專利名稱：在體內(nèi)外使用的偶聯(lián)識別/檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及各種熒光團、特異性結(jié)合熒光團的核酸分子(適體)、包含適體和熒光團的分子復(fù)合物、以及特異性結(jié)合靶標分子的適體，以及以上各項在體外或者體內(nèi)監(jiān)測各種分子的活性、轉(zhuǎn)運、或者降解中的應(yīng)用，以及對它們進行定量監(jiān)測的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及這些復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用，以及用于實施這些方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
RNA曾經(jīng)被認為是細胞中一種簡單的分子。其主要包括轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA和信使RNA(mRNA)三種類型，一般認為RNA不受信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)，也不在疾病過程中發(fā)揮主要作用。然而，近幾年來，有新興的觀點認為轉(zhuǎn)錄和其它細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到如 microRNAs 和末端相關(guān)的 RNAs (Han 等人，"Promoter-associated RNA Is Required for RNA-directed Transcriptional Gene Silencing in Human Cells,"Proc Natl Acad Sci USA 104 :1M22-1M27 Q007))等各種非編碼RNAs的調(diào)節(jié)。此外，新的觀點也不再認為mRNA只是簡單的在DNA和蛋白質(zhì)之間起中間體的作用，目前研究發(fā)現(xiàn)，mRNA廣泛的參與后轉(zhuǎn)錄加工過程的各種事件，包括各種類型的剪接反應(yīng)、無義介導(dǎo)的降解、RNA編輯、外切和內(nèi)切核苷酸降解、聚腺苷酸化和脫腺苷化。另一引起人們關(guān)注的RNA在生物學(xué)中的發(fā)現(xiàn)是， 當富含三核苷酸重復(fù)的mRNAs在特定的胞內(nèi)位點累積時，其會表現(xiàn)出專一的功能獲得性毒性(Ranum等人，“Myotonic Dystrophy:)。除以上這些不同的調(diào)節(jié)途徑之外，最近的研究表明RNA成熟過程中RNAs的轉(zhuǎn)運是通過細胞的不同部位完成。例如，新生成的RNA轉(zhuǎn)錄子 (transcript)可能被搬運至細胞核上專一的胞內(nèi)位點進行各種加工，包括剪接、無義介導(dǎo)降解或者組裝成轉(zhuǎn)運顆粒等加工處理。一些RNAs被轉(zhuǎn)運出細胞核后，會定位于RNA聚集的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，其包括RNA顆粒、應(yīng)激顆粒和處理小體(P-小體)(Kiebler等人，“Neuronal RNA Granules =Movers and Makers, "Neuron 51 :685-690 (2006)) 這些 RNA 調(diào)節(jié)機制的多樣性充分表明，RNA受到一個錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制網(wǎng)絡(luò)和和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的調(diào)控，這些胞內(nèi)結(jié)構(gòu)在基因表達過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在神經(jīng)元中，RNA調(diào)節(jié)途徑尤為重要。例如，相比于其它任何細胞類型，神經(jīng)元中， RNA剪接受到更高調(diào)節(jié)，其RNA剪接過程也更加復(fù)雜(Dredge等人，“The Splice of Life Alternative Splicing and Neurological Disease,"Nat Rev Neurosci. 2 :43(2001))。相似地，盡管RNA編輯和富含三核苷酸重復(fù)的mRNA疾病的相關(guān)轉(zhuǎn)錄子在生物體中廣泛表達， 但是RNA編輯和富含三核苷酸重復(fù)的mRNA疾病卻特異性的主要發(fā)生在神經(jīng)元中(Keegan 等人，"Adenosine Deaminases Acting on RNA (ADARs) :RNA_editing Enzymes,，，Genome Biol. 5 :209 (2004))。最近對1，328種非編碼RNAs ( > 200個核苷酸)的分析結(jié)果顯示，此1，328種非編碼RNAs中有64%在大腦中表達，且其中大多數(shù)非編碼RNAs在不同腦區(qū)結(jié)構(gòu)中具有非常專一的表達模式(Mercer 等人，“Specific Expression of Long Noncoding RNAs in the Mouse Brain，” Proc Natl Acad Sci USA 105 :716-721 (2008)) “區(qū)域” RNA翻譯作為RNA調(diào)節(jié)的一種形式目前受到研究者的廣泛關(guān)注。在最近一個里程碑式的研究中研究人員提出了一個引人關(guān)注的觀點，即細胞中RNA定位具有基礎(chǔ)性作用，在該研究中，對果蠅胚胎進行高通量基因特異原位雜交的結(jié)果顯示71%的胞內(nèi)RNAs表現(xiàn)出特異性并且往往是顯著的胞內(nèi)定位(Lecuyer等人，“Global Analysis of mRNA Localization Reveals a Prominent Role in Organizing Cellular Architecture and Function，” Cell 131 174-187 (2007)) RNA定位同時也是神經(jīng)元的一大特點，在神經(jīng)元中，mRNAs在軸突和樹突富集。這些mRNAs的區(qū)域翻譯可能是進化中為了適應(yīng)神經(jīng)元形態(tài)的高度空間極化性質(zhì)而形成的，神經(jīng)元空間極化性質(zhì)的典型特點是軸突和樹突從細胞體開始可以發(fā)散成千上萬微米的距離。在區(qū)域翻譯中，mRNAs直接在樹突和軸突翻譯，而且往往是在如1-2 μ m長的樹突棘等特征性的小結(jié)構(gòu)域或者軸突生長錐內(nèi)的小結(jié)構(gòu)域進 - τΙ $ (Steward ^Α "Compartmentalized Synthesis and Degradation of Proteins in Neurons, ” Neuron 40 :347-59 (2003))。突觸刺激時，RNAs 會在 RNA 顆粒結(jié)構(gòu)和 P-小體之間進行動態(tài)轉(zhuǎn)運，此轉(zhuǎn)運方式可能對mRNA翻譯有調(diào)節(jié)作用(Zeitelhofer等人， "Dynamic Interaction Between P-bodies and Transport Ribonucleoprotein Particles in Dendrites of Mature Hippocampal Neurons,，，J Neurosci. 28 :7555-7562 (2008))。 mRNA總量中只有的一小部分被搬運至軸突或者樹突，不連續(xù)的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR) 序列似乎對信號依賴性翻譯是必需的(Sutton等人，“Local Translational Control in Dendrites and its Role in Long-term Synaptic Plasticity,，，J Neurobiology 64 :116-131 (2005)) 0區(qū)域翻譯可以繞過傳送信號至核仁這一費時的過程，直接進行蛋白質(zhì)的合成，然后再將新合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至受體激活的特異性位點(Meward等人， “Compartmentalized Synthesis and Degradation of Proteins in Neurons,，，Neuron 40 :347-359(2003)).因此，神經(jīng)元受到區(qū)域mRNA翻譯的復(fù)雜、時間依賴性和空間特異性調(diào)節(jié)，以滿足其功能和形態(tài)學(xué)的要求。綠色熒光蛋白(GFP)為生物醫(yī)藥研究和生物技術(shù)帶來了革命。GFP的應(yīng)用，使得定位蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和加工過程相關(guān)的特定胞內(nèi)細胞器和細胞內(nèi)的特定位點成為常規(guī)技術(shù)。此外，還可用于對細胞器甚至于細胞器內(nèi)子域的作用進行研究。然而，除了用于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的時空定位，GFP還被用于為研究蛋白-蛋白相互作用、胞內(nèi)粘度和蛋白質(zhì)降解提供相關(guān)信息(Zhang等人,‘‘Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology, "Nature Rev Mol Cell Biol 3 :906-918(2002) ；Neher ^A, "Latent ClpX-Recognition Signals Ensure LexA Destruction After DNA Damage，，，Genes & Development 17:1084-1089(2003))。 GFP還被用于研究蛋白質(zhì)折疊，以及作為基于細胞和體內(nèi)測定的關(guān)鍵組分，GFP在生物技術(shù)已有大量的應(yīng)用。GFP及其相關(guān)蛋白已被用于生產(chǎn)新型的FRET探針，此探針可以報告胞內(nèi)分子的胞內(nèi)定位以及濃度(Zhang 等人，"Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology, "Nature Rev Mol Cell Biol 3 :906-918 Q002))。利用生物共軛化學(xué)方法使得蛋白質(zhì)發(fā)射熒光的技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用了很長時間，但是此技術(shù)需要對蛋白質(zhì)進行異硫氰酸熒光素等試劑修飾后，才可將其顯微注射入細胞。由于GFP和GFP標記蛋白在遺傳學(xué)上均是可編碼的，其可通過轉(zhuǎn)染DNA進行表達，從而使得在任意生物醫(yī)藥研究實驗室都可以輕松實現(xiàn)對表達熒光標記蛋白的細胞的制備。除了可以實現(xiàn)GFP標記蛋白的輕松制備之外，由于標記GFP的蛋白相對于標記傳統(tǒng)小分子熒光染料的蛋白光學(xué)漂白速度要慢的多，因此GFP還廣泛的應(yīng)用于活細胞成像。盡管GFP已被證明是蛋白質(zhì)細胞生物學(xué)研究中十分有價值的工具，但是類似的可用于RNA和小分子可視化且符合簡單和直接要求的技術(shù)尚未實現(xiàn)。如要模擬GFP的原理實現(xiàn)RNA可視化，此技術(shù)將是一項重要的“可實施技術(shù)”，仍有許多問題尚待解決。WmRNAs的特異性實時定位相關(guān)問題為例，mRNAs在細胞核和核仁進行加工的過程，以及其接下來的運送至細胞質(zhì)的過程，轉(zhuǎn)運至神經(jīng)生長錐、棘、軸突、核、細胞器等過程都可被記錄，尤其是相關(guān)的mRNAs特殊剪接形式、不同的mRNAs編輯以及含有三核苷酸重復(fù)的mRNAs。而且，與胞外信號響應(yīng)的mRNAs的轉(zhuǎn)運時機也可被記錄，例如，突觸可塑性過程時，mRNAs轉(zhuǎn)運至樹突棘的作用以及軸突轉(zhuǎn)向過程中mRNAs在生長錐的作用。樹突和軸突中，mRNAs降解調(diào)節(jié)的作用也可被評估。然而，RNA的可視化技術(shù)并不局限于mRNA。除了 microRNAs之外，最近的研究表明有大量的Piwi蛋白相作用的RNAs、啟動子相關(guān)小RNAs (PASRs)、末端相關(guān)小RNA(TASRs) (Han 等人，Promoter-associated RNA is Required for RNA-directed Transcriptional Gene Silencing in Human Cells, "Proc Natl Acad Sci USA 104 12422-12427(2007)), 以及大量其它的非編碼小 RNAs (Hannon 等人，“The Expanding Universe of Noncoding RNAs, "Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71 :551-564(2006))存在，這些 RNAs 的具體功能未明，但可預(yù)見它們的發(fā)現(xiàn)將與microRNAs的發(fā)現(xiàn)一樣，對分子生物學(xué)有著相同重要的影響。很明顯，還有許多基礎(chǔ)性的問題尚待解決。目前，最普遍使用的研究mRNA定位的技術(shù)是原位雜交(Levsky等人， "Fluorescence in situ Hybridization :Past, Present and Future,，，J Cell Sci.116 ^33-2838 (2003))。此技術(shù)已經(jīng)得到很好的實驗驗證，但是其不是均相測定，也不能對同一細胞不同時間點的RNA進行監(jiān)測。為實現(xiàn)對單細胞體內(nèi)RNA的實時可視化監(jiān)測，研究者開發(fā)了一項在體外利用熒光標記核苷酸合成RNA，然后將其顯微注射入細胞的技術(shù)Ghang 等人，“Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology, "Nat Rev Mol Cell Biol 3 :906-918(2002)) 0但是，此方法技術(shù)上實現(xiàn)困難且通量低。另一種方法利用分子信標的技術(shù)，分子信標為熒光團和猝滅劑雙標記的寡聚核苷酸(Tyagi等人，“Imaging Native Beta-actin mRNA in Motile Fibroblasts, '^Biophys J. 87 :4153-4162 U004))。信標采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，由于在其莖的底部，熒光團和猝滅劑距離接近使得信標本身無熒光性。當一個可與信標的環(huán)互補的靶標mRNA和信標雜交時，會導(dǎo)致信標熒光團和猝滅劑的分離，從而使得信標表現(xiàn)出熒光性。但是，此種分子信標技術(shù)，轉(zhuǎn)染的信標表現(xiàn)出非特異性的核隔離作用， 且每一個mRNA要實現(xiàn)可視化均需要定制設(shè)計一個信標。由于此種合成方法的固有困難，許多研究小組在嘗試開發(fā)細胞內(nèi)遺傳可編碼的RNA位置的報告子。然而，目前為止，尚未有技術(shù)相對簡單同時又有特異性可作為常規(guī)方法使用，因此RNA成像仍然是觸不可及的技術(shù)。最廣泛應(yīng)用的技術(shù)是GFP-MS2系統(tǒng)(Bertrand等人，“Localizationof ASHl mRNA Particles in Living Yeast，"Molecular Cell 2 :437-445 (1998))。這一方法采用兩個組成部分一個重要的蛋白質(zhì)MS2，其與GFP融合；一段RNA序列，其作為MS2結(jié)合元件，插入到感興趣RNAs的3’非翻譯區(qū)。GFP-MS2和含有RNAs的在細胞內(nèi)，GFP-MS2與標記RNA的MS2元件結(jié)合，因此這些細胞內(nèi)的熒光信號代表了 RNA-GFP復(fù)合物的情況。由于未結(jié)合的 GFP-MS2會向細胞質(zhì)彌漫，因此此種方法往往熒光背景值較高。為了消除這一問題，將一個核定位信號(NLQ引入GFP-MS2融合蛋白，從而使得多數(shù)的GFP-MS2移入細胞核(Bertrand 等人，"Localization of ASHl mRNA Particles in Living Yeast, "Molecular Cell 2: 437-445(1998))。不幸的是，此種改進的結(jié)果是GFP-MS2-RNA復(fù)合物會產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)運信號 一個在RNA中編碼，而另一個是GFP-MS2中的NLS。兩種轉(zhuǎn)運信號的存在使得對標記mRNA 胞內(nèi)運動情況的闡釋變得復(fù)雜化。NLS的另一個缺點即是會引起GFP-MS2在細胞核內(nèi)的累積，從而導(dǎo)致強烈的核熒光信號，以及因此而阻止了對位于核內(nèi)的RNAs的分析。由于多數(shù)的RNA生物學(xué)過程都發(fā)生在細胞核內(nèi)，例如無義介導(dǎo)的降解、RNA編輯、RNA的核轉(zhuǎn)出、剪接、 先鋒RNA翻譯(pioneer RNA translation)和microRNA加工，GFP-MS2的核內(nèi)累積會妨礙對這些事件的分析。因此，盡管GFP-MS2有一定的實用性，但是其還是不能夠適合研究團體的需要。其它已知的相關(guān)技術(shù)方法都有重大的局限性。最近發(fā)展的關(guān)于GFP表達的新策略，其包括以獨立的兩半形式表達GFP，每一半都分別與一種RNA結(jié)合蛋白即蛋白eIF4A的一半相融合(Tyagi, S. “Splitting or Stacking Fluorescent Proteins to Visualize mRNA in Living Cells, "Nat Methods 4 :391-392 (2007)) 含有 eIF4A 結(jié)合位點的 RNAs 會使得結(jié)合的eIF4A —半形成核，其會導(dǎo)致兩個GFP半的并置，從而導(dǎo)致穩(wěn)定GFP復(fù)合物的形成。由于GFP復(fù)合物需要約30分鐘才能成為成熟的熒光種類(Merzlyak等人，“Bright Monomeric Red Fluorescent Protein with an Extended Fluorescence Lifetime,，，Nat Methods 4 :555-557 0007)),所以此方法不能用于新生RNAs的可視化。另外，GFP復(fù)合物一旦形成，此熒光復(fù)合物會自發(fā)地或者在RNA降解后發(fā)生解離，從而導(dǎo)致胞漿熒光背景值處于高水平。一個高度理想化的策略是在沒有其他結(jié)合蛋白的幫助下RNA序列本身就具有熒光性。一種可能的替代方法是使用可以結(jié)合RNA序列的熒光染料來對RNAs進行標記?？梢越Y(jié)合其它分子的短的RNA序列又被稱為“適體”。已有報道關(guān)于，應(yīng)用SELEX技術(shù)，可以結(jié)合熒光染料例如熒光素的RNA適體(Holeman，等人，“Isolation and Characterization of Fluorophore-binding RNA Aptamers，，，F(xiàn)olding& Design. 3 :423_431 (1998) ；Sando ^A, “Transcription Monitoring using Fused RNA with a Dye-binding Light-up Aptamer as a Tag :a Blue Fluorescent RNA，，，Chem Commun (Camb) 33 :3858-3860 (2008))。但是， 這些RNAs都未用于活細胞實驗中，原因是結(jié)合的和未結(jié)合的染料都有熒光性，而且熒光的發(fā)射光譜性質(zhì)也基本相同。因此，如果擁有可以表達能與熒光素結(jié)合的適體的細胞，將熒光素加入此細胞介質(zhì)后，來自于未結(jié)合的熒光素的熒光信號會掩蓋住與RNA結(jié)合的熒光素的熒光信號。相似地，孔雀綠是一種與同源適體結(jié)合后具有熒光的染料(Babendure 等人，"Aptamers Switch on Fluorescence of Triphenylmethane Dyes,，，J Am. Ch em. Soc. 125 :14716-14717O003))，但是其不能應(yīng)用于活細胞中，原因就是孔雀綠與細胞膜相互作用后會發(fā)射強烈的熒光(Guidry，G. "A Method for Counterstaining Tissues in Conjunction with the Glyoxylic Acid Condensation Reaction for Detection of Biogenic Amines，” J Histochem Cytochem. 47 :261-264 (1999))。另外，孔雀綠還會產(chǎn)生 Jl*細Ifi.i乍用白勺自 ￠1 (Beermann ^A "Chromophore-assisted Laser Inactivation
1of Cellular Proteins, "Methods in Cell Biology 44 :715-732 (1994))，其會快速摧毀自身的 RNA 適體(Grate 等人，“Laser-mediated, Site-specific Inactivation of RNA Transcripts, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6131-6136(1999) Jtojanovic 等人， "Modular Aptameric Sensors，” J Am Chem Soc. 126 :9266-9270 (2004)) 孔雀綠的這些令人遺憾的特征使得孔雀綠適體在細胞成像中的潛在應(yīng)用不可能實現(xiàn)。其它的染料也有各種問題。許多的分子在結(jié)合核苷酸后表現(xiàn)出熒光性。溴化乙錠和雙苯亞甲胺染料可能是最廣為人知的兩種分子，但是它們與寡聚核苷酸的結(jié)合是非特異性的。因此，當在同時含有靶標和非靶標核苷酸分子的細胞環(huán)境或者體外介質(zhì)中使用這些分子時，即使是靶標核苷酸分子不存在，溴化乙錠和雙苯亞甲胺染料也會產(chǎn)生熒光信號。菁染料具有強烈的熒光發(fā)射特征，甚至于在其與胞膜組分無差別結(jié)合后，亦表現(xiàn)出熒光性。因此，菁染料同孔雀綠在應(yīng)用上存在相同的問題。故開發(fā)這樣一種熒光團是十分理想的，即其在不存在適體結(jié)合時，產(chǎn)生的背景熒光足夠低，而且由此適體結(jié)合熒光團復(fù)合物產(chǎn)生增強的或者修飾的熒光信號，其可以很容易的與末結(jié)合的熒光團的熒光信號(如果有的話)區(qū)分開來。本發(fā)明的目的即是要克服本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的以上以及其它缺陷。本發(fā)明的第一個方面涉及一種化合物，其在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉 (硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，核酸分子與此化合物結(jié)合后可以實質(zhì)性地提高了此化合物在適宜波長射線下的熒光強度。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明第一個方面所涉及的化合物具有如下通式I 所示的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1. 一種具有通式(I)結(jié)構(gòu)的化合物
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Ar為苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、咪唑基、苯并咪唑基、惡唑基、苯并惡唑基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、色酮基或者香豆素基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Z和Y為氮，Q為氧。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Ar為苯基，Q為氧，Z和Y為氮。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，R1為甲基、乙基或者(CH2)n-R6A2為甲基，R3為 3-甲氧基，R4為4-羥基，R5為5-甲氧基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中,R1為甲基、乙基或者(CH2)n-R6A2為苯基，R3為3-甲氧基，R4為4-羥基，R5為5-甲氧基。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，隊為甲基，&為甲基，R3為3-甲氧基，R4為4-甲氧基，&為5_甲氧基。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，R3為3-氟、3-氯或者3-溴，R4為4-羥基，R5 為5-氟、5-氯或者5-溴。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中，R1為甲基、乙基或者(CH2)n-NH2,Ii2為甲基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中，R1為甲基、乙基或者(CH2)n-NH2,Ii2為肟基或者鄰甲基肟基。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，R2為肟基或者鄰甲基肟基。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，R1為甲基，R2為甲基，R3為2-羥基，R4為4-二甲基氨基，&為氫。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，R1為乙基，R2為三氟甲基，R3為3-甲氧基，R4 為4-羥基，&為5-甲氧基。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，R1為乙基，R2為丙-1-烯基，R3為3-甲氧基， R4為4-羥基，&為5-甲氧基。
15.一種含有第一結(jié)構(gòu)域的核酸分子，該結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合熒光團，所述熒光團含有位于取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫) 酮環(huán)之間的次甲基橋，其中，核酸分子與熒光團結(jié)合可以實質(zhì)性地提高熒光團在適宜波長射線下的熒光。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其中，熒光團包含通式(I)所示結(jié)構(gòu)的化合物
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸分子，其中，熒光團為取代的苯亞甲基咪唑酮或者取代的吲哚(亞甲基)咪唑酮。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其中，第一結(jié)構(gòu)域包含選自由SEQID NOS 1-30 組成的組中的核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其進一步包含一個或者多個其它特異性地結(jié)合熒光團的第一結(jié)構(gòu)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其中，核酸分子與熒光團的結(jié)合是離子依賴性的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸分子，其中，所述離子為一價或者二價離子。
22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其中，核酸分子與熒光團的結(jié)合是溫度依賴性的。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其中，核酸分子與熒光團的結(jié)合是pH依賴性的。
24.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其進一步包含第二結(jié)構(gòu)域，該第二結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合與熒光團不同的靶標分子。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含多個第一結(jié)構(gòu)域，每個第一結(jié)構(gòu)域均與熒光團結(jié)合。
26.根據(jù)權(quán)利要求M所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含多個第一和第二結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體。
27.根據(jù)權(quán)利要求M所述的核酸分子，其中，只有在第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子結(jié)合后，第一結(jié)構(gòu)域才與化合物結(jié)合。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQID NO :31、SEQ ID N0:32，或者SEQ ID NO :33所示的核苷酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸分子，其中，靶標分子選自以下組成的組:ATP、cGMP、 生物素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求18所述的核酸分子，其中，所述靶標分子選自以下組成的組蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、激素、細胞因子、趨化因子、代謝產(chǎn)物、有機分子，和金屬離子。
31.根據(jù)權(quán)利要求15-17、19-27、四和30中任意一項所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含RNA。
32.根據(jù)權(quán)利要求15-17、19-27、四和30中任意一項所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含DNA或者修飾的核酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其進一步包含含有隨機的核苷酸序列的第二結(jié)構(gòu)域，其中，第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子的特異性結(jié)合使得第一結(jié)構(gòu)域形成一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以使第一結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合熒光團。
34.一種文庫，其包含多個權(quán)利要求33所述的核酸分子。
35.一種試劑盒，其包含熒光團，其包含有位于取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間的次甲基橋；和多個權(quán)利要求15所述的核酸分子，所述多個核酸分子中的每一個核酸分當與熒光團結(jié)合后，可以引起熒光團不同的熒光發(fā)射情況。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述熒光團為4-(3，5_二甲氧基-4-羥基-苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述多個核酸分子包含兩個或者兩個以上如下化合物4-(3，4，5-三甲氧基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3， 5- 二甲氧基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (3，5- 二氟-4-羥基苯亞甲基)-1， 2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (3，5- 二氟-4-羥基-苯亞甲基)-1-甲基-2-鄰甲基肟基-咪唑啉-5-酮；4-(3，5- 二氯-4-羥基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4_(3，5_ 二溴-4-羥基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (2-羥基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (2-甲氧基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (3-氟-4-羥基-5-甲氧基苯亞甲基)-1，2_二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亞甲基)-1，2_二甲基-咪唑-5-酮； 4- (4-叔丁基硫苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (4-甲硫基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-氰基苯亞甲基)-1，2_ 二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-乙酸)苯亞甲基-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3-硝基苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3-甲氧基-5-硝基苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4- -甲氧基-3-硝基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (4-溴苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-氯苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-7-基)亞甲基)-1，2_ 二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基) 亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基)亞甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯亞甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亞甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基苯亞甲基)-2-乙酰基-1-甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基苯亞甲基)-1-甲基-2-丙-1-烯基-咪唑-5-酮；3-(4-羥基苯亞甲基)-4，5-二氫-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酰胺；3-(4-羥基苯亞甲基)-4，5-二氫-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸；以及甲基3-(4-羥基苯亞甲基)-4，5-二氫-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸酯。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述的多個核苷酸分子以矩陣形式固定在底物上。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述的底物為TIRF流式細胞儀中的底物。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述的多個核酸分子以兩個或兩個以上核酸分子的混合物形式存在。
41.一種試劑盒，其包含多個熒光團，所述熒光團含有位于取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間的次甲基橋；和多個權(quán)利要求15所述的核酸分子，其中，所述多個核酸分子中的每一個核酸分子均與所述多個熒光團中的至少一個熒光團相結(jié)合。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中，所述多個熒光團包含兩個或兩個以上所述的多個核酸分子，該多個核酸分子包含兩個或者兩個以上如下化合物4-(3，4，5_三甲氧基苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯亞甲基)-1， 2- 二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5- 二氟-4-羥基苯亞甲基)-1，2_ 二甲基-咪唑-5-酮； 4- (3，5- 二氟-4-羥基-苯亞甲基)-1-甲基-2-鄰甲基肟基-咪唑啉-5-酮；4- (3，5- 二氯-4-羥基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5- 二溴-4-羥基苯亞甲基)-1， 2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(2-羥基苯亞甲基)-1，2_ 二甲基-咪唑-5-酮；4- -甲氧基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (3-氟-4-羥基-5-甲氧基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (4- 二甲胺苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (4-叔丁基硫苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-甲硫基苯亞甲基)_1，2-二甲基-咪唑-5-酮； 4- -氰基苯亞甲基)-1，2_ 二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-乙酸)苯亞甲基-1， 2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3-硝基苯亞甲基)-1，2_二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3-甲氧基-5-硝基苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-甲氧基-3-硝基苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-溴苯亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-氯苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮；4- (4-羥基苯亞甲基)-1，2- 二甲基-咪唑-5-酮 (“p-HBT”)；4-((吲哚-7-基)亞甲基)-1，2_ 二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基) 亞甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基)亞甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯亞甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亞甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基苯亞甲基)-2-乙酰基-1-甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羥基苯亞甲基)-1-甲基-2-丙-1-烯基-咪唑-5-酮；3-(4-羥基苯亞甲基)-4，5-二氫-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酰胺；3-(4-羥基苯亞甲基)-4，5- 二氫-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸；以及甲基3- (4- (4-羥基苯亞甲基)-4，5-二氫-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸酯。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中，所述的多個核苷分子以矩陣形式固定在底物上。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中，所述的底物為TIRF流式細胞儀中的底物。
45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中，所述的多個核酸分子以兩個或兩個以上核酸分子的混合物形式存在。
46.根據(jù)權(quán)利要求41或者45所述的試劑盒，其中，所述的多個熒光團以兩個或兩個以上熒光團的混合物形式存在。
47.一種分子復(fù)合物，其包含熒光團，其包含位于取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉 (硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間的次甲基橋；和權(quán)利要求15所述的核酸分子，該核酸分子特異性地結(jié)合熒光團，其中，跟熒光團特異性結(jié)合核酸分子之前相比，熒光團特異性地結(jié)合核酸分子后，其在適宜波長射線下的熒光得到了實質(zhì)性地提高。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，熒光團包含通式(I)所示結(jié)構(gòu)的化合物
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，R1為甲基、乙基或者(CH2)n-Ii6J2為甲基，R3為3-甲氧基，R4為4-羥基，&為5-甲氧基；并且，所述核酸分子選自SEQ ID NOS 1-15組成的組。
50.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，R1為甲基、乙基或者(CH2)n-Ii6J2為甲基，R3為3-鹵代，R4為4-羥基，&為5-鹵代，其中鹵代基團為氟、氯或者溴；并且所述核酸分子選自SEQ ID NOS :16-19組成的組。
51.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，R1為甲基或者(CH2)η-&，1 2為甲基，R3 為2-羥基，R4和&為氫；并且所述核酸分子選自SEQ ID NOS :20-23組成的組。
52.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，R1為甲基或者(CH2)η-&，1 2為甲基，R3 為2-羥基，R4為4-二甲胺基，&為氫；并且所述核酸分子選自SEQ ID NOS 對-30組成的組。
53.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子包含RNA。
54.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子包含DNA或者修飾的核酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子包含多個可以結(jié)合熒光團的第一結(jié)構(gòu)域。
56.根據(jù)權(quán)利要求47所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子進一步包含第二結(jié)構(gòu)域， 該第二結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合與熒光團不同的靶標分子。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子包含多個第一結(jié)構(gòu)域，每一個第一結(jié)構(gòu)域均與熒光團結(jié)合。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子包含多個第一和第二結(jié)構(gòu)域的多聯(lián)體。
59.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分子復(fù)合物，其中，所述核酸分子包含SEQID N0:31、SEQ ID NO :32，或者SEQ ID NO 33所示的核苷酸序列。
60.根據(jù)權(quán)利要求56所述的分子復(fù)合物，其中，只有在第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子結(jié)合后， 第一結(jié)構(gòu)域才與熒光團結(jié)合，所述分子復(fù)合物進一步包含與第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶標分子。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的分子復(fù)合物，其中，靶標分子選自由以下組成的組:ATP、 cGMP、生物素、和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的分子復(fù)合物，其中，靶標分子選自由以下組成的組蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、激素、細胞因子、趨化因子、代謝產(chǎn)物、有機分子，和金屬離子。
63.一種宿主細胞，其含有權(quán)利要求47-62任一項所述的分子復(fù)合物。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的宿主細胞，其中，所述細胞為離體的。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的宿主細胞，其中，所述細胞為體內(nèi)的。
66.一種構(gòu)建的DNA分子，其包含編碼權(quán)利要求31所述RNA分子的第一區(qū)域。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的構(gòu)建的DNA分子，其進一步包含啟動子，該啟動子被可操縱地連接到所述第一區(qū)域以調(diào)控RNA分子的表達。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的構(gòu)建的DNA分子，其中，所述啟動子為組成型啟動子。
69.根據(jù)權(quán)利要求66所述的構(gòu)建的DNA分子，其中，所述啟動子為誘導(dǎo)型啟動子。
70.根據(jù)權(quán)利要求66所述的構(gòu)建的DNA分子，其進一步包含位于第一區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子， 從構(gòu)建的DNA分子的轉(zhuǎn)錄子中切除出內(nèi)含子得到RNA分子。
71.根據(jù)權(quán)利要求66所述的構(gòu)建的DNA分子，進一步包含與第一區(qū)域相連的第二區(qū)域， 該第二區(qū)域編碼目標RNA轉(zhuǎn)錄子，轉(zhuǎn)錄構(gòu)建的DNA分子可以形成RNA分子，該RNA分子包括目標RNA轉(zhuǎn)錄子，該RNA轉(zhuǎn)錄子與RNA分子相連接并可以特異性地結(jié)合熒光團。
72.一種包含表達載體的表達系統(tǒng)，其中該表達載體中插入了權(quán)利要求66-71中任意一項所述的DNA分子。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的表達系統(tǒng)，其中，該表達系統(tǒng)為質(zhì)?；蛘吒腥巨D(zhuǎn)化載體。
74.一種轉(zhuǎn)基因宿主細胞，其包含權(quán)利要求72所述的表達系統(tǒng)。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，其中，所述宿主細胞為離體的。
76.根據(jù)權(quán)利要求74所述的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，其中，所述宿主細胞為體內(nèi)的。
77.—種基因構(gòu)建體，其包含啟動子序列和第二 DNA序列，其中，所述啟動子序列被可操縱地連接到編碼權(quán)利要求30所述RNA分子的第一 DNA序列，所述第二 DNA序列含有一個或者多個酶切位點。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的基因構(gòu)建體，其中，所述RNA分子包含多個第一結(jié)構(gòu)域。
79.根據(jù)權(quán)利要求77所述的基因構(gòu)建體，其中，所述第二DNA序列包含兩個或兩個以上的酶切位點。
80.根據(jù)權(quán)利要求77所述的基因構(gòu)建體，其中，所述第二DNA序列位于啟動子序列和第一DNA序列之間。
81.根據(jù)權(quán)利要求77所述的基因構(gòu)建體，其中，所述第一DNA序列位于啟動子序列和第二DNA序列之間。
82.—種試劑盒，其包含權(quán)利要求77所述的基因構(gòu)建體； 一個或者多個限制性內(nèi)切酶。
83.權(quán)利要求82所述的試劑盒，進一步包含說明書，其用于說明如何將編碼目標RNA分子的DNA分子插入到第二 DNA序列中，以及用于說明如何形成編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)錄子含有連接到權(quán)利要求31所述RNA 分子上的目標RNA分子。
84.—種檢測靶標分子的方法，其包含第一，在一定條件下，將權(quán)利要求27所述的核酸分子暴露給疑似含有靶標分子的介質(zhì)，如靶標分子存在，在此條件下，第二結(jié)構(gòu)域會特異性的與靶標分子結(jié)合；和第二，在一定條件下，將核酸分子和介質(zhì)暴露給熒光團，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間有次甲基橋， 在此條件下，足以使第一結(jié)構(gòu)域在第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子結(jié)合后特異性地與熒光團結(jié)合， 從而誘導(dǎo)熒光團形成表現(xiàn)出熒光發(fā)射增強的構(gòu)象；和通過適宜波長的射線激發(fā)熒光團，檢測熒光團的熒光，熒光團熒光發(fā)射的檢測結(jié)果可以說明核酸分子和靶標分子的結(jié)合情況。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述介質(zhì)包含全細胞的胞質(zhì)，所述暴露包含在全細胞中表達或者引入核酸分子，所述第二次暴露包含將熒光團引入到細胞中。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中，所述表達包含使用編碼核酸分子的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化全細胞。
87.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中，所述細胞為離體的。
88.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中，所述細胞為體內(nèi)的。
89.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述介質(zhì)為體外的。
90.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述檢測通過制冷型CCD相機、制冷型像增強 CCD相機、單光子計數(shù)檢測器、雙光子計數(shù)檢測器、分光光度計、熒光活化細胞分選系統(tǒng)、熒光分析儀或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)完成。
91.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，進一步包含生成所述檢測的圖像結(jié)果。
92.一種檢測靶標分子的方法，其包含 形成權(quán)利要求60所述的分子復(fù)合物； 通過適宜波長的射線激發(fā)熒光團；和檢測熒光團的熒光，通過熒光團的熒光驗證靶標分子是否存在。
93.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述的形成是在細胞內(nèi)完成的。
94.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述細胞為離體的。
95.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述細胞為體內(nèi)的。
96.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述形成包含使用編碼核酸分子的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化細胞，從而該細胞表達核酸分子，并使得核酸分子的第二結(jié)構(gòu)域能夠與靶標分子發(fā)生特異性結(jié)合；以及在可以使得第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合熒光團的條件下，將熒光團引入到細胞。
97.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述形成包含將核酸分子和熒光團引入到細胞。
98.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述檢測通過制冷型CCD相機、制冷型像增強 CCD相機、單光子計數(shù)檢測器、雙光子計數(shù)檢測器、分光光度計、熒光活化細胞分選系統(tǒng)、熒光分析儀或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)完成。
99.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其進一步包含生成所述檢測的圖像結(jié)果。
100.根據(jù)權(quán)利要求93所述的方法，其進一步包含在將細胞暴露給藥物后監(jiān)測熒光隨時間變化的情況。
101.根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述的形成是在體外完成的。
102.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中，所述的核酸分子固定在底物表面，所述的形成是通過在底物表面上將熒光團和靶標分子引入到核酸分子完成的。
103.根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法，其中，所述的熒光團固定在底物表面，所述的形成是通過在底物表面上將核酸分子和靶標分子引入到熒光團完成的。
104.根據(jù)權(quán)利要求120或103所述的方法，其中，多個熒光團或者多個核酸分子以矩陣形式結(jié)合到底物表面。
105.一種測定目標啟動子在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方法，其包含將權(quán)利要求67所述的DNA構(gòu)建體引入至細胞；將基本上無熒光的熒光團引入至細胞；將能夠調(diào)節(jié)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的試劑引入至細胞；和檢測細胞內(nèi)熒光團的熒光，其中熒光的水平表示DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄水平以及試劑對轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的影響。
106.一種測定目標啟動子轉(zhuǎn)錄的方法，其包含將權(quán)利要求67所述的DNA構(gòu)建體，以及能夠調(diào)節(jié)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的試劑引入至細胞；從細胞中回收RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；將基本上無熒光的熒光團引入至回收到的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；和檢測熒光團的熒光，其中熒光的水平表示DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄水平以及試劑對轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的影響。
107.一種監(jiān)測RNA的方法，其包含將權(quán)利要求71所述的第一 DNA構(gòu)建體引入至細胞；和將第一熒光團引入至細胞，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，第一熒光團特異性結(jié)合由DNA構(gòu)建體編碼的RNA分子的第一結(jié)構(gòu)域，以增強第一熒光團的熒光發(fā)射水平；將細胞暴露于適宜波長的射線，該波長的射線可以誘導(dǎo)與第一結(jié)構(gòu)域或者FRET伴侶分子結(jié)合的第一熒光團的熒光發(fā)射；和測定第一熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，以監(jiān)測RNA轉(zhuǎn)錄子。
108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中，所述對RNA的監(jiān)測包含RNA的轉(zhuǎn)運、降解或者定量。
109.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中，所述目標RNA為mRNA前體、mRNA、rRNA前體、迚嫩、丨1 嫩、11111 嫩、8111 嫩、1^1 嫩，或者長鏈非編碼RNA、PIWI RNA、末端相關(guān)的RNA、非編碼RNAs、啟動子相關(guān)的RNAs，和病毒RNAs。
110.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其中，所述DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包含多個第一結(jié)構(gòu)域。
111.根據(jù)權(quán)利要求110所述的方法，其中，所述多個第一結(jié)構(gòu)域足以對各個RNA分子進行監(jiān)測。
112.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，進一步包含將第二 DNA構(gòu)建體引入至細胞，該第二 DNA構(gòu)建體包含編碼第二 RNA分子的第一區(qū)域和與第一區(qū)域相連并且編碼第二 RNA轉(zhuǎn)錄子的第二區(qū)域，所述第二 RNA分子包含特異性結(jié)合熒光團的第一結(jié)構(gòu)域，所述熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，RNA分子與熒光團結(jié)合可以實質(zhì)性地提高熒光團暴露在適宜波長射線下的熒光，其中構(gòu)建的DNA分子轉(zhuǎn)錄形成RNA分子，該RNA分子包括連接到特異性結(jié)合熒光團的第二 RNA分子上的目標第二 RNA 轉(zhuǎn)錄子；和將第二熒光團引入至細胞，其中，第二熒光團特異性的與由第二 DNA構(gòu)建體編碼的第二 RNA分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強第二熒光團的熒光發(fā)射水平；所述暴露包含適宜波長的射線，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與第二 RNA分子的第一結(jié)構(gòu)域或者FRET伴侶分子結(jié)合的第二熒光團的熒光發(fā)射；和所述測定包含測定與FRET伴侶分子結(jié)合的第二熒光團的熒光發(fā)射，以監(jiān)測第二 RNA轉(zhuǎn)錄子，其中，第一和第二熒光團或者它們各自的FRET伴侶分子的熒光都是可檢測的。
113.—種監(jiān)測細胞內(nèi)靶標分子的方法，其包含將權(quán)利要求27所述的核酸分子引入至細胞，其中，第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子結(jié)合；將第一熒光團引入至細胞，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，第一熒光團特異性的與核酸分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強第一熒光團的熒光發(fā)射水平；將細胞暴露于適宜波長的射線下，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與核酸分子或者FRET 伴侶分子結(jié)合的第一熒光團的熒光發(fā)射；和測定第一熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，以監(jiān)測靶標分子。
114.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其中，所述對靶標分子的監(jiān)測包含靶標分子的轉(zhuǎn)運、降解或者定量。
115.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其中，靶標分子為蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、激素、 細胞因子、趨化因子、代謝產(chǎn)物、有機分子，或者金屬離子。
116.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其中，所述核酸分子包含RNA。
117.根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法，其中，所述核酸分子包含DNA或者修飾的核酸。
118.—種監(jiān)測細胞內(nèi)靶標分子的方法，其包含將編碼權(quán)利要求27所述的核酸分子的基因引入至細胞，其中，所述第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子結(jié)合；將第一熒光團引入至細胞，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，第一熒光團特異性的與核酸分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強第一熒光團的熒光發(fā)射水平；將細胞暴露于適宜波長的射線下，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與核酸分子或者FRET 伴侶分子結(jié)合的第一熒光團的熒光發(fā)射；和測定第一熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，以監(jiān)測靶標分子。
119.根據(jù)權(quán)利要求118所述的方法，其中，所述對靶標的監(jiān)測包含轉(zhuǎn)運、降解或者定量。
120.根據(jù)權(quán)利要求118所述的方法，其中，靶標分子為蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、激素、 細胞因子、趨化因子、代謝產(chǎn)物、有機分子，或者金屬離子。
121.根據(jù)權(quán)利要求118所述的方法，其中，所述核酸分子包含RNA。
122.根據(jù)權(quán)利要求118所述的方法，其中，所述核酸分子包含DNA或者修飾的核酸。
123.—種篩選可以修飾基因表達的藥物的方法，其包含在一定條件下，將轉(zhuǎn)基因引入至細胞，該條件可以引起引入基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包含權(quán)利要求31所述的RNA分子； 將細胞暴露于藥物；將熒光團引入至細胞，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，熒光團特異性的與 RNA分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強熒光團的熒光發(fā)射水平；將細胞暴露于適宜波長的射線下，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與RNA分子或者FRET伴侶分子結(jié)合的熒光團的熒光發(fā)射；和測定熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，如果與其它條件均相同但未暴露于藥物的對照細胞相比，熒光發(fā)射降低或者消失，則表明藥物抑制轉(zhuǎn)基因的表達，如果與其它條件均相同但未暴露于藥物的對照細胞相比，熒光發(fā)射增強，則表明藥物促進轉(zhuǎn)基因的表達。
124.—種篩選可以修飾RNA剪接的藥物的方法，其包含將包含權(quán)利要求70所述DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因引入至細胞，其中，該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄得到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包含位于RNA分子的第一和第二部分之間的內(nèi)含子； 將細胞暴露于藥物；將熒光團引入至細胞，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，熒光團特異性的與 RNA分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強熒光團的熒光發(fā)射水平；將細胞暴露于適宜波長的射線下，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與RNA分子或者FRET伴侶分子結(jié)合的熒光團的熒光發(fā)射；和測定熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，如果與其它條件均相同但未暴露于藥物的對照細胞相比，其熒光發(fā)射降低或者消失，則表明藥物抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確剪接；如果與其它條件均相同但未暴露于藥物的對照細胞相比，其熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射增強，則表明藥物促進轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確剪接。
125.—種篩選可以修飾RNA剪接的藥物的方法，其包含提供含有RNA轉(zhuǎn)錄子的介質(zhì)、含有剪接酶的剪接體、藥物和熒光團； 其中，所述RNA轉(zhuǎn)錄子包含具有插入內(nèi)含子區(qū)域的第一和第二外顯子，該第一和第二外顯子通過切除內(nèi)含子形成權(quán)利要求31所述的RNA分子；和其中，所述熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉 (硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，該熒光團特異性的與RNA分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強熒光團的熒光發(fā)射水平，將介質(zhì)暴露于適宜波長的射線下，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與RNA分子或者FRET伴侶分子結(jié)合的熒光團的熒光發(fā)射；和測定熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，如果與其它條件均相同但不含有藥物的對照介質(zhì)相比，其熒光發(fā)射降低或者消失，則表明藥物抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確剪接；如果與其它條件均相同但不含有藥物的對照介質(zhì)相比，其熒光發(fā)射增強，則表明藥物促進轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確剪接。
126.—種篩選對靶標分子具有活性的藥物的方法，其包含將權(quán)利要求27所述的核酸分子引入至細胞，其中，第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子結(jié)合； 將第一熒光團引入至細胞，該熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑 (硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，其中，第一熒光團特異性的與核酸分子的第一結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以增強第一熒光團的熒光發(fā)射水平；將細胞暴露于適宜波長的射線下，該適宜波長的射線足以誘導(dǎo)與核酸分子或者FRET 伴侶分子結(jié)合的第一熒光團的熒光發(fā)射；和測定第一熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射，其中，與其它條件均相同但不含有藥物的細胞相比，其熒光團或者FRET伴侶分子的熒光發(fā)射水平發(fā)生變化則表示藥物改變了靶標分子的活性。
127.—種鑒定可以結(jié)合靶標分子的核酸分子的方法，其包含提供核酸分子池，池中的每一個核酸分子均包含特異性結(jié)合熒光團的第一結(jié)構(gòu)域，該第一熒光團在取代的芳環(huán)系統(tǒng)和取代的咪唑啉(硫)酮、惡唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮環(huán)之間包含有次甲基橋，以及包含隨機序列的第二結(jié)構(gòu)域，只有在第二結(jié)構(gòu)域與靶標分子特異性結(jié)合后，第一結(jié)構(gòu)域才能特異性的與熒光團結(jié)合；將核酸分子池暴露于靶標分子和熒光團，從而通過第一結(jié)構(gòu)域與熒光團的結(jié)合使得熒光團的熒光發(fā)射得到提高；使用適宜波長的光激發(fā)熒光團，該適宜波長的光足以誘導(dǎo)連接了第一結(jié)構(gòu)域分子的熒光團的熒光發(fā)射；和測定熒光團的熒光發(fā)射，檢測到熒光團的熒光表示核酸分子的第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合了靶標分子。
128.根據(jù)權(quán)利要求127所述的方法，其中，熒光團結(jié)合到固相表面。
129.根據(jù)權(quán)利要求127所述的方法，其中，在所述暴露核酸分子池之前，首先在無靶標分子的條件下將分子池暴露于熒光團，以從池中去除與熒光團結(jié)合的核酸分子。
130.權(quán)利要求127所述的方法，進一步包含回收核酸分子，該核酸分子在靶標分子存在的條件下能夠誘導(dǎo)熒光團的熒光發(fā)射；和擴增回收到的核酸分子。
131.根據(jù)權(quán)利要求130所述的方法，在所述擴增之前，進一步包含 將回收到的核酸分子暴露于靶標分子的結(jié)構(gòu)類似物；和從中選擇不與所述結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合的所述回收到的核酸分子的子類別； 其中，所述擴增包含擴增所述回收到的核酸分子的子類別。
132.根據(jù)權(quán)利要求130所述的方法，其中，所述擴增在擴增產(chǎn)物的核苷酸序列中引入了突變，從而形成第二池核酸分子，該方法進一步包含使用第二池核酸分子，重復(fù)所述的暴露、激發(fā)和測定步驟；和確定第二池核酸分子中是否有任何核苷酸分子的熒光發(fā)射得到了提高。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型熒光團，以及其與稱作“適體”的新型核酸分子的組合應(yīng)用，該適體能夠特異性地結(jié)合熒光團，從而當熒光團暴露于適宜波長的射線下時可以使熒光信號增強。本發(fā)明還提供了新型熒光團、新型核酸分子以及它們的靶分子所形成分子復(fù)合物，以及將多價適體構(gòu)建體作為目標靶分子的熒光感應(yīng)器的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/10GK102405212SQ201080017269
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者J·S·佩吉, S·R·杰弗里 申請人:康奈爾大學(xué)