專利名稱：Foxm1肽及包含它的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
優(yōu)先權(quán)本申請要求2009年2月18日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/153，408的權(quán)益，通過述及將其全部內(nèi)容收入本文。本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作為癌癥疫苗極其有效的新肽，和用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明，⑶8陽性CTL能識別自主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類分子上的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從TAA的第一個例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，通過免疫學(xué)手段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多其它TAA(NPL 1 =Boon T，Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 ；NPL2 =Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1，183 (3) :725-9)，而且這些TAA中的一些目前正處于作為免疫治療靶標(biāo)的臨床開發(fā)過程中。能誘導(dǎo)強(qiáng)力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床應(yīng)用的進(jìn)一步開發(fā)(NPL 3 =Harris CC, JNatl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55 ；NPL 4 =Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999Jul 1， 59(13) :3134-42 ；NPL 5 =Vissers JL et al. , Cancer Resl999Nov 1,59(21) :5554-9 ；NPL 6 :van der Burg SH et al. , J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14；NPL 7 :Tanaka F et al.，Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8 ；NPL 8 =Fujie T et al.，Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72；NPL 9 =Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) 459-66 ；NPL 10 =Oiso M et al.，Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94)。迄今為止， 已經(jīng)報(bào)告了數(shù)項(xiàng)使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗(yàn)中只能觀察到較低的客觀響應(yīng)率(NPL 11 =Belli F et al.，J Clin 0ncol20020ct 15,20(20) :4169-80 ；NPL 12 =Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42 ；NPL 13=Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004Sep,10(9) :909-1 。對癌細(xì)胞增殖和存活而言不可缺少的TAA適合作為免疫療法的靶標(biāo)，因?yàn)槭褂么祟怲AA可最大程度地減小常被描述的癌細(xì)胞免疫逃避的風(fēng)險(xiǎn)，而所述免疫逃避可歸因于治療驅(qū)動的免疫選擇導(dǎo)致的TAA刪除、突變、或下調(diào)。引用表非專利文獻(xiàn)[NPL l]Boon T, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) :177-80[NPL 2]Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725-9[NPL 3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul 1,59(13) :3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554-9
[NPL 6]van der Burg SH et al. ，J Immunol 1996May 1,156(9) :3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 19970ct 15,57(20) :4465-8[NPL 8]Fujie T et al. ， Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. ， Int J Cancer 1999May 5,81(3) :459-66[NPL 10]Oiso M et al. ， Int J Cancer 1999May 5,81(3) :387-94[NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 20020ct 15,20(20) :4169-80[NPL 12]Coulie PG et al.，Immunol Rev 20020ct, 188 :33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004S印，10(9) :909-15發(fā)明概述本發(fā)明部分基于合適的免疫療法靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。由于TAA —般被免疫系統(tǒng)察覺為 “自身”并因此常常沒有免疫原性，適宜靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是極其重要的。如上所述，F(xiàn)0XM1(由 GenBank登錄號NM_202002. 1 (SEQ ID NO :33)的基因編碼的SEQ ID NO 34)已經(jīng)被鑒定為在癌癥組織中上調(diào)，所述癌癥諸如急性髓樣白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、慢性髓樣白血病(CML)、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、小細(xì)胞肺癌(SCLC)、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。因此，F(xiàn)0XM1是免疫療法的候選靶標(biāo)。本發(fā)明至少部分基于F0XM1的擁有誘導(dǎo)對F0XM1特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)的能力的特定表位肽的鑒定。如下文詳細(xì)討論的，使用自F0XM1衍生的HLA-AM402 結(jié)合候選肽刺激從健康供體獲得的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。然后建立了具有針對經(jīng)每一種候選肽沖激的HLA-AM陽性靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的CTL系。這些結(jié)果證明，這些肽是能誘導(dǎo)針對表達(dá)F0XM1的細(xì)胞的強(qiáng)力且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-AM限制表位肽。這些結(jié)果證明，F(xiàn)0XM1具有強(qiáng)免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫療法的有效靶標(biāo)。因而，本發(fā)明的一個目的是提供分離的結(jié)合HLA抗原的肽，該肽為F0XM1 (SEQ ID NO 34)或其片段。本發(fā)明的肽預(yù)期具有CTL誘導(dǎo)能力。它們可用于離體誘導(dǎo)CTL或可用于給受試者施用以誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答，所述癌癥諸如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。優(yōu)選地，所述肽是九肽或十肽， 更優(yōu)選地，由選自SEQ ID NO :2，7，8，16，25，30和31的氨基酸序列組成，顯示強(qiáng)CTL誘導(dǎo)能力。本發(fā)明的肽涵蓋經(jīng)過修飾的肽，其具有SEQ ID NO =2,7,8,16，25，30和31的氨基酸序列，其中替代、刪除或添加了 1個、2個或數(shù)個氨基酸，只要經(jīng)過修飾的肽保留原始的 CTL誘導(dǎo)能力。另外，本發(fā)明提供了分離的編碼任何本發(fā)明肽的多核苷酸。這些多核苷酸可用于誘導(dǎo)或制備具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)或可供施用給受試者以誘導(dǎo)針對本發(fā)明肽以及癌癥的免疫應(yīng)答。當(dāng)對受試者施用時(shí)，本發(fā)明的肽呈遞在APC的表面上，然后誘導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的 CTL0因此，本發(fā)明的一個方面是提供用于誘導(dǎo)CTL的、包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸的組合物或物質(zhì)。另外，所述包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸的組合物或物質(zhì)可用于治療和/或預(yù)防癌癥，諸如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供用于治療和/ 或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或物質(zhì)，其包含任何本發(fā)明肽或多核苷酸。作為本發(fā)明的肽或多核苷酸替代或補(bǔ)充，本發(fā)明的藥物組合物或物質(zhì)可包含呈遞任何本發(fā)明肽的APC或外來體作為活性組分。本發(fā)明的肽或多核苷酸可用于誘導(dǎo)在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的PAC，例如通過使自受試者衍生的APC接觸本發(fā)明肽，或?qū)⒕幋a本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入APC來實(shí)現(xiàn)。此類APC具有針對靶肽的高CTL誘導(dǎo)能力，而且可用于癌癥免疫療法。 因此，本發(fā)明的另一個目的是提供用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法及通過這樣的方法獲得的APC。本發(fā)明的另一個目的是提供用于誘導(dǎo)CTL的方法，其包括共培養(yǎng)CD8陽性細(xì)胞與在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體的步驟或?qū)肴缦禄虻牟襟E，該基因包括編碼能與本發(fā)明肽結(jié)合的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸?？赏ㄟ^本發(fā)明方法獲得的CTL 也可用于治療和/或預(yù)防癌癥，諸如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、 腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。因此，本發(fā)明的另一個目的是提供可通過本發(fā)明方法獲得的CTL。此外，本發(fā)明的另一個目的是提供用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，其包括施用包含F(xiàn)OXMl或其片段、編碼FOXMl或其片段的多核苷酸、或呈遞FOXMl或其片段的外來體或APC的組合物或物質(zhì)的步驟。本發(fā)明可用于任何涉及FOXMl過表達(dá)的疾病，包括癌癥，諸如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、 骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。應(yīng)當(dāng)理解前面的發(fā)明內(nèi)容和下面的詳細(xì)描述均為示例性的實(shí)施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其他可替換實(shí)施方案構(gòu)成限制。附圖簡述本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應(yīng)用圖la-f。

圖1描繪照片，顯示了用FOXMl衍生肽誘導(dǎo)的CTL的IFN-YELISP0T 測定的結(jié)果。用F0XM1-A24-9-262 (SEQ ID NO⑵刺激的1號、4號和7號孔(a)、用 F0XMl-A24-9-351(SEQ ID NO 7)刺激的 7 號孑L (b)、用 F0XM1-A24-9-57(SEQ ID NO 8)刺激的 5 號孔(c)、用 F0XM1-A24-10-240 (SEQ ID NO 16)刺激的 3 號孔(d)、用 F0XM1-A24-10-318(SEQ ID NO :25)刺激的 6 號孔(e)及用 F0XM1-A24-10-390 (SEQ ID NO 30)刺激的4號孔(f)中的CTL分別顯示與對照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。圖lg-h。用 F0XM1-A24-10-238 (SEQ ID NO 31)刺激的 4 號孔中的 CTL 分別顯示與對照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成(g)。相反，作為陰性數(shù)據(jù)的一種典型情況，沒有顯示經(jīng)肽 F0XMl-A24-9-316(SEQ ID NO 1)刺激的CTL針對經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞的特異性IFN-γ生成 (h)。在圖中，“+〃指示針對經(jīng)過適宜的肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的細(xì)胞的IFN-γ生成。這些圖片的孔上的方框指示來自相應(yīng)孔的細(xì)胞被擴(kuò)增以建立CTL系。圖2。圖2描繪線圖，顯示了通過IFN-YELISA測定法檢測的經(jīng)過肽 F0XM1-A24-9-262 (SEQ ID NO :2) (a)、FOXM卜A24-10-240 (SEQ ID N0:16)(b)、 F0XM1-A24-10-318(SEQ ID NO :25) (c)和 F0XM1-A24-10-238 (SEQ IDNO :31) (d)刺激的 CTL 系的IFN- γ生成。它證明了用每一種肽刺激而建立的CTL系顯示與對照相比強(qiáng)力的IFN- γ 生成。在圖中，“+"指示針對經(jīng)過適宜的肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。圖3。圖3顯示通過有限稀釋自經(jīng)過肽F0XM1-AM-9_262(SEQ ID NO :2) (a)、 F0XM1-A24-10-240 (SEQ ID NO :16) (b)和 F0XM1-A24-10-238 (SEQ IDNO :31) (c)刺激的 CTL 系建立的CTL克隆的IFN-Y生成。它證明了用每一種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對照相比強(qiáng)力的IFN-Y生成。在圖中，"+〃指示針對經(jīng)過每一種肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-γ 生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。圖4。圖4描繪線圖，顯示了針對外源表達(dá)FOXMl和HLA_AM402的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。制備用HLA-AM402或用全長FOXMl基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。用肽 F0XM1-A24-9-262 (SEQ ID NO 2)建立的 CTL 克隆顯示了針對經(jīng) FOXMl 和 HLA_A*2402 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達(dá) HLA-A*2402 (白色三角形)或FOXMl (白色圓形)的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。實(shí)施方案的描述現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，不過在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)可使用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方法之前，要理解本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案等，因?yàn)樗鼈兛梢勒绽袑?shí)驗(yàn)和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開文本。如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。I.定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非
另有明確說明。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應(yīng)的天然存在氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、 和0-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號來指稱。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，與氨基酸類似，通過它們普遍接受的單字母符號來指稱。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達(dá)FOXMl基因的癌癥，它的例子包括但不限于 AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。除非另有定義，術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的普遍理解相同的含義。II.肽為了證明FOXMl衍生的肽發(fā)揮被CTL所識別的抗原的功能，對FOXMl (SEQ ID NO 34)衍生的肽進(jìn)行分析以確定它們是否為HLA-AM(它們是常見的HLA等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al.，Tissue 抗原 s 47 :93-101,1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；Kubo RT et al.，J Immunol152 :3913_24，1994)?；谒鼈儗LA-AM的結(jié)合親和力來鑒定FOXMl衍生的HLA-AM結(jié)合肽的候選者。下述肽是候選肽F0XMl-A24-9-316(SEQIDNO:1),
F0XM1-A24-9-262(SEQIDNO:2),
F0XMl-A24-9-451(SEQIDNO:3),
F0XM1-A24-9-455(SEQIDNO:4)，
F0XM1-A24-9-483(SEQIDNO:5),
F0XM1-A24-9-443(SEQIDNO:6),
F0XMl-A24-9-351(SEQIDNO7),F0XM1-A24-9-57(SEQ ID NO 8),F0XMl-A24-9-133(SEQ ID NO 9),F0XMl-A24-9-754(SEQ ID NO :10)，F(xiàn)0XM1-A24-9-429 (SEQ ID NO: 11)，F(xiàn)0XM1-A24-9-436(SEQ ID NO :12)，F(xiàn)0XMl-A24-9-524(SEQ ID NO :13)，F(xiàn)0XM1-A24-9-241(SEQ ID NO :14)，F(xiàn)0XM1-A24-10-627(SEQ ID NO :15)，F(xiàn)0XM1-A24-10-240(SEQ ID NO :16)，F(xiàn)0XM1-A24-10-777(SEQ ID NO :17)，
F0XM1-A24-10-453 (SEQ ID NO: 18)，F(xiàn)0XM1-A24-10-382(SEQ ID NO :19)，F(xiàn)0XM1-A24-10-483(SEQ ID NO :20)，F(xiàn)0XM1-A24-10-435(SEQ ID NO :21)，F(xiàn)0XM1-A24-10-396(SEQ ID NO :22)，F(xiàn)0XM1-A24-10-325(SEQ ID NO :23)，F(xiàn)0XM1-A24-10-443(SEQ ID NO :24)，F(xiàn)0XM1-A24-10-318(SEQ ID NO :25)，F(xiàn)0XM1-A24-10-713(SEQ ID NO :26)，F(xiàn)0XM1-A24-10-513(SEQ ID NO :27)，F(xiàn)0XM1-A24-10-7(SEQ ID NO :28)，F(xiàn)0XM1-A24-10-376(SEQ ID NO :29)，F(xiàn)0XM1-A24-10-390(SEQ ID NO :30)，F(xiàn)0XM1-A24-10-238(SEQ ID NO :31)，和F0XM1-A24-10-264(SEQ ID NO :32)。用加載了這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞后，使用每個下述肽，成功地建立了 CTL F0XM1-A24-9-262(SEQ ID NO 2),F0XMl-A24-9-351(SEQ ID NO 7),F0XM1-A24-9-57(SEQ ID NO 8),F0XM1-A24-10-240 (SEQ ID NO: 16)，F(xiàn)0XM1-A24-10-318(SEQ ID NO :25)，F(xiàn)0XM1-A24-10-390(SEQ ID NO :30)，和F0XM1-A24-10-238(SEQ ID NO :31)。這些建立的CTL針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞顯示強(qiáng)且特異性的CTL活性。這些結(jié)果證明FOXMl是被CTL識別的抗原，且測試的肽是FOXMl的受HLA-AM限制的表位肽。由于FOXMl基因在諸如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤的癌細(xì)胞中過表達(dá)且在大多數(shù)正常器官中不表達(dá)，它是良好的免疫治療靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供對應(yīng)于F0XM1的被CTL識別的表位的九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸殘基組成的肽)?；蛘?，本發(fā)明提供了分離的能結(jié)合HLA抗原并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的肽，其中該肽由SEQ ID NO 34的氨基酸序列組成或是它的免疫學(xué)活性片段。本發(fā)明的九肽和十肽的優(yōu)選例子包括那些由選自 SEQ ID NO :2，7，8，16，25，30和31的氨基酸序列組成的肽。一般而言，目前可以通過例如互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序，諸如Parker KC etal. , J Immunol 1994Jan 1,152(1) :163-75,Buus et al. (Tissue Antigens. ，62 :378-84,2003)， 和 Nielsen et al. (Protein Sci.，12 :1007-17，2003，Bioinformatics，20(9) : 1388-97， 2004)中描述的那些，可以用來在計(jì)算機(jī)上(insilico)計(jì)算不同肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如Parker KC et al.，J Immunol 1994Jan1,152(1) :163-75和Kuzushima K et al. ,Blood 2001,98(6) 1872-81 中描述的那樣進(jìn)行測定。用于測定結(jié)合親和力的方法在例如Journal of Immunological Methods, 1995,185 181-190. ；Protein Science，2000，9 1838-1846中有描述。因此，可使用此類軟件程序來選擇與HLA抗原具有高結(jié)合親和力的自F0XM1衍生的片段。因此，本發(fā)明涵蓋由任何使用這些已知程序鑒定的、可與HLA抗原結(jié)合的F0XM1衍生的片段組成的肽。本發(fā)明的肽可以是由全長F0XM1組成的肽。本發(fā)明的這些肽的側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基，只要所得肽保持其CTL誘導(dǎo)能力即可。本發(fā)明肽的側(cè)翼的氨基酸序列可以由任何種類的氨基酸構(gòu)成，只要它們不損害原來的肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明涵蓋包括自F0XM1衍生的肽且具有對HLA抗原的結(jié)合親和力的肽。這樣的肽典型地少于約40個氨基酸，經(jīng)常少于約20個氨基酸，通常少于約15個氨基酸。一般而言，肽中一個、兩個、或更多個氨基酸的修飾不會影響肽的功能，而且在有些情況下甚至?xí)鰪?qiáng)原始蛋白質(zhì)的期望功能。事實(shí)上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原始參照序列相比其中修飾(即替換、刪除、添加或插入)一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland et al. , Proc NatlAcad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有選自SEQ ID NO =2,7,8,16,25,30 和31的氨基酸序列中添加、插入和/或替換一個、兩個或甚至更多個氨基酸而得到的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，改變氨基酸序列中的單個氨基酸或少數(shù)百分比氨基酸的個別添加或替換往往會導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性得以保留。因此，它們經(jīng)常稱作“保守替換”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致具有與原始蛋白質(zhì)類似的功能的修飾蛋白質(zhì)。 提供功能上相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。期望保留的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A, I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K， S，T)、和具有下面的共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈 (S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組各自含有本領(lǐng)域公認(rèn)互為保守替換的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守修飾，只要該修飾的肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除F0XM1的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的可誘導(dǎo)CTL的肽。
為了保持所需的CTL誘導(dǎo)能力，可以修飾(插入、刪除、添加和/或替換)少數(shù)(例如，1個、2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語“數(shù)個”意指5個以下的氨基酸，如 4個、3個或更少。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20%以下，更優(yōu)選15%以下，甚至更優(yōu)選10%以下或1-5%。此外，可對本發(fā)明的肽插入、替換或添加氨基酸殘基或者可刪除氨基酸殘基以實(shí)現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。當(dāng)在免疫療法的語境中使用時(shí)，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上，優(yōu)選作為與HLA抗原的復(fù)合物。除了天然被展示的肽之外，由于已經(jīng)知道通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律(J Immunol 1994,152 3913 ；Immunogenetics 1995， 41 178 J Immunol 1994，155 :4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入本發(fā)明的免疫原性肽。例如，可能希望進(jìn)行替換，將自N端起第二個氨基酸替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，和/或?qū)⑽挥贑端的氨基酸替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸，以提高HLA-A24結(jié)合。因此，具有選自SEQ IDNO :2，7，8，16，25，30和31的氨基酸序列，其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列中自N端起第二個氨基酸被替換為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸和/或所述SEQ ID NO的氨基酸序列中位于C端的氨基酸被替換為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明還考慮向所述肽的N和/或C端添加一個、兩個或數(shù)個氨基酸。此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同時(shí)，可能誘導(dǎo)副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此，優(yōu)選的是，首先利用可得的數(shù)據(jù)庫實(shí)施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了即使與目標(biāo)肽相比差1個或2個氨基酸的肽亦不存在時(shí)，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險(xiǎn)。雖然預(yù)期如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但還是對根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標(biāo)選出的候選肽檢查了 CTL誘導(dǎo)能力的存在。這里，短語 “CTL誘導(dǎo)能力”指肽被呈遞到抗原呈遞細(xì)胞(APC)上時(shí)誘導(dǎo)CTL的能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進(jìn)CTL溶解靶細(xì)胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實(shí)現(xiàn)，誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的APC (例如B-淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞(DC))，或者更具體地說，衍生自人外周血單核白細(xì)胞的DC，并且在用肽誘導(dǎo)后，與CD8陽性細(xì)胞混合，然后測量由CTL針對靶細(xì)胞生成和釋放的IFN-γ。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達(dá)人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L，Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000Aug,61 (8) 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by aminimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR ltransgenic mice :dependence onHLA class II restricted T(H)response中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記靶細(xì)胞，并且可以自靶細(xì)胞釋放的放射性計(jì)算細(xì)胞毒性活性?；蛘撸珻TL誘導(dǎo)能力可以如下評估測量在攜帶固定化肽的APC存在下由CTL生成和釋放的IFN- γ，并使用抗IFN- γ單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。
作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選自由SEQ ID NO =2,7,8,16, 25，30和31所示的氨基酸序列組成的肽的九肽或十肽顯示特別高的CTL誘導(dǎo)能力以及對 HLA抗原的高親和力。因此，例舉這些肽為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。另外，同源性分析的結(jié)果顯示了那些肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒有顯著的同源性。這降低了用于免疫療法時(shí)未知的或不想要的免疫應(yīng)答的可能性。因此， 也是根據(jù)這個方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對FOXMl的免疫力。因此，本發(fā)明的肽，優(yōu)選由選自SEQ ID NO :2，7，8，16，25，30和31的氨基酸序列組成的肽。除上文討論的對本發(fā)明肽的修飾之外，可將所述肽進(jìn)一步連接至其它物質(zhì)，只要它們保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。例示性的物質(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然的和合成的聚合物等。本發(fā)明肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、和/或磷酸化，只要該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性。這些種類的修飾可賦予額外的功能(例如靶向功能和投遞功能)和/或使肽穩(wěn)定。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽?？梢砸远喾N方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoef et al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 此外，如上所述，在替代、刪除或添加1個、2個或數(shù)個氨基酸殘基的經(jīng)修飾肽中， 可篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選或選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的修飾肽的方法。例如，該方法可包括下述步驟a 替代、刪除或添加本發(fā)明肽中的至少一個氨基酸殘基；b:測定所述肽的活性；c 選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。本文中，本發(fā)明的肽也可以記為“F0XM1肽”或“F0XM1多肽”。III. FOXMl 肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為由兩個或更多個肽構(gòu)成的較長多肽。 然后可以分離，即純化或分離所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化；只要該修飾不破壞本文所述肽的生物學(xué)活性。其它修飾包括摻入D-氨基酸或其它氨基酸模擬物，其可用于例如延長肽的血清半衰期?？梢愿鶕?jù)選定的氨基酸序列，借助化學(xué)合成來獲得本發(fā)明的肽?？蛇m用于合成的常規(guī)肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；(iii)P印tide Synthesis (日文)，Maruzen Co.，1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis ( H JC ) Maruzen Co., 1985 ；
(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67^8 ；禾口(vii)Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, “ Solid Phase PeptideSynthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118?；蛘?，可應(yīng)用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss，Methodsin Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達(dá)形式(例如處于相當(dāng)于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游)的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)移入合適宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生產(chǎn)肽。IV.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括由天然存在型F0XM1 基因(GenBank Accession No. NM_202002. 1 (SEQ ID NO 33))衍生的多核苷酸以及具有它們的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“保守修飾的核苷酸序列”指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng)所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以修飾核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、或其衍生物構(gòu)成。正如本領(lǐng)域公知的，DNA分子由堿基諸如天然存在的堿基A、T、C、和G構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。技術(shù)人員會認(rèn)識到，多核苷酸中也包括非天然存在的堿基。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，有或無居間氨基酸序列存在。例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點(diǎn)(例如酶識別序列)。另外，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表達(dá)肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達(dá)載體(質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn)染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達(dá)的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可借助PCR技術(shù)或通過在合適宿主中的表達(dá)來擴(kuò)增多核苷酸(參見例如Sambrooket al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York, 1989)。或者，可使用固相技術(shù)來合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.，EMBO J 1984,3 :801-5 中記載的。V.夕卜來體(exosomes)
本發(fā)明進(jìn)一步提供了稱作外來體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報(bào)平11-510507和W099/03499中詳細(xì)描述的方法來制備，并可以用從治療和/或預(yù)防所針對的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進(jìn)行接種。復(fù)合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的類型匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24(特別是A*2402)是普遍的且因此會適合于治療日本患者。使用在日本人和白種人中高表達(dá)的A24型有利于獲得有效的結(jié)果。典型的，在臨床上， 預(yù)先考察需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠合適地選擇對特定抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。此外，為了獲得具有高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力二者的肽，可以在天然存在的FOXMl部分肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行1個、2個或幾個氨基酸的取代、插入和/或添加。在將A24型HLA抗原用于本發(fā)明的外來體的情況中，可使用具有SEQ IDNO ,2,1, 8，16，25，30和31中的任一序列的肽。VI.抗原旱.遞細(xì)胞(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的分離的APC。APC可來源于要進(jìn)行治療和/或預(yù)防的患者，而且可以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或CTL)組合作為疫苗來施用。APC不限于特定種類的細(xì)胞，包括DC、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì)胞識別。由于DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，DC可以用作本發(fā)明的APC。例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸(刺激)它們來獲得本發(fā)明的APC。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時(shí)，在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈遞本發(fā)明肽的APC。因此，本發(fā)明的APC可通過將本發(fā)明的肽施用于受試者后自受試者收集APC來獲得?；蛘?，本發(fā)明的APC可通過使自受試者收集的APC接觸本發(fā)明的肽來獲得。本發(fā)明的APC可單獨(dú)地或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL)組合地施用于受試者以在受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。例如，離體施用可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b 使肽接觸步驟a的APC ；并c 對第二受試者施用步驟b的APC。第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。通過步驟b獲得的APC可作為疫苗來施用，用于治療和/或預(yù)防癌癥，包括AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、 膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。本發(fā)明還提供一種制備誘導(dǎo)APC的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法包括將本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的載體混合或配制的步驟。 依照本發(fā)明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語“高水平的 CTL誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對于未與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC可通過上文所述方法以及包括在體外將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)移至APC的步驟的方法來制備。所導(dǎo)入的基因可以是DNA 或RNA的形式。用于進(jìn)行導(dǎo)入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的各種方法，諸如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res 1996， 56 5672-7 J Immunol 1998，161 :5607_13 ;J Exp Med 1996，184 :465_72 ；國際公開文本 No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實(shí)施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細(xì)胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的肽VII.細(xì)胞毒件T淋巴細(xì)胞(CTL)被誘導(dǎo)的針對任何本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強(qiáng)靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并且因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供由任何本發(fā)明肽特異性誘導(dǎo)或活化的、分離的CTL。此類CTL可通過下述步驟來獲得(1)對受試者施用本發(fā)明的肽，從該受試者收集 CTL ；或(2)在體外用本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APC和CD8陽性細(xì)胞、或外周血單核白細(xì)胞，然后分離CTL;或(3)在體外使CD8-陽性細(xì)胞或外周血單個核白細(xì)胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的APC或外來體，然后分離CTL ；或 (4)將包括編碼T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的多核苷酸的基因?qū)隒TL，所述TCR亞單位能結(jié)合本發(fā)明的肽。上述APC和外來體可通過上文記載的方法來制備，且(4)之方法詳述于下文“VIII. T細(xì)胞受體(TCR) ”部分。可以從要進(jìn)行治療和/或預(yù)防的患者獲取本發(fā)明的CTL，而且可以將它們單獨(dú)施用，或者與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體)組合施用以調(diào)節(jié)效果。所得到的CTL特異性針對呈遞本發(fā)明的肽(例如與用于誘導(dǎo)的肽)相同的肽的靶細(xì)胞起作用。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)FOXMl的細(xì)胞，諸如癌細(xì)胞，或被FOXMl基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。VIII. T 細(xì)胞受體(TCR)本發(fā)明還提供包含編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)的亞單位的多肽的核酸的多核苷酸，及使用該組合物的方法。TCR亞基具有形成賦予T細(xì)胞針對表達(dá)FOXMl的腫瘤細(xì)胞的特異性的TCR的能力。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出用本發(fā)明的一種或多種肽誘導(dǎo)的CTL的TCR亞基α和β鏈的核酸(W02007/032255及Morgan et al.，J Immunol, 171，3288 (2003))。例如，優(yōu)選使用PCR方法來分析TCR。用于分析的PCR引物可以是但不限于例如作為5'側(cè)引物的5' -R引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3 ‘) (SEQ ID NO 35)和作為3 ‘側(cè)引物的對TCRa鏈C區(qū)特異性的3_TRa_C引物 (5 ‘ -tcagctggaccacagccgcagcgt-3 ‘ ) (SEQID NO 36)、對 TCR β 鏈 Cl 區(qū)特異性的 3-TRb-Cl 引物(5' -tcagaaatcctttctcttgac-3‘ ) (SEQ ID NO :37)或?qū)?TCRβ 鏈 C2 區(qū)特異性的 3-TRbeta_C2 引物(5' -ctagcctctggaatcctttctctt-3 ‘ ) (SEQ ID NO :38)。衍生的TCR能以高親合力結(jié)合展示FOXMl肽的靶細(xì)胞，且任選在體內(nèi)和在體外介導(dǎo)有效的對呈遞FOXMl肽的靶細(xì)胞的殺傷。可以將編碼TCR亞基的核酸摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領(lǐng)域公知的。通常可將核酸或含有它們的載體轉(zhuǎn)移入T細(xì)胞，例如來自患者的T細(xì)胞。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型(off-the-shelf)組合物，其容許快速修飾患者自己的T細(xì)胞(或其他哺乳動物的T細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的修飾型T細(xì)胞。特異性TCR是一種能夠特異性識別本發(fā)明肽和HLA分子形成的復(fù)合物的受體，當(dāng) TCR在T細(xì)胞的表面上呈遞時(shí)，它給予T細(xì)胞針對靶細(xì)胞的特異性活性。對上述復(fù)合物的特異性識別可通過任何已知方法來確認(rèn)，優(yōu)選的方法包括例如使用HLA分子和本發(fā)明肽的四聚物分析，及ELISP0T測定法。通過實(shí)施ELISP0T測定法，可以確認(rèn)在細(xì)胞表面上表達(dá)TCR 的T細(xì)胞通過TCR來識別細(xì)胞，而且信號在細(xì)胞內(nèi)傳輸。也可通過已知方法來確認(rèn)當(dāng)上文所述復(fù)合物存在于T細(xì)胞表面上時(shí)該復(fù)合物可給予T細(xì)胞以細(xì)胞毒性活性。一種優(yōu)選的方法包括例如測定針對HLA陽性靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，諸如鉻釋放測定法。此外，本發(fā)明提供通過用編碼在HLA-A24的背景下結(jié)合例如SEQ ID N0:2，7，8， 16，25，30和31的FOXMl肽的TCR亞單位多肽的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的CTL。經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL在體內(nèi)能夠歸巢(homing)到癌細(xì)胞，并且可以利用公知的體外培養(yǎng)方法擴(kuò)增(例如Kawakami et al.，J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。可以利用本發(fā)明的CTL來形成免疫原性組合物，所述組合物可以用來在需要治療或保護(hù)的患者中治療或預(yù)防癌癥(W02006/031221)。IX.藥用物質(zhì)或組合物術(shù)語“預(yù)防”和“防范”包括降低來自疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病進(jìn)展和癥狀出現(xiàn)以及降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動，這通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來實(shí)現(xiàn)。或者，預(yù)防和防范包括廣泛的預(yù)防療法，它們旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性，例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移、降低血管發(fā)生。治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)清除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防降低患癌個體的死亡率并改善其預(yù)后，降低血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。由于FOXMl表達(dá)在癌癥(包括AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤)中與正常組織相比特異性升高，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥用物質(zhì)或組合物，其包括一種或多種本發(fā)明肽或編碼所述肽的多核苷酸作為活性組分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì)胞諸如APC的表面上表達(dá)本發(fā)明的肽，以用作藥用物質(zhì)或組合物。 另外，上述靶向任何本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明藥用物質(zhì)或組合物的活性組分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性組分在制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或物質(zhì)中的用途(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，
(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APC，和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于治療癌癥或腫瘤的選自下組的活性組分(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCJP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞?；蛘?，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體與選自下組的活性組分作為活性組分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCJP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物或物質(zhì)的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體的步驟，其中所述活性組分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)處于可表達(dá)形式的編碼如本文中公開的肽的核酸，(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的外來體或APCjP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞?；蛘撸景l(fā)明的藥物組合物或物質(zhì)可用于防范癌癥或腫瘤和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩， 特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID NO :2，7，8，16，25，30和31任一的氨基酸序列的肽是HLA-A24限制性表位肽或能誘導(dǎo)針對表達(dá)強(qiáng)且特異性的免疫應(yīng)答的候選者。因此， 包括任何這些具有SEQ ID N0:2，7，8，16，25，30和31的氨基酸序列的肽的本發(fā)明藥用物質(zhì)或組合物特別適合于對其HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。這同樣適用于含有編碼任何這些肽的多核苷酸(即本發(fā)明的多核苷酸)的藥用物質(zhì)和藥物組合物。要用本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物治療的癌癥或腫瘤不受限制，包括其中涉及(例如過表達(dá))FOXMl的任何癌癥或腫瘤，包括例如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、 CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、 前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。除上述活性組分之外，本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物還可含有其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其它細(xì)胞等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原(例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要， 本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性組分，只要該物質(zhì)不抑制活性組分例如任何本發(fā)明肽的抗腫瘤效果。例如，配制劑可包括抗炎物質(zhì)、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì)之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學(xué)物質(zhì)順序或同時(shí)施用。藥物和藥理學(xué)物質(zhì)的量取決于例如所使用的藥理學(xué)物質(zhì)的類型、所治療的疾病、及施用的時(shí)序安排和路徑。應(yīng)當(dāng)理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它組合物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可包括在制品和試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制品可包括任何本發(fā)明藥用物質(zhì)或組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和試管。 容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該組合物用于治療或預(yù)防一種或多種疾病狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥用物質(zhì)或組合物的試劑盒還可任選進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受稀釋劑。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝插頁。如果期望的話，藥用物質(zhì)或組合物可存在于藥包或分配器裝置中，該藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性組分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。(1)含有肽作為活性組分的藥用物質(zhì)或組合物本發(fā)明的肽可以作為藥用物質(zhì)或組合物直接施用，或者如果必要，通過常規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，在本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物的載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液、等等。另外，藥用物質(zhì)或組合物可在必要時(shí)含有穩(wěn)定劑、懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可用于抗癌目的。本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。肽組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將肽化學(xué)連接或表達(dá)成為單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度呈遞在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘?，自受試者取出APC(例如DC)，然后用本發(fā)明的肽刺激以獲得在其細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的APC。將這些APC再施用于受試者以在受試者中誘導(dǎo)CTL， 結(jié)果能提高針對腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的攻擊性。包括本發(fā)明肽作為活性組分、用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤的藥用物質(zhì)或組合物還可包括已知可有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的佐劑。或者，藥用物質(zhì)或組合物可以與其它活性組分一起施用，或通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì)一起(或順序)施用時(shí)增強(qiáng)針對蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括文獻(xiàn)中記載的那些(Clin Microbiol Rev 1994，7 :277_89)。合適佐劑的例子包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、諸如此類，但不限于此。另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制齊U、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽也可以以藥學(xué)可接受鹽的形式施用。 鹽的優(yōu)選例子包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機(jī)堿的鹽、與有機(jī)酸的鹽和與無機(jī)酸的
Τττ . ο 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物可進(jìn)一步包括引發(fā)(Prime)CTL 的成分。已經(jīng)將脂質(zhì)鑒定為能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的物質(zhì)。例如，可將棕櫚酸殘基附著至賴氨酸殘基的和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體施用，或在佐劑中乳化后施用。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL應(yīng)答的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半胱氨酰-絲氨酰-絲氨酸(P3CSS)，當(dāng)共價(jià)附著至適宜的肽時(shí)，可用來引發(fā)CTL(參見例如Deres et al., Nature 1989,342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化。本發(fā)明肽的劑量可以依照要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，而且通常是 0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥用物質(zhì)或組合物本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物也可含有處于可表達(dá)形式的編碼本文中公開的肽的核酸。在本文中，短語“處于可表達(dá)形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)會在體內(nèi)表達(dá)成能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實(shí)施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組所需的配置(關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51 :503_12)。參見例如 Wolff et al.，Science 1990,247 1465-8 ； U. S. Patent Nos. 5，580，859 ；5，589，466 ；5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ； 和TO98/04720。基于DNA的投遞技術(shù)的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國專利 No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達(dá)。表達(dá)載體的例子包括減毒病毒宿主， 諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如痘苗病毒作為載體來表達(dá)編碼肽的核苷酸序列。 在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達(dá)免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng)答?？捎糜诿庖呓臃N方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體是BCG (卡介苗)。BCG 載體記載于Stover et al.，Nature 1991,351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如Shataet al., Mol Med Today 2000,6 :66_71 ；Shedlock et al.，J Leukoc Biol 2000,68 :793_806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。將多核苷酸投遞入受試者可以是直接的，在該情況中受試者直接暴露于攜帶多核苷酸的載體，或者是間接的，在該情況中首先在體外用感興趣多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。

關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 488-505 ；Wu 禾口 Wu，Biotherapy 1991,3 87-95 ；Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993,33 573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 926-32 ；Morgan & Anderson，Arm Rev Biochem 1993,62 191-217 ；Trends inBiotechnology 1993,11(5) 155-215。重組DNA技術(shù)領(lǐng)域普遍知道的也可用于本發(fā)明的方法記載于eds. Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993 ；禾口 Krieger, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點(diǎn)附近。施用可以通過單次施用來實(shí)施，或者通過多次施用來強(qiáng)化?？梢砸勒找委煹募膊　⒒颊叩哪挲g、重量、施用的方法等等恰當(dāng)調(diào)整合適載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量，而且通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。X.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外來體和APC也可用于誘導(dǎo)CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要該化合物不抑制它們的CTL誘導(dǎo)能力。因此，任何上述本發(fā)明藥用物質(zhì)或組合物均可用于誘導(dǎo)CTL，而且在它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文討論解釋的。(1)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導(dǎo)或制備具有高CTL誘導(dǎo)能力的 APC的方法。本發(fā)明的方法包括在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽接觸APC的步驟。例如，離體用肽接觸APC的方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;并b 用肽接觸步驟a的APC。APC不限于特定種類的細(xì)胞，而且包括DC、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì)胞識另IJ。由于DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)能力的，可優(yōu)選使用DC。任何本發(fā)明肽可以以它們自身或與其它本發(fā)明肽組合用作步驟b的肽?；蛘?，可以將本發(fā)明的肽施用于受試者以在體內(nèi)使肽接觸APC。因此，能在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明還涵蓋將本發(fā)明的肽施用于受試者以在體內(nèi)誘導(dǎo)APC的方法。也有可能將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸以可表達(dá)形式施用于受試者，使得本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達(dá)并與APC接觸，結(jié)果在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL 誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明還涵蓋將本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者以在體內(nèi)誘導(dǎo)APC 的方法。上文“IX.藥用物質(zhì)或組合物(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥用物質(zhì)或組合物”部分定義了短語“可表達(dá)形式”。
另外，本發(fā)明包括將本發(fā)明的多核苷酸導(dǎo)入APC以誘導(dǎo)或制備具有CTL誘導(dǎo)能力的APC。例如，該方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;并b 導(dǎo) 入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。步驟b可如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分中所述來實(shí)施?；蛘?，本發(fā)明提供了一種用于制備能特異性誘導(dǎo)針對FOXMl的CTL活性的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中該方法包括下述步驟之一(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸本發(fā)明的肽；和(b)將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。(2)誘導(dǎo)CTL的方法另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、或外來體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。本發(fā)明還提供了使用編碼能夠形成如下的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位的肽的多核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，其中該T細(xì)胞受體(TCR)亞單位識別本發(fā)明的肽和HLA抗原形成的復(fù)合物。優(yōu)選地，用于誘導(dǎo)CTL的方法包括至少一個選自下組的步驟a)使CD8陽性T細(xì)胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞和/或外來體；和b)將編碼能夠形成如下的TCR亞單位的多肽的多核苷酸導(dǎo)入CD8陽性細(xì)胞，其中該識別本發(fā)明的肽和HLA抗原形成的復(fù)合物。當(dāng)本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC、或外來體被施用給受試者后，在受試者的身體中誘導(dǎo)出CTL，并增強(qiáng)靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。因此，本發(fā)明還涵蓋一種方法，其包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用于受試者以誘導(dǎo)CTL的步驟?；蛘?，CTL也可通過它們的離體使用來誘導(dǎo)。在此類情況中，在誘導(dǎo)CTL后，會將活化的CTL返還受試者。例如，本發(fā)明誘導(dǎo)CTL的方法可包括下述步驟a)自受試者收集APC;b)用肽接觸步驟a)的APC ；并c)將步驟b的APC與⑶8陽性細(xì)胞共培養(yǎng)。上文步驟c中要與⑶8陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分所述；但是不限于此，而且任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的APC可用于本發(fā)明的方法。代替此類APC，也可使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來體。S卩，本發(fā)明還涵蓋一種方法，其中將在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的外來體與CD8陽性細(xì)胞共培養(yǎng)。此類外來體可通過上文“V.外來體”部分中描述的方法來制備。另外，可通過將包括編碼能與本發(fā)明的肽結(jié)合的TCR亞單位的多核苷酸的基因?qū)擘?陽性細(xì)胞來誘導(dǎo)CTL。此類轉(zhuǎn)導(dǎo)可如上文“VIII. T細(xì)胞受體(TCR) ”部分中所述來實(shí)施。另外，本發(fā)明提供了一種用于制造包括CTL藥用物質(zhì)或組合物的方法或工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受載體的步驟。
(3)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法此外，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)針對涉及FOXMl的疾病的免疫應(yīng)答的方法。合適的疾病包括癌癥，其例子包括AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、 食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、 SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。該方法包括施用含有任何本發(fā)明肽或其編碼多核苷酸的物質(zhì)或組合物的步驟。本發(fā)明的方法還涵蓋施用呈遞任何本發(fā)明肽的外來體或APC。關(guān)于詳情參見“IX.藥用物質(zhì)或組合物”部分，特別是描述本發(fā)明的藥用物質(zhì)或組合物作為疫苗的用途的部分。另外，可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的本發(fā)明方法的外來體和APC詳細(xì)描述于上文“V.外來體”、“VI.抗原呈遞細(xì)胞(APC) ”、和“X.使用肽、外來體、APC和CTL”的(1)和⑵部分。本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的藥用物質(zhì)或組合物的方法或工藝， 其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受載體的步驟?；蛘?，本發(fā)明的方法可包括施用疫苗或藥物組合物的步驟，所述疫苗或藥物組合物包含(a)本發(fā)明的肽；(b)處于可表達(dá)形式的編碼本文中公開的此類肽的核酸；(c)在其表面上呈遞本發(fā)明肽的APC或外來體；和(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在本發(fā)明中，過表達(dá)FOXMl的癌癥可用這些活性組分來治療。所述癌癥包括但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。因而，在施用包含活性組分的疫苗或藥物組合物之前，優(yōu)選確認(rèn)要治療的癌細(xì)胞或組織中的FOXMl表達(dá)水平與相同器官的正常細(xì)胞相比是否增強(qiáng)了。因此，在一個實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了用于治療(過)表達(dá)FOXMl的癌癥的方法，該方法可包括下述步驟i)測定自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的FOXMl表達(dá)水平；ii)與正常對照比較FOXMl表達(dá)水平；并iii)對具有與正常對照相比過表達(dá)FOXMl的癌癥的受試者施用至少一種選自上文所述(a)至(d)的成分?；蛘?，本發(fā)明還提供了包含至少一種選自上文所述(a)至(d) 的成分的疫苗或藥物組合物，其用于對具有過表達(dá)FOXMl的癌癥的受試者施用。換言之，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于鑒定要用本發(fā)明FOXMl多肽來治療的受試者的方法，所述方法可包括測定源自受試者的癌細(xì)胞或組織中的FOXMl表達(dá)水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該受試者具有可用本發(fā)明FOXMl多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法將在下面更加詳細(xì)的加以敘述。要用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據(jù)本發(fā)明，測定在自受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中FOXMl的表達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平確定，使用本領(lǐng)域已知方法。舉例而言，F(xiàn)OXMl的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈?shí)施所述檢測。對檢測FOXMl的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用FOXMl的序列信息制備上述探針。舉例而言，F(xiàn)OXMl的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生了雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度檢測。進(jìn)一步，F(xiàn)OXMl的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO 34)可通過基于擴(kuò)增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制備。 具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與FOXMl的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察至IJ。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^量存在，因此在Tm，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會是這樣的其中鹽濃度小于大約1. OM鈉離子，典型地大約 0.01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，對于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實(shí)現(xiàn)?；蛘撸梢詸z測翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定FOXMl蛋白(SEQ ID NO 34)的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，其使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv,Fab,F(ab' )2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對FOXMl蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些種類的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另一種基于FOXMl的翻譯產(chǎn)物檢測FOXMl基因表達(dá)水平的方法，可利用針對 FOXMl蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析觀察染色的強(qiáng)度。意即，在此測量中，強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)存在/水平增加，且同時(shí)表明FOXMl基因的高表達(dá)水平。對于靶基因例如包括FOXMl基因在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平而言，如果該水平較之相應(yīng)靶基因的對照水平(例如在正常細(xì)胞中的水平)增加了例如10%、25%或50%，或增加到超過1. 1倍、超過1. 5倍、超過2. 0倍、超過5. 0倍、超過10. 0倍或者更多的話，可以確定該水平是增加的。對照水平可以與癌細(xì)胞同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細(xì)胞可用作正常對照?；蛘撸瑢φ账娇梢越柚y(tǒng)計(jì)方法，基于通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的FOXMl基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對照水平可以是來自先前測試過的細(xì)胞的表達(dá)樣式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中FOXMl基因的表達(dá)水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與受試者衍生生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且， 優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中FOXMl基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如，平均值士2S.D.或平均值士3S.D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。
在本發(fā)明的語境中，從已知為非癌性的生物學(xué)樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物學(xué)樣品確定，則稱作“癌性對照水平”。當(dāng)FOXMl基因的表達(dá)水平相比正常對照水平有所提高或與癌性對照水平相似/等同，則受試者可診斷為具有要治療的癌癥。更具體地，本發(fā)明提供了一種(i)診斷受試者是否具有要治療的癌癥，和/或(ii)選擇受試者進(jìn)行癌癥治療的方法，該方法包括下述步驟a)測定FOXMl在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平；b)將FOXMl的表達(dá)水 平與正常對照水平比較；c)若FOXMl的表達(dá)水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟C)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進(jìn)行癌癥治療。或者，此類方法包括下述步驟a)測定FOXMl在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中的表達(dá)水平；b)將FOXMl的表達(dá)水平與癌性對照水平比較；c)若FOXMl的表達(dá)水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要治療的癌癥；并d)若在步驟C)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進(jìn)行癌癥治療。本發(fā)明還提供了用于確定患有癌癥的受試者是否能用本發(fā)明FOXMl多肽來治療的試劑盒，其亦可用于評價(jià)和/或監(jiān)測癌癥免疫療法功效。優(yōu)選地，所述癌癥包括但不限于 AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)腸直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸腫瘤。 更特別地，所述試劑盒優(yōu)選包含至少一種在受試者衍生癌細(xì)胞中檢測FOXMl基因表達(dá)的試齊U，所述試劑可選自下組(a)檢測FOXMl基因的mRNA的試劑；(b)檢測FOXMl的蛋白質(zhì)的試劑；和(c)檢測FOXMl的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的試劑。適于檢測FOXMl基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或鑒定FOXMlmRNA的核酸，諸如具有與FOXMlmRNA的一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這些種類的寡核苷酸以對FOXMlmRNA 特異性的引物和探針為例?？苫诒绢I(lǐng)域眾所周知的方法制備這些種類的寡核苷酸。如果需要，檢測FOXMlmRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測FOXMlmRNA的試劑。另一方面，適于檢測FOXMl蛋白質(zhì)的試劑可包括針對FOXMl蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一步，所述抗體的任何片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述試劑，只要所述片段或經(jīng)修飾抗體保留與FOXMl蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備這些種類的抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價(jià)物。進(jìn)一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測FOXMl蛋白質(zhì)的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。舉例而言，從沒有癌癥或患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋 液、濾紙、針頭、注射器、和帶有使用說明的包裝插頁(例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等)。這些試劑之類的可與標(biāo)簽一起保留在容器中。 合適的容器包括瓶、管形瓶和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案，當(dāng)所述試劑是針對FOXMlmRNA的探針時(shí)，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位點(diǎn)。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位點(diǎn)?；蛘?，對照位點(diǎn)可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位點(diǎn)可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位點(diǎn)上量較大而在接下來的位點(diǎn)上量較小。在添加測試樣品之后，展示可檢測信號位點(diǎn)的數(shù)目提供了在樣品中存在的FOXMlmRNA量的定量指征。所述檢測位點(diǎn)可配置成任何合適可檢測的形狀，并通常是橫跨測試條寬度的條狀或點(diǎn)狀。本發(fā)明所述試劑盒可進(jìn)一步包括陽性對照樣品或FOXMl標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集FOXMl陽性樣品，隨后測定其FOXMl水平來制備?；蛘撸蓪⒓兓腇OXMl蛋白或多核苷酸添加到不表達(dá)FOXMl的細(xì)胞中以形成所述陽性樣品或FOXMl樣品。在本發(fā)明中，純化的FOXMl可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的FOXMl水平大于截留值。提供下面的實(shí)施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā)明。實(shí)施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例材料和方法細(xì)胞系HLA_A*2402陽性B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系TISI購自IHWG Cell and GeneBank (Seattle, WA)。非洲綠猴腎細(xì)胞系C0S7購自ATCC。FOXMl衍生的肽的候選者的選擇使用結(jié)合預(yù)測軟件“BIMAS“ (www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_bind) (Parker et al. (J Immunol 1994，152(1) : 163-75)，Kuzushima et al. (Blood 2001， 98(6) : 1872-81))和〃 NetMHC3. 0 〃 (www. cbs. dtu. dk/services/NetMHC/)(Buus etal. (Tissue Antigens. ,62 :378-84,2003), Nielsen et al. (Protein Sci. ,12 :1007-17, 2003,Bioinformatics, 20 (9) 1388-97, 2004))預(yù)測了 F0XM1 衍生的結(jié)合 HLA_A*2402 分子的9聚物和10聚物肽。由Biosynthesis (Lewisville，Texas)依照標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成了這些肽，并通過反相高效液相層析(HPLC)進(jìn)行了純化。分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜術(shù)分析測定了肽的純度(> 90% )和身份。將肽以20mg/ml在二甲亞砜中溶解，并保存于_80°C。體外CTL誘導(dǎo)
使用單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞來誘導(dǎo)針對人白細(xì)胞抗原(HLA)上呈遞的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如別處(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112_8)所述在體外生成 DC。具體而言，將用 Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_A*2402陽性)分離的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)通過粘附至塑料組織培養(yǎng)皿(Becton Dickinson)來加以分離，以將它們作為單核細(xì)胞級分富集。在含有2%熱滅活自體血清(AS)的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen) 中在1000U/ml粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(R&D System)和1000U/ml白介素 (IL)-4(R&DSystem)存在下培養(yǎng)富集了單核細(xì)胞的群體。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于 37°C沖激3小時(shí)。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)DC相關(guān)分子，諸如⑶80、 ⑶83、⑶86和II類HLA(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC通過X輻照(20Gy)滅活，并以1 20比例與用⑶8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細(xì)胞混合。在48孔板(Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個孔在0. 5ml AIM_V/2% AS培養(yǎng)基中含有 1. 5xl04 個經(jīng)肽沖激的 DC、3xl05 個 CD8+T 細(xì)胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后，給這些培養(yǎng)物補(bǔ)充IL-2 (CHIRON)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進(jìn)一步刺激。每次均以與上文所述相同的方式來制備DC。在第21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的TISI細(xì)胞的CTL (Tanaka H et al. , Br J Cancer 2001Jan 5,84(1) :94_9 ；Umano Y et al. ,Br JCancer 200IApr 20,84(8) 1052—7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004Decl5，10(24) :8577_86 ；Watanabe T et al. ,Cancer Sci 2005Aug,96(8) 498-506 ；Suda T et al. , Cancer Sci 2006May,97(5) :411_9)。CTL擴(kuò)增規(guī)程使用與Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 19950ct 19，333 (16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb，2(2) :216_23)記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴(kuò)增CTL。將總共5x IO4個CTL在25ml AIM_V/5% AS培養(yǎng)基中懸浮，其中有在 40ng/ml抗⑶3單克隆抗體(Pharmingen)存在下經(jīng)絲裂霉素C滅活的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第 11天給培養(yǎng)物補(bǔ)加新鮮的含有30IU/ml IL-2的AIM-V/5% AS培養(yǎng)基(Tanaka H et al.， Br J Cancer 200IJan 5,84(1) :94_9 ；Umano Y et al. ,Br J Cancer 200IApr 20,84(8) 1052-7 ；Uchida N et al.，ClinCancer Res 2004Dec 15，10(24) :8577_86 ；Watanabe T et al. ， Cancer Sci 2005Aug,96(8) 498-506 ；Suda T et al. ， Cancer Sci 2006May,97(5) 411-9)。CTL克隆的建立在96圓底微量滴定板(Nalge Nunc International)中進(jìn)行稀釋以獲得0. 3、1、 和3個CTL/孔。在總共150微升/孔的含5% AS的AIM-V培養(yǎng)基中，將CTL與IxlO4個細(xì)胞/孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體、和125U/ml的IL-2 — 起培養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的IL-2以達(dá)到終濃度125U/ml的IL-2。在第14天測試CTL活性，并使用如上所述的相同方法擴(kuò)增CTL克隆(Uchida N et al. ,Clin Cancer Res 2004Dec 15，10 (24) 8577-86 ；SudaT et al.，Cancer Sci 2006May,97(5) 411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498_506)。
特異件CTL活件為了檢查特異性CTL活性，實(shí)施了干擾素(IFN)-Y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)測定法和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的TISI (IxlO4個細(xì)胞/孔)作為刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實(shí)施 IFN- y ELISP0T 測定法和 IFN- y ELISA 測定法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染通過PCR來擴(kuò)增編碼靶基因可讀框或HLA_A*2402的cDNA。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入 pCAGGS載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C0S7，C0S7是靶基因和HLA-A24陰性細(xì)胞系。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene (Invitrogen) 收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并用作CTL活性測定法的靶細(xì)胞(5X104個細(xì)胞/孔)。結(jié)果自FOXMl衍牛的HLA-A24結(jié)合肽的預(yù)測表Ia和Ib依高結(jié)合親和力的次序顯示FOXMl的HLA-A24結(jié)合9聚物和10聚物肽。通過 BIMAS 預(yù)測出 29 種肽(SEQ ID N0:l_12 和 SEQ ID NO 15-31)，而通過 NetMHC 3. O預(yù)測出3種肽(SEQ ID NO :13_14和SEQ ID NO 32)。選擇并檢查了總共32種具有潛在HLA-A24結(jié)合能力的肽以確定表位肽。表Ia 自FOXMl衍生的HLA-A24結(jié)合性9聚物肽
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合HLA抗原且具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中該肽由氨基酸序列SEQ ID NO :34或其免疫學(xué)活性片段組成。
2.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-AM。
3.權(quán)利要求1或2的分離的肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQID NO 2,7,8,16, 25,30 和 31。
4.權(quán)利要求2或3的分離的肽，其是九肽或十肽。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其由選自SEQID NO :2，7，8，16，25，30和31的氨基酸序列組成，其中插入、替換、刪除或添加了 1個、2個或幾個氨基酸。
6.權(quán)利要求4或5的肽，其具有下列特征之一或二者(a)N端起第二個氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸； 禾口(b)C端氨基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
7.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽。
8.一種用于誘導(dǎo)CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽或者一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
9.一種用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物，其中該組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽，或一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其配制為用于對HLA抗原為HLA-AM的受試者施用。
11.權(quán)利要求9或10的藥物組合物，其配制為用于治療癌癥。
12.一種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法，其中該方法包括下列步驟之一(a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC接觸權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽；和(b)將編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
13.一種用于誘導(dǎo)CTL的方法，其通過包括至少一個下述步驟的任何方法來進(jìn)行(a)共培養(yǎng)CD8-陽性T細(xì)胞與在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1_6中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物的APC ；(b)共培養(yǎng)CD8-陽性T細(xì)胞中與在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物的外來體；和(c)將包含編碼能夠結(jié)合權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽的T細(xì)胞受體(TCR)亞單位多肽的多核苷酸的基因?qū)隩細(xì)胞。
14.一種分離的APC，其在其表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽的復(fù)合物。
15.權(quán)利要求14的APC，其是通過權(quán)利要求12的方法誘導(dǎo)的。
16.一種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽。
17.權(quán)利要求16的CTL，其是通過權(quán)利要求13的方法誘導(dǎo)的。
18.一種在受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，包括對所述受試者施用包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或片段的多核苷酸的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了分離的具有氨基酸序列SEQ ID NO34的肽或其片段，其結(jié)合HLA抗原且誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括對上述肽或片段的1、2、或幾處氨基酸插入、替換或添加，但仍具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的肽。進(jìn)一步提供了編碼任何這些上述肽的核酸以及包括任何上述肽或核酸的藥用物質(zhì)或組合物。本發(fā)明的肽、核酸、藥用物質(zhì)或組合物可用于治療癌癥或腫瘤。
文檔編號C12N15/09GK102405285SQ20108001714
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者吉村祥子, 大澤龍司, 渡邊朝久, 角田卓也 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司