專利名稱：一種香蕉穿孔線蟲特異性lamp檢測方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病害的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，特別涉及一種香蕉穿孔線蟲特異性 LAMP檢測引物及LAMP快速分子檢測方法
背景技術(shù)：
香蕉穿孔線蟲(Radopholus similis)，，又名相似穿孔線蟲，它是一種具有毀滅性的外來入侵植物檢疫性有害線蟲，是我國對外植物檢疫對象之一。香蕉穿孔線蟲 (Radopholus similis)寄主范圍也非常廣泛，目前已報道的寄主多達360多種，主要分布在在熱帶及亞熱帶地區(qū)。近年來，隨著國際貿(mào)易和出國旅游日趨頻繁，從香蕉穿孔線蟲疫區(qū)國家或地區(qū)引進各種花卉苗木及種質(zhì)材料的種類和數(shù)量迅速增加，因此由寄主植物攜帶而將該線蟲傳入中國的可能性和傳入風(fēng)險日益劇增。近年來在我國各口岸多批次截獲香蕉穿孔線蟲。由于該線蟲的寄主植物在中國廣泛分布，一旦入侵后將給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來毀滅性的打擊和造成嚴(yán)重的損失。一旦香蕉穿孔線蟲擴散到田野，則極易定殖和流行。這將給中國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。在香蕉穿孔線蟲的鑒定與檢測方面，往往以形態(tài)鑒定為主，但因為形態(tài)特征細微復(fù)雜，變化幅度較大及表型特征不穩(wěn)定問題，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定往往比較困難，導(dǎo)致誤診，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定過程耗時、費力，需要專業(yè)人士操作，且需要大量線蟲樣本，在單頭線蟲水平上不能達到要求。在PCR技術(shù)上建立起來的分子鑒定方法，一定程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定上的缺陷。目前已有一些利用分子和生化方法鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，如RFLP、一步雙重 PCR和熒光定量PCR。在植物檢疫領(lǐng)域中，DNA分子標(biāo)記是目前線蟲學(xué)研究中發(fā)展較快的一種鑒定手段。線蟲種特異性引物PCR擴增檢測或雙重PCR擴增檢測是近年重要植物線蟲分子診斷的重要進展之一。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。如Mulholland et al. (1996)分別構(gòu)建了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的特異性引物，描述了一種基于rDNA-ITS區(qū)域特異性等位多重PCR技術(shù)檢測這兩種線蟲的方法，能快速鑒定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其復(fù)合種群。與標(biāo)準(zhǔn)的PCR途徑不同，這一技術(shù)在每個PCR反應(yīng)中應(yīng)用了 3個引物，通用引物5. SSrRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物 ITSl-Gr和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITSl-Gp。Bulman & Marshall (1997)成功應(yīng)用多重PCR技術(shù)快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-ITS的序列結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，構(gòu)建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSrf和白線蟲的特異性引物PITSp4，通用引物ITS5與PITSr3可以擴增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與PITSp4可以擴增出265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應(yīng)中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5這3個引物，即使復(fù)合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從復(fù)合種群檢測出金線 蟲。歐師琪、彭德良(0u SQ, Peng DL, 2008)設(shè)計構(gòu)建了大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物SCNFI和SCNRI，發(fā)明了大豆孢囊線蟲的一步雙重PCR檢測方法，檢測的特異性片段長度為494bp，建立快速準(zhǔn)確檢測和早期診斷大豆孢囊線蟲的分子生物學(xué)方法和技術(shù)規(guī)程， 可以檢測大豆孢囊線蟲單個孢囊、單頭二齡幼蟲和雄蟲，該項檢測技術(shù)獲得國家發(fā)明專利 (ZL200510012246. 1). 宛飛、彭德良等(2008)根據(jù)馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS區(qū)的序列特征，對我國甘薯莖線蟲兩個不同型群體各設(shè)計了一對特異性引物。A型甘薯莖線蟲特異引物為DDSl/ DDS2，特異擴增片段為252bp ；B型甘薯莖線蟲特異引物為DDL1/DDL2，特異擴增片段為 485bp ；引入線蟲通用引物D3A/D3B作內(nèi)標(biāo)，研究出一步雙重PCR特異性檢測甘薯莖線蟲不同類型群體的分子技術(shù)和方法，該分子檢測技術(shù)具有特異性強、方法可靠、靈敏性高、操作簡便，檢測的精確度達到單條線蟲的水平。目前在香蕉穿孔線蟲的分子檢測方面也進行了基于PCR技術(shù)的相關(guān)研究。1996年 KaplanD. T.等篩選380個隨機引物，從基因組DNA中找到6條差異片段，克隆、測序后設(shè)計了一對24bp的特異性引物，可特異擴增Radopholus similis，。Falls et al. (1996)利用 PCR方法擴增rDNA片段來比較兩個ITS區(qū)及5. 8S基因?；趓DNA片段的RFLPs可用于比較全世界不同的香蕉種植區(qū)域的10個香蕉穿孔種群。Elbadri et al. (2002)也對香蕉穿孔線蟲的rDNA-ITS做了相關(guān)研究，通過研究穿孔線蟲(R. . similis)種內(nèi)rDNA-ITS的變異，測定ITS序列并進行RFLP分析發(fā)現(xiàn)，香蕉穿孔線蟲種內(nèi)ITS序列穩(wěn)定，變異很小。但穿孔線蟲(Radopholus)屬的不同種間ITS存在差異。國外的研究表明，曾經(jīng)認(rèn)為是香蕉穿孔線蟲的一個來自澳大利亞種群，經(jīng)過對rDNA-ITS序列特征和RFLP分析研究，發(fā)現(xiàn)該群體實際上是香蕉穿孔線蟲的近緣種，最近重新命名和描述為澳洲穿孔線蟲新種(Radopholus musicola)、來自越南榴蓮和咖啡根系的兩個穿孔線蟲群體雖然與香蕉穿孔線蟲及其近似， 但rDNA-ITS序列和RFLP酶譜都存在差異，分別描述為“榴蓮穿孔線蟲新種(Radopholus duriophilus)和阿拉伯咖啡穿孔線蟲新種(Radopholus arabocoffeae)。近年的分子和細胞遺傳學(xué)證據(jù)表明，香蕉穿孔線蟲與柑桔穿孔線蟲為同一個種。近年來，我國口岸多年多次截獲香蕉穿孔線蟲，國內(nèi)相關(guān)單位加大了對香蕉穿孔線蟲的檢疫檢驗力度，相繼開展了香蕉穿孔線蟲的分子特征等相關(guān)研究。葛建軍等根據(jù)NCBI已登錄的香蕉穿孔線蟲序列聚類比對后根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計出穿孔線蟲屬 (Radopholus)水平上的特異性引物Rl、R2(Rl/2)和香蕉穿孔線蟲種水平上的特異性引物 RSURS2 (RS1/2)進行雙重PCR擴增香蕉穿孔線蟲，檢測精度可達單條水平和實時熒光定量 PCR檢測單頭香蕉穿孔線蟲技術(shù)；但是沒有從罹病植物組織中檢測香蕉穿孔線蟲。周春娜謝輝等(2006)等利用國外的通用引物研究了香蕉穿孔線蟲rDNA-ITS，沒有涉及特異性引物。彭德良等根據(jù)我國多個口岸截獲的香蕉穿孔線ITS克隆測序結(jié)果設(shè)計出香蕉穿孔線蟲特異性引物對(RsFl和RsRl)，以此開發(fā)出能夠從罹病植物組織中檢測香蕉穿孔線蟲技術(shù)， 檢測精度可達單條水平，同時也開發(fā)出實時熒光定量PCR檢測單頭香蕉穿孔線蟲技術(shù)。目前PCR特異性檢測技術(shù)仍然需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)(紫外儀)等昂貴的專業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專業(yè)實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以檢測，限制了 PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。循環(huán)恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，簡稱 LAMP)是 2000年由日本榮研株式會社Notomi等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴增技術(shù)。LAMP 反應(yīng)針對靶基因的6個位點設(shè)計出4條引物，利用一種鏈?zhǔn)街脫Q活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在恒溫條件下(°C左右)保溫10-90分鐘，即可完成擴增反應(yīng)。由于LAMP 反應(yīng)的高效性和等溫快速擴增的特點，在90分鐘內(nèi)可將靶基因擴增109-101(1。LAMP擴增產(chǎn)物的檢測一般采用熒光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀察等方法。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟等特征。因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原線蟲檢測中報道極少，目前僅2009 年日本Kikuchi開發(fā)出松材線蟲LAMP快速檢測體系，能在1小時內(nèi)檢測到松材線蟲，其它植物線蟲以及香蕉穿孔線蟲的LAMP國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了針對上述領(lǐng)域中的缺陷，提供一種應(yīng)用恒溫擴增技術(shù)檢測罹病植物中檢測香蕉穿孔線蟲的方法，以建立了一種不需要PCR儀的香蕉穿孔線蟲的早 期快速準(zhǔn)確檢測和診斷的分子生物學(xué)方法，可以檢測罹病植物組織中的香蕉穿孔線蟲，達到早檢測、早治理和早控制的效果，克服已有PCR檢測香蕉穿孔線蟲不能在生產(chǎn)一線應(yīng)用的問題。一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測方法，其特征在于其中的LAMP反應(yīng)體系中所使用的引物分別是RSF3 5’ -AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3 ’，RSB3 5，-AACGCCAGAACGCACAAC-3，，RSFIP 5，-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3，，RSBIP :5，-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3，，RSLF 5’ -AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3 ’。所述LAMP反應(yīng)體系包括引物混合液、反應(yīng)混合液和IyL DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μ L，所述引物混合液為外側(cè)引物RSF3和RSB3各0. 2 μ Μ，內(nèi)側(cè)引物RSFIP和 RSBIP各 1. 6 μ Μ，環(huán)引物 RSLF 為 0. 4 μ M ；所述反應(yīng)混合液為 20mM Tris-HCl，IOmM (NH4) 2S04, IOmM KCl, 8mM MgSO4,0. 1% Triton X-100,0. 8Μ Betaine, 1. 4mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段。所述LAMP反應(yīng)的條件為在61-65°C保溫30_90min，82°C保溫5-lOmin。所述LAMP反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物中加入有顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I與 PCR級DMSO混合液，其體積比為1:9。所述DNA模板為從罹病香蕉穿孔線蟲病的植物組織中提取。所述提取的方法為截取0. 2-0. 5cm長的罹病植物組織放入裝有48 μ L的LA緩沖液的離心管中，加入2 μ L的LB提取液，混合均勻后離心，放入液氮中速凍，用研磨棒將其搗碎，點動離心后將離心管放入65°C條件下溫育45min，95°C下反應(yīng)lOmin，冷卻至室溫，點動離心后的上清液即可作為線蟲DNA模板，所述LA提取液為IOOmM NaCl, IOOmM Tris-HCl (pH 8. 5), 50mM EDTA (pH 7. 4),1% SDS混合液和占總體積比為巰基乙醇組成，LB提取液為 20mg/mL蛋白酶K。一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測試劑盒，包括1)引物混合液外側(cè)弓I物RSF3和RSB3各0. 2 μ M，內(nèi)側(cè)引物RSFIP和RSBIP各 1. 6 μ Μ，環(huán)引物 RSLF 為 0. 4 μ M2)反應(yīng)混合液
20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4, 0.1 % Triton X-100， 0. 8MBetaine, 1. 4mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段(New England Biolabs)試劑盒中還包括顯色劑，所述顯色劑為SYBR green I與PCR級DMSO混合液，體積比為1 9。試劑盒中還包括從罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取試劑，由LA提取液和LB 提取液組成，所述 LA 提取液由 IOOmM NaCl, IOOmM Tris-HCl(pH 8. 5), 50mM EDTA (pH7. 4)， 1 % SDS混合液和單獨分裝的占總體積比為1 %巰基乙醇組成，LB提取液為20mg/mL蛋白酶 K0
上述香蕉穿孔線蟲特異性LAMP分子檢測方法或上述試劑盒在診斷植物、土壤的香蕉穿孔線蟲感染情況或鑒別香蕉穿孔線蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題主要采取的技術(shù)方案包括以下三個部分1、提供了從罹病植物中提取香蕉穿孔線蟲的試劑和方法，其中試劑主要為LA提取液和LB提取液兩種，采用6°C溫浴45min，9°C溫浴IOmin即可；2、提供了 5條用于檢測香蕉穿孔線蟲的LAMP引物序列，分別命名為 RSBIP、RSFIP、RSF3、RSB3、RSLF，長度分別為 39bp、41bp、19bp、18bp、19bp ； 配制并優(yōu)化了 LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，有利于LAMP以最高效率對樣品進行擴增。3、提供了多種LAMP結(jié)果檢測方法，主要有熒光染料直接目測法、瓊脂糖凝膠電泳法和濁度目測法。具體包括以下步驟1、罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取試劑組分如下LA 提取液IOOmM NaCl, IOOmM Tris-HCl(pH 8. 5), 50mM EDTA (pH 7. 4), 1% SDS, 混合均勻后高溫高壓滅菌，使用時加入巰基乙醇。LB提取液20mg/mL蛋白酶K罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取方法步驟是截取0. 2-0. 5cm長的罹病植物組織放入裝有48 μ L的LA緩沖液的0. 2mL離心管中，加入2μ L的LB提取液，混合均勻后簡單離心，放入液氮中速凍，用研磨棒或?qū)⑵鋼v碎， 反復(fù)2-3次后，點動離心后將離心管放入6°C條件下溫育45min，°C 9反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。如果直接用于香蕉穿孔線蟲的檢測，可采用常規(guī)的方法從香蕉穿孔線蟲體中提取 DNA。2、LAMP弓丨物設(shè)計采用通用引物D2A/D3B擴增出香蕉穿孔線蟲AM種群的rDNA的D2D3 區(qū)，將目的片段克隆到PGEM-T載體中測序獲得香蕉穿孔線蟲D2D3序列如SEQ ID NOl0通過對序列分析比對，選取香蕉穿孔線蟲特異的一段區(qū)域設(shè)計5條LAMP引物RSF3 :5， -AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3，RSB3 :5， -AACGCCAGAACGCACAAC-3，RSFIP :5，-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3，RSBIP :5’ -GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’RSLF :5，-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3，引物序列分別和香蕉穿孔線蟲D2D3序列的相應(yīng)位置的核苷酸序列相同或者互補。3、LAMP反應(yīng)體系配置反應(yīng)體系的總濃度分別為外側(cè)引物RSF3和RSB3各0. 2 μ M， 內(nèi)側(cè)引物 RSFIP 和 RSBIP 各 1. 6 μ Μ，環(huán)引物 RSLF 為 0. 4 μ M，20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1% Triton X-100,0. 8M Betaine, 1. 4mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段(New England Biolabs)，1 μ L DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μ L4、LAMP反應(yīng)擴增條件將上述配制好的反應(yīng)體系放入6°C中保溫60min，°C保溫 5分鐘滅活Bst DNA聚合酶

5,LAMP結(jié)果檢測結(jié)果可以采用以下三種檢測方法1)將上述反應(yīng)完的體系中加入1 μ L的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；2)取1 μ L擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；3)將反應(yīng)后的離心管3000rpm離心30min，陽性的底部可觀察到白色沉淀。本發(fā)明優(yōu)選顯色劑方式。本發(fā)明所提供的香蕉穿孔線蟲LAMP快速檢測技術(shù)具有其他檢測方法所無法比擬的優(yōu)點1、特異性強，所采用的引物根據(jù)香蕉穿孔線蟲地理種群的D2D3序列7個位點設(shè)計出5條特異性引物，同時這些引物的順序也是有固定規(guī)則。特異性比常規(guī)PCR要強很多倍。2、靈敏度高，對香蕉穿孔線蟲的檢測極限可低至1/20000條。比常規(guī)PCR檢測香蕉穿孔線蟲高100以上3、檢測快速，整個反應(yīng)不要在溫度變化上浪費時間，擴增過程只需要Ih即可完成，比常規(guī)PCR要節(jié)省2-4h4、經(jīng)濟性強，不需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)和昂貴的分子試劑，只需要一個水浴鍋即可完成擴增檢測，結(jié)果肉眼直接可見，有利于生產(chǎn)實踐和基層機構(gòu)中應(yīng)用。5、操作簡便，結(jié)果明顯，整個過程不需要復(fù)雜的儀器和設(shè)備，稍具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可完成。結(jié)果清晰明顯，肉眼即可觀察結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。6、對人和環(huán)境友好，檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環(huán)境非常安全。綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有PCR技術(shù)檢測香蕉穿孔線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性，可以在實際生產(chǎn)中現(xiàn)場應(yīng)用檢測。該技術(shù)可應(yīng)用于對香蕉穿孔線蟲田間土壤樣品及植物上香蕉穿孔線蟲病發(fā)生的早期快速分子檢測，具有實際的應(yīng)用價值。


圖1為香蕉穿孔線蟲rDNA-D2D3序列的LAMP引物設(shè)計示意圖，圖2為LAMP檢測結(jié)果。其中A為加熒光染料檢測結(jié)果，1 陽性結(jié)果，具有綠色熒光，2 陰性對照，為深褐色。其中B為電泳檢測結(jié)果，M :DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara) 1 陽性結(jié)果，為LAMP擴增梯形條帶，2為陰性對照，無擴增產(chǎn)物。圖3為不同地理種群香蕉穿孔線蟲LAMP及普通PCR檢測結(jié)果。A 熒光染色結(jié)果，B 電泳檢測結(jié)果，C 普通PCR檢測結(jié)果。1_7 分別為香蕉穿孔線蟲種群1^乂!12、1 服5、1 !12、1 5!1、1 六11、1 1^5、1 服擴增結(jié)果；8 陰性對照。M :DL2000DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)圖4為香蕉穿孔線蟲LAMP㈧和普通PCR(B)靈敏度電泳檢測結(jié)果。1-7泳道為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10_7倍稀釋香蕉穿孔線蟲0嫩，8泳道為無模板對照。M :DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)圖5為香蕉穿孔線蟲LAMP特異性檢測結(jié)果。A 熒光染色結(jié)果，B 電泳檢測結(jié)果。第1管或第1泳道為香蕉穿孔線蟲AM種群擴增結(jié)果；2-12 分別為植物寄生線蟲 PXM、PGMpra, JOl、USA. pra、Maco pra、DdCL、SCNGS, CCNGS, ΒΧ、ΒΜ、BD 種群 DNA 擴增結(jié)果，M :DL2000DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)圖6為罹病植物中香蕉穿孔線蟲LAMP檢測結(jié)果，A 熒光染色結(jié)果，B 電泳檢測結(jié)果。1 無菌水為陰性對；2-4 分別為從罹病紅掌根和培養(yǎng)香蕉穿孔線蟲中直接提取的的香蕉穿孔線蟲DNA及以香蕉穿孔線蟲AM種群單頭 DNA擴增結(jié)果，M :DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)圖7為罹病植物中香蕉穿孔線蟲LAMP特異性檢測結(jié)果。A 熒光染色結(jié)果，B 電泳檢測結(jié)果。1-2管或泳道分別為從接種香蕉穿孔線蟲胡蘿卜和感染了香蕉穿孔線蟲的紅掌根中直接提取的香蕉穿孔線蟲DNA擴增結(jié)果，3-5分別為培養(yǎng)短體線蟲PLD種群的的胡蘿卜，甘薯莖線蟲病組織，接種了南方根結(jié)線蟲番茄根的的根結(jié)中直接提取的DNA擴增結(jié)果，6 無模板對照，M :DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)

具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明進行進一步詳細描述。所用的線蟲材料在申請人的實驗室中均有保存，均可以對公眾免費發(fā)放。所用試劑均為市售產(chǎn)品。實驗材料共收集7 個香蕉穿孔線蟲種群(RSXH2、RSSH、RSHZ、RSAM、RSHK、RSHN5、RSRZ5)(表 1)。1個香蕉穿孔線蟲種群樣品(RSSH)為中國檢疫科學(xué)院葛建軍老師惠贈，2個樣品RSSZ 和RSHZ為深圳動植物檢疫局李一農(nóng)老師惠贈，一個樣品RSXH2為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)謝暉老師惠贈，其它種群為本實驗室自行采集。供試香蕉穿孔線蟲均為純培養(yǎng)試驗種群。了表1供試香蕉穿孔線蟲種群及其來源
權(quán)利要求
1.一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測方法，其特征在于其中的LAMP反應(yīng)體系中所使用的引物分別是RSF3 :5’ -AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3，，RSB3 :5’ -AACGCCAGAACGCACAAC-3，，RSFIP :5’ -GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3，，RSBIP :5’ -GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3，，RSLF :5’ -AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述LAMP反應(yīng)體系包括引物混合液、反應(yīng)混合液和IyL DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25 μ L，所述引物混合液為外側(cè)引物RSF3 和RSB3各0. 2μΜ，內(nèi)側(cè)引物RSFIP和RSBIP各1. 6 μ Μ，環(huán)引物RSLF為0. 4μΜ ；所述反應(yīng)混合液為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1 % Triton X-100， 0. 8MBetaine, 1. 4mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，所述LAMP反應(yīng)的條件為在61-65°C溫育 30-90min，82°C保溫 5-lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，所述LAMP反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物中加入有顯色劑， 所述顯色劑為STOR green I與PCR級DMSO混合液，其體積比為1 9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述DNA模板為從罹病香蕉穿孔線蟲病的植物組織中提取。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述提取的方法為截取0.2-0.5cm長的罹病植物組織放入裝有48 μ L的LA緩沖液的離心管中，力卩入2 μ L的LB提取液，混合均勻后離心， 放入液氮中速凍，用研磨棒將其搗碎，點動離心后將離心管放入65°C條件下溫育45min， 95°C下反應(yīng)lOmin，冷卻至室溫，點動離心后的上清液即可作為線蟲DNA模板，所述LA提取液為 IOOmM NaCl，pH 8. 5 的 IOOmM Tris-HCl，pH 7. 4 的 50mM EDTA, 1% SDS 和巰基乙醇組成，LB提取液為20mg/mL蛋白酶K。
7. 一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測試劑盒，包括1)引物混合液外側(cè)引物RSF3和RSB3各0.2μΜ，內(nèi)側(cè)引物RSFIP和RSBIP各1. 6 μ Μ， 環(huán)引物RSLF為0.4 μ Μ，2)反應(yīng)混合液20mMTris-HCl, IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl,8mM MgSO4,0. 1 % Triton X-100,0. 8M Betaine, 1. 4mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括顯色劑，所述顯色劑為STORgreen I與PCR 級DMSO混合液，體積比為1 9。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括從罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取試劑，由LA提取液和LB提取液組成，所述LA提取液由IOOmM NaCl,pH 8. 5的IOOmMTris-HCl， PH 7. 4的50mM EDTA,1% SDS和單獨分裝的占總體積比為巰基乙醇組成，LB提取液為 20mg/mL蛋白酶K。
10.權(quán)利要求1-6任一香蕉穿孔線蟲特異性LAMP分子檢測方法或權(quán)利要求7-9任一試劑盒在診斷植物、土壤中的香蕉穿孔線蟲感染情況或鑒別香蕉穿孔線蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為“一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測方法及其應(yīng)用”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。一種香蕉穿孔線蟲特異性的循環(huán)恒溫擴增(LAMP)檢測方法，其反應(yīng)體系中香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測引物RSF3、RSB3、RSFIP、RSBIP和RSLF，通過對罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲或單頭香蕉穿孔線蟲DNA提取，LAMP等溫擴增，從而快速和特異性檢測香蕉穿孔線蟲。本發(fā)明的檢測方法特異性強、靈敏度高、成本低廉、操作簡便，在香蕉穿孔線蟲現(xiàn)場快速檢測和香蕉穿孔線蟲病的早期診斷方面具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102154476SQ20111003295
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者彭德良, 彭煥, 王瓊 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所