進(jìn)行檢測。實施例I添加苯丙氨酸對洛伐他汀產(chǎn)量的影響I. I苯丙氨酸的添加量對洛伐他汀生物合成的影響配制洛伐他汀的發(fā)酵培養(yǎng)基，向洛伐他汀發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入重量比如表I所示的苯丙氨酸，同時，以不添加苯丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)發(fā)酵培養(yǎng)216小時后,取樣測定洛伐他汀的含量。結(jié)果如表I所
/Jn o表I、添加苯丙氨酸對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
苯丙氨酸加量(％ ) ~0 ~0.001 ~0. 01 ~0. 02 ~003~~0. 04 ~005~
相對含量100 105 120 U9 U7109 UO由表I的結(jié)果可見，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸可明顯提高洛伐他汀的生物合成，優(yōu)選的加量范圍為0. 01-0. 03%I. 2苯丙氨酸的添加時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響配制洛伐他汀的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入土曲霉菌(Aspergillus terreus)發(fā)酵培養(yǎng),分別在0、24、48、72、96、110小時向培養(yǎng)基中添加重量比為0. 01%的苯丙氨酸，同時，以不加
苯丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，總發(fā)酵時間216小時，取樣測定洛伐他汀的含量。結(jié)果如表2所示。表2、苯丙氨酸的添加時間對洛伐他汀產(chǎn)量的影響
權(quán)利要求
1.一種洛伐他汀的制備方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對土曲霉菌種進(jìn)行發(fā)酵以獲得洛伐他汀的步驟，其特征在于，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述苯丙氨酸的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)基的O. 001-0. 05% (w/w)，更優(yōu)選的為發(fā)酵培養(yǎng)基的O. 01-0. 03% (w/w);所述酪氨酸的添加量為發(fā)酵培養(yǎng)基的O. 005-0. 05% (w/w)，更優(yōu)選的為O. 01-0. 03% (w/w) 0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵條件為在26±1°C的條件下發(fā)酵.180-230 小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的制備方法，其特征在于，在發(fā)酵的過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸，添加時間為發(fā)酵后的0-110小吋，更優(yōu)選的為發(fā)酵后的72-96小吋。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的制備方法，其特征在于，在發(fā)酵的過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酪氨酸，添加時間為發(fā)酵后的0-110小吋，更優(yōu)選的為發(fā)酵后0-96小吋。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，洛伐他汀的制備方法中，還包括在發(fā)酵之前將菌種在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，然后再將培養(yǎng)后獲得的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為在在溫度26 ± I °C下培養(yǎng)90-96h。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，將培養(yǎng)后獲得的種子液以5-15%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，洛伐他汀的制備方法還包括在發(fā)酵之后對發(fā)酵液進(jìn)行分離提純的步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基為(按重量百分比計).20% 葡萄糖、4%豆柏、O. 5%麥精、I % 蛋白胨、O. 1% NaCUO. 05% MgS04、0. 05% KH2PO4'.O.1% NaNO3、余量為水，pH6. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種洛伐他汀的制備方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中對土曲霉菌種進(jìn)行發(fā)酵以獲得洛伐他汀的步驟，其特征在于，在發(fā)酵過程中向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了苯丙氨酸和/或酪氨酸。本發(fā)明的制備方法有效提高洛伐他汀的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P17/06GK102676602SQ201110065430
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者任清華, 劉守強, 周淑梅, 孔德周, 張宏周, 時新生, 朱義彬, 李武德, 王青 申請人:河南天方藥業(yè)股份有限公司