Topk肽及包含它們的疫苗的制作方法
【專利摘要】衍生自TOPK的分離的表位肽及其免疫學(xué)活性片段具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的能力，因此適合于癌癥免疫治療中使用，更具體地說作為癌癥疫苗使用。本發(fā)明的肽涵蓋包含衍生自TOPK的氨基酸序列的肽及其修飾形式，其中取代、缺失、插入和/或添加1個、2個或幾個氨基酸，條件是這樣的修飾形式具有CTL誘導(dǎo)能力。還提供編碼上述任何肽的多核苷酸和包含任何上述肽或多核苷酸的藥物組合物。本發(fā)明的肽、多核苷酸和藥物組合物在癌癥和腫瘤的治療和/或預(yù)防中特別有用。
【專利說明】TOPK肽及包含它們的疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作 為癌癥疫苗有效的新肽，用于治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物。
[0002] 優(yōu)先權(quán)
[0003] 本申請要求2011年10月28日提交的美國臨時申請61/552, 817的權(quán)益，通過述 及將其全部內(nèi)容收入本文用于所有目的。

【背景技術(shù)】
[0004] 已經(jīng)顯示⑶8陽性細(xì)胞毒性Τ細(xì)胞細(xì)胞（CTL)可識別主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)I類分子上的腫瘤相關(guān)抗原（ΤΑΑ)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。從ΤΑΑ的第 一個例子--黑素瘤抗原（MAGE)家族被發(fā)現(xiàn)起，通過免疫學(xué)手段（NPL1，2)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許 多其它TAA，這些TAA中的一些目前正在作為免疫治療靶標(biāo)進行臨床開發(fā)。
[0005] 有利的TAA對于癌細(xì)胞的擴增和存活而言是不可或缺的。使用這樣的TAA作為免 疫治療的靶標(biāo)，可以最大程度的減小人們熟知的癌細(xì)胞免疫逃逸的風(fēng)險。癌細(xì)胞免疫逃逸 可歸因于治療驅(qū)動的免疫選擇（therapeutically driven immune selection)而導(dǎo)致的 TAA刪除、突變或下調(diào)。因此，能夠誘導(dǎo)強力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保 證了進一步開發(fā)并且由此利用針對各種類型癌癥的肽疫苗接種策略的臨床考察正在進行 中（NPL3-10)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽進行臨床試驗的報 告。不幸的是，到目前為止這些癌癥疫苗試驗只獲得了較低的客觀應(yīng)答率（NPL11-13)。因 此，本領(lǐng)域仍然對適于作為免疫治療靶的新TAA存在需求。
[0006] T0PK(T-LAK細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)激酶）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是MAPK激酶 (MAPKK) 3/6相關(guān)MAPKK家族的成員。這種激酶磷酸化P38MAPK并參與細(xì)胞周期檢查點的調(diào) 控（NPL14U5)。使用臨床樣品的Τ0ΡΚ基因表達分析標(biāo)明Τ0ΡΚ在某些惡性癌癥中，例如乳 腺癌、膽管細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、白血病、結(jié)直腸癌、和黑素瘤中過表達（NPL16-19)。近來的研 究表明激酶活性在乳腺癌癌發(fā)生中扮演重要角色，這重新引起了人們研究癌癥相關(guān)激酶， 如Τ0ΡΚ的興趣。為此目的，Northern印跡分析已經(jīng)揭示，Τ0ΡΚ轉(zhuǎn)錄本在乳腺癌中高表達， 但在除睪丸之外的正常人組織中幾乎檢測不到。此外，已經(jīng)顯示在乳腺癌細(xì)胞系中用siRNA 敲低內(nèi)源Τ0ΡΚ表達可減弱胞質(zhì)分裂并導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡（NPL20)。
[0007] 弓丨用表
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0029] 本發(fā)明至少部分地基于能夠作為合適的免疫療法靶標(biāo)的新肽的發(fā)現(xiàn)。由于TAA - 般被免疫系統(tǒng)察覺為"自身"并因此常常沒有天然免疫原性，適宜靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是極其重要 的。通過本發(fā)明，T0PK(SEQ ID N0:86,由GenBank Accession N〇.NM_018492(SEQ ID N0:85) 的基因編碼），已經(jīng)被證明為在癌癥細(xì)胞中特異性過表達，所述癌癥尤其是但不限于急性髓 細(xì)胞樣白血病（AML)、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃癌、非小細(xì) 胞肺癌（NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、小細(xì)胞肺癌（SCLC)和軟組織腫瘤。因此， 本發(fā)明聚焦于Τ0ΡΚ作為癌癥/腫瘤免疫療法的候選靶標(biāo)。
[0030] 為此目的，本發(fā)明還至少部分地涉及從Τ0ΡΚ的基因產(chǎn)物中鑒定具有誘導(dǎo)針對 Τ0ΡΚ特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)的能力的特異性表位肽。如下文詳細(xì)討論的，使 用源自Τ0ΡΚ的HLA (人白細(xì)胞抗原）-A*2402或HLA-A*0201結(jié)合性候選肽刺激從一位健康 供體獲得的外周血單個核細(xì)胞（PBMC)。然后建立了具有針對經(jīng)每種候選肽沖激的HLA-A24 或HLA-A2陽性靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的CTL。本文中的結(jié)果證明這些肽是鑒定了能誘導(dǎo) 針對Τ0ΡΚ的強而特異性的免疫應(yīng)答的HLA-A24或HLA-A2限制型表位肽。這些結(jié)果進一步 表明Τ0ΡΚ具有強免疫原性，而且它的表位是腫瘤免疫治療的有效靶標(biāo)。
[0031] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供結(jié)合HLA抗原的能力，且包含Τ0ΡΚ序列（SEQ ID N0:86)或其免疫學(xué)活性片段的分離的肽。這些肽預(yù)期具有CTL誘導(dǎo)能力，因此可以用來體 夕卜、離體或體內(nèi)誘導(dǎo)CTL，或者用來直接施用給受試者以在體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答， 癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃 癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0032] 優(yōu)選的肽是九肽和十肽，更優(yōu)選地是具有選自SEQ ID N0:2-40和42-84的氨基酸 序列的九肽和十肽。在這些之中，具有選自SEQ ID N0:2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51，53， 54, 62, 63, 64, 66, 71，72和76的氨基酸序列的肽是最優(yōu)選的。
[0033] 本發(fā)明還考慮修飾肽，它們具有選自SEQ ID N0:2-40和42-84的氨基酸序列，所 述序列中替代、缺失、插入或添加了一個、兩個或更多個氨基酸，只要所得的修飾肽保留原 始的未修飾肽的必要的CTL誘導(dǎo)能力和HLA結(jié)合活性。
[0034] 本發(fā)明還涵蓋編碼任何一種本發(fā)明的肽的分離的多核苷酸。這些多核苷酸可以用 來誘導(dǎo)或者制備具有CTL誘導(dǎo)能力的APC。像上述的本發(fā)明的肽一樣，這樣的APC可以施用 給受試者以誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。
[0035] 當(dāng)施用給受試者時，本發(fā)明的肽優(yōu)選被呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的表面上，以誘導(dǎo)靶 向相應(yīng)肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于誘導(dǎo)CTL的作用劑或組合物，此類作 用劑或組合物包含一種或多種本發(fā)明的肽，或一種或多種編碼此類肽的多核苷酸。這樣的 作用劑或組合物可以用來治療和/或預(yù)防原發(fā)性癌癥、轉(zhuǎn)移或其手術(shù)后復(fù)發(fā)?？紤]到的目 標(biāo)癌癥的例子包括但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃 癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0036] 本發(fā)明還涵蓋包含一種或多種本發(fā)明的肽或者一種或多種本發(fā)明的多核苷酸的 藥物組合物或藥物作用劑，配制為用于治療和/或預(yù)防如上文指明的原發(fā)性癌癥、轉(zhuǎn)移或 手術(shù)后復(fù)發(fā)癌癥。作為本發(fā)明的肽或多核苷酸的替代或者補充，此處的藥劑或組合物可包 括呈遞有任何本發(fā)明的肽的APC或外來體作為活性成分。
[0037] 本發(fā)明的肽或多核苷酸可以用來誘導(dǎo)在表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù) 合物的APC，例如通過使源自受試者的APC與本發(fā)明的肽接觸，或者通過將編碼本發(fā)明的肽 的多核苷酸導(dǎo)入到APC中。這樣的APC具有針對靶肽的高的CTL誘導(dǎo)能力，并且可用于癌 癥免疫療法。因此，本發(fā)明涵蓋用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法和通過該方法獲 得的APC。
[0038] 本發(fā)明的另一個目的是提供用于誘導(dǎo)CTL的方法，所述方法包括將⑶8陽性T細(xì) 胞與在其表面上呈遞有HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的APC共培養(yǎng)的步驟，將CD8陽性 T細(xì)胞與在其表面上呈遞有HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的外來體共培養(yǎng)的步驟，或者 導(dǎo)入包括一個或多個編碼T細(xì)胞受體（TCR)亞單位多肽的多核苷酸的步驟，其中由所述亞 單位多肽形成的TCR能夠結(jié)合本發(fā)明的肽。通過此類方法獲得的CTL能夠用于癌癥，更具 體地說AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨 肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤的治療和/或預(yù)防。因此，本發(fā)明涵蓋誘導(dǎo)CTL 的方法以及通過該方法獲得的CTL。本發(fā)明的另一個目的是提供分離的APC，其在表面上呈 遞有HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物。本發(fā)明還提供靶向本發(fā)明的肽的分離的CTL。這些 APC和CTL可以用于癌癥免疫治療。
[0039] 本發(fā)明的還有一個目的是提供在有此需要的受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng) 答的方法，這樣的方法包括對受試者施用包含選自下組的至少一種組分的組合物的步驟： 本發(fā)明的肽、編碼此類肽的多核苷酸、呈遞有此類肽的外來體或APC、以及能夠識別在其表 面上呈遞有此類肽的細(xì)胞的CTL。
[0040] 本發(fā)明的應(yīng)用可延及多種涉及或者源于Τ0ΡΚ過表達的疾病中的任何一種，例如 表達Τ0ΡΚ的癌癥，其例子包括但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸 癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0041] 在聯(lián)系附圖和實施例閱讀下面的詳細(xì)說明時，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將 變得更加顯而易見。應(yīng)當(dāng)理解，前面的發(fā)明概要和后面的詳細(xì)說明都僅僅提出了示例性的 實施方案，并不對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替代實施方案構(gòu)成限制。
[0042] 尤其是，雖然在本文中就若干具體的實施方案對本發(fā)明進行了說明，應(yīng)當(dāng)理解這 些描述對本發(fā)明而言是示例說明性的，不解釋成對本發(fā)明的限制。在不背離如隨附的權(quán)利 要求所描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地想到本發(fā)明的多種 修改和應(yīng)用。類似地，本發(fā)明的其它目的、特征、好處和優(yōu)勢是從此處的概要和下文描述的 特定實施方案可以容易地想到的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以顯見的。根據(jù)上文的內(nèi)容并 結(jié)合隨附的實施例、數(shù)據(jù)、附圖以及從中能夠合理推斷的內(nèi)容，或者進一步考慮本文中引用 的參考文獻，這樣的目的、特征、好處和優(yōu)勢是容易想到的。
[0043] 附圖簡述
[0044] 本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了下文的附圖簡要說明及對本發(fā)明及其優(yōu)選實施方案的 詳細(xì)說明后將清楚地得知本發(fā)明的各個方面的應(yīng)用。
[0045] [圖1]圖1由一系列照片（a)-(e)組成，描繪顯示對用源自Τ0ΡΚ的肽誘導(dǎo)的CTL 進行的干擾素（IFN)-y-酶聯(lián)免疫斑點（ELISP0T)測定的結(jié)果。用T0PK-A24-9-230(SEQ ID N0:2) (a)刺激的 8 號孔，用 T0PK-A24-9-130(SEQ ID N0:3) (b)刺激的 3 號孔、用 T0PK-A24-9-232(SEQ ID N0:6) (c)刺激的 3 號孔、用 T0PK-A24-10-288(SEQ ID N0:27) (d) 刺激的2號孔、和用T0PK-A24-10-289(SEQ ID N0:28) (e)刺激的4號孔中的CTL分別與對 照相比顯示了強的IFN-γ生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴增 以建立CTL系。對比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)，沒有觀察到來自用T0PK-A24-9-289 (SEQ ID NO: 1) (f)刺激的CTL的特異性IFN- γ生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞 的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。
[0046] [圖2-1]圖2由一系列照片（a)-(o)組成，描繪顯示對用源自Τ0ΡΚ的肽誘導(dǎo)的 CTL進行的干擾素（IFN)-γ-酶聯(lián)免疫斑點（ELISP0T)測定的結(jié)果。用T0PK-A02-9-240(SEQ ID NO: 42) (a)刺激的 7 號孔、用 T0PK-A02-9-19 (SEQ ID NO: 45) (b)刺激的 4 號孔、用 T0PK-A02-9-183(SEQ ID N0:47) (c)刺激的 2 號孔、用 T0PK-A02-9-235(SEQ ID N0:50) (d) 刺激的 8 號孔、用 T0PK-A02-9-12(SEQ ID N0:51) (e)刺激的 4 號孔、用 T0PK-A02-9-285(SEQ ID N0:53) (f)刺激的 3 號孔、用 T0PK-A02-9-47(SEQ ID N0:54) (g)刺激的 3 號孔、 用 T0PK-A02-10-236(SEQ ID N0:62)(h)刺激的 5 號孔、用 T0PK-A02-10-231(SEQ ID N0:63)⑴刺激的3號孔、用T0PK-A02-10-47(SEQ ID N0:64) (j)刺激的8號孔、用 T0PK-A02-10-239(SEQ ID N0:66)(k)刺激的 1 號孔、和用 T0PK-A02-10-272(SEQ ID N0:71) (1)刺激的1號孔中的CTL分別與對照相比顯示了強的IFN-y生成。這些圖片上孔上的方 框表示來自相應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴增以建立CTL系。對比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)，沒有觀察 到來自用T0PK-A02-9-55(SEQ ID N0:41)(o)刺激的CTL的特異性IFN-γ生成。在圖中， 〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- γ生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶 細(xì)胞的IFN-γ生成。
[0047] [圖2-2]圖2由一系列線圖（a)-(o)組成，描繪顯示對用源自Τ0ΡΚ的肽誘導(dǎo)的 CTL進行的干擾素（IFN)-γ-酶聯(lián)免疫斑點（ELISP0T)測定的結(jié)果。用T0PK-A02-10-88(SEQ ID NO: 72) (m)刺激的 4 號孔和用 T0PK-A02-10-142 (SEQ ID NO: 76) (η)刺激的 4 號孔 中的CTL分別與對照相比顯示了強的IFN-γ生成。這些圖片上孔上的方框表示來自相 應(yīng)孔中的細(xì)胞被擴增以建立CTL系。對比地，作為典型的陰性數(shù)據(jù)，沒有觀察到來自用 T0PK-A02-9-55(SEQ ID N0:41)(o)刺激的CTL的特異性IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示 針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的 IFN-γ生成。
[0048] [圖3]圖3由一系列線圖（a)-(e)組成，描繪從用T0PK-A24-9_230(SEQ ID N0:2) (a), T0PK-A24-9-130(SEQ ID NO:3) (b), T0PK-A24-9-232 (SEQ ID N0:6) (c)，T0PK-A24-10-288(SEQ ID N0:27) (d)和 T0PK-A24-10-289(SEQ ID N0:28) (e)刺激的 CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN- γ生成。CTL產(chǎn)生的IFN- γ的量用IFN- γ 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)測量。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆與對照 相比均顯示了強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ 生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。R/S比表示應(yīng)答細(xì)胞（CTL 系）與刺激細(xì)胞的比。
[0049] [圖 4]圖 4 由一系列線圖（a)-(c)組成，描繪了用 T0PK-A24-9-130(SEQ ID N0:3) (a)，T0PK-A24-10-288(SEQ ID N0:27) (b)和 T0PK-A24-10-289(SEQ ID N0:28) (c)刺激的 CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN-y生成。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建 立的CTL克隆顯示與對照相比強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)合適的肽沖激的 靶細(xì)胞的IFN- γ生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- γ生成。R/S比表 示應(yīng)答細(xì)胞（CTL克?。┡c刺激細(xì)胞的比。
[0050] [圖 5-1]圖 5-1 由一系列線圖（a) - (f)組成，描繪了用 T0PK-A02-9-240 (SEQ ID N0:42)(a), T0PK-A02-9-19(SEQ ID NO:45) (b), T0PK-A02-9-235(SEQ ID N0:50) (c)，T0PK-A02-9-12(SEQ ID N0:51)(d)，T0PK-A02-9-285(SEQ ID N0:53)(e),和 T0PK-A02-9-47(SEQ ID N0:54) (f)刺激的 CTL 系的 IFN-y 生成。CTL 產(chǎn)生的 IFN-y 的量 用IFN-y酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)測量。結(jié)果顯示用每種肽刺激而建立的CTL系與對 照相比顯示了強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ 生成，而〃_〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。R/S比表示應(yīng)答細(xì)胞（CTL 系）與刺激細(xì)胞的比。
[0051] [圖 5-2]圖 5-2 由一系列線圖（g)-(k)組成，描繪了用 T0PK-A02-10-236(SEQ ID N0:62)(g),T0PK-A02-10-231 (SEQ ID NO:63)(h), T0PK-A02-10-47(SEQ ID N0:64) (i),T0PK-A02-10-239(SEQ ID N0:66)(j)和 T0PK-A02-10-88(SEQ ID N0:72)(k)刺激的 CTL系的IFN-γ生成。CTL產(chǎn)生的IFN-γ的量用IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)測量。 結(jié)果顯示用每種肽刺激而建立的CTL系與對照相比顯示了強的IFN-γ生成。在圖中，〃+〃 指示針對經(jīng)適宜肽沖激的靶細(xì)胞的IFN- γ生成，而〃-〃指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞 的IFN-γ生成。R/S比表示應(yīng)答細(xì)胞（CTL系）與刺激細(xì)胞的比。
[0052] [圖 6]圖 6 由一對線圖（a)和（b)組成，描繪了用 T0PK-A02-9-240 (SEQ ID N0:42) (a)和T0PK-A02-9-285(SEQ ID N0:53) (b)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克 隆的IFN-γ生成。結(jié)果證明了通過用每種肽刺激而建立的CTL克隆顯示與對照相比強的 IFN-γ生成。在圖中，〃+〃指示針對經(jīng)合適的肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成，而〃-〃指示 針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。R/S比表示應(yīng)答細(xì)胞（CTL克隆）與刺激細(xì) 胞的比。
[0053] [圖7]圖7是一幅線圖，描繪針對表達Τ0ΡΚ和HLA-A*2402的靶細(xì)胞的CTL克隆 的特異性CTL活性。制備用HLA-A*2402或用全長TOPK基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。 用 T0PK-A24-10-289(SEQ ID Ν0:28)建立的 CTL 克隆顯示了針對用 Τ0ΡΚ 和 HLA-A*2402 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性（菱形）。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達 HLA-A*2402 (三角形）或T0PK (圓形）的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。
[0054] [圖8]圖8是一幅線圖，描繪針對表達Τ0ΡΚ和HLA-A*0201的靶細(xì)胞的CTL系 的特異性CTL活性。制備用HLA-A*0201或用全長Τ0ΡΚ基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。 用 T0PK-A02-9-240(SEQ ID N0:42)建立的 CTL 系顯示了針對用 Τ0ΡΚ 和 HLA-A*0201 二 者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性（菱形）。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達 HLA-A*0201 (三角形）或Τ0ΡΚ (圓形）的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。
[0055] 實施方案的描述
[0056] 在上文的概述的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的一個目的是提供：
[0057] [1]具有CTL誘導(dǎo)能力的分離的肽，其中所述肽由Τ0ΡΚ的氨基酸序列或其免疫學(xué) 活性片段組成。
[0058] [2] [1]的分離的肽，其中所述肽包含選自 SEQ ID N0:2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50， 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76 的氨基酸序列。
[0059] [3] -種分離的肽，其選自下面的⑴和（ii):
[0060] ⑴下面（a)或（b)的分離的肽：
[0061] (a)分離的肽，其包含選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列；
[0062] (2)分離的肽，其包含選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列，所述序列中 取代、插入、缺失和/或添加了 1、2或數(shù)個氨基酸，其中所述肽具有CTL誘導(dǎo)能力，
[0063] ⑴下面（c)或（d)的分離的肽：
[0064] (c)分離的肽，其包含選自 SEQ ID N0:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、 72和76的氨基酸序列；
[0065] (d)分離的肽，其包含選自 42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72 和 76 的 氨基酸序列，所述序列中取代、插入、缺失和/或添加了 1、2或數(shù)個氨基酸，其中所述肽具有 CTL誘導(dǎo)能力。
[0066] [4] [3]的肽，其中所述肽具有下述特征之一或二者：
[0067] (a)選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列的自N端起的第二個氨基酸被 取代為選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和
[0068] (b)選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列的C末端氨基酸被取代為選自 苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。
[0069] [3] [1]的肽，其中所述肽具有下述特征之一或二者：
[0070] (a)選自 SEQ ID N0:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72 和 76 的氨基酸 序列的自N端起的第二個氨基酸被取代為選自亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；和
[0071] (b)選自 SEQ ID N0:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72 和 76 的氨基酸 序列的C末端氨基酸被取代為選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸。
[0072] [6]權(quán)利要求1-5中任一項的分離的肽，其中所述肽具有結(jié)合HLA抗原的能力。
[0073] [7] [6]的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2。
[0074] [8] [1]_[7]中任一項的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
[0075] [9]分離的多核苷酸，其編碼[1]-[8]中任一項的分離的肽。
[0076] [10] -種用于誘導(dǎo)CTL的組合物，其包含：
[0077] (a) -種或多種[1]_[8]中任一項的分離的肽，
[0078] (b) -種或多種[9]的多核苷酸，
[0079] (c) -種或多種在其表面上呈遞有[1]_[8]中任一項的分離的肽與HLA抗原的復(fù) 合物的APC ;
[0080] ⑷一種或多種在其表面上呈遞有[1]-[8]中任一項的分離的肽與HLA抗原的復(fù) 合物的外來體，或
[0081] (f) 一種或多種能夠識別在其表面上呈遞有[1]-[8]中任一項的分離的肽與HLA 抗原的復(fù)合物的細(xì)胞的CTL，
[0082] 及與之組合的可藥用的載體，
[0083] 其中所述藥物組合物配制為用于治療和/或預(yù)防癌癥，防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)，和/或 誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。
[0084] [12] [11]的藥物組合物，其中所述藥物組合物配制為供施用于HLA抗原為 HLA-A24或A2的受試者。
[0085] [13] -種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞（APC)的方法，該方法包括 選自下組的步驟：
[0086] (a)在體外、離體或在體內(nèi)使APC與[1]_[8]中任一項的肽接觸，和
[0087] (b)將編碼[1]_[8]中任一項的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
[0088] [14] 一種誘導(dǎo)CTL的方法，該方法包括選自下組的步驟：
[0089] (a)將CD8陽性T細(xì)胞與在表面上呈遞HLA抗原與[1]_[8]中任一項的肽的復(fù)合 物的APC共培養(yǎng)；
[0090] (b)將CD8陽性T細(xì)胞與在表面上呈遞HLA抗原與[1]-[8]中任一項的肽的復(fù)合 物的外來體共培養(yǎng)；和
[0091] (C)將包含編碼結(jié)合[1]-[8]中任一項的肽的T細(xì)胞受體（TCR)亞單位多肽的多 核苷酸導(dǎo)入CD8陽性T細(xì)胞，其中由所述TCR亞單位多肽形成的TCR能夠結(jié)合細(xì)胞表面上 的HLA抗原與[1]-[8]中任一項的肽的復(fù)合物。
[0092] [15] -種分離的APC，所述APC在其表面上呈遞有HLA抗原與[1]_[8]中任一項 的肽的復(fù)合物。
[0093] [16] [15]的APC，其是通過[13]的方法誘導(dǎo)的。
[0094] [17] -種分離的CTL，其靶向[1]_[8]中任一項的肽。
[0095] [18] [17]的CTL，其是通過[14]的方法誘導(dǎo)的。
[0096] [19] -種在受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對受試者施 用包含[1]_[8]中任一項的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸 的組合物的步驟。
[0097] [20]針對[1]_[8]中任一項的肽的抗體或其免疫學(xué)活性片段。
[0098] [21] -種載體，其包含編碼[1]_[8]中任一項的肽的核苷酸序列。
[0099] [22]用權(quán)利要求[21]的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的宿主細(xì)胞。
[0100] [23] -種診斷試劑盒，其包含[1]-[8]中任一項的肽、[9]的多核苷酸、或[20]的 抗體。
[0101] [24] [1]-[8]中任一項的分離的肽，其選自 SEQ ID N0:2,3,6,27,28,42,45,47,50 ，51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76。
[0102] [25] -種用于篩選具有誘導(dǎo)CTL的能力的肽的方法，所述CTL具有針對呈遞有衍 生自Τ0ΡΚ的片段的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性，其中所述方法包括如下步驟：
[0103] (i)提供由對原始氨基酸序列通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個 氨基酸殘基而修飾得到的氨基酸序列組成的候選序列，其中所述原始氨基酸序列選自SEQ ID N0:2、3、6、27、28、42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72 和 76，
[0104] (ii)選擇與衍生自除Τ0ΡΚ之外的任何已知人基因產(chǎn)物的肽均無顯著實質(zhì)同源性 的候選序列；
[0105] (iii)使由步驟（ii)中選擇的候選序列組成的肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸；
[0106] (iv)使步驟（c)的抗原呈遞細(xì)胞與⑶8陽性T細(xì)胞接觸；和
[0107] (V)鑒定其CTL誘導(dǎo)能力相同于或高于由原始氨基酸序列組成的肽的肽。
[0108] 現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料，不過在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使 用與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和 方法之前，應(yīng)理解這些描述都是說明性的，并不意圖限制，還要理解的是本發(fā)明不限于特定 大小、性狀、尺度、材料、方法學(xué)、方案等，因為它們可因循例行實驗和優(yōu)化而變化。此外，所 述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范 圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。
[0109] 通過提述明確地將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本 完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此 類公開文本。
[0110] 除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常知曉的意義。如果有沖突，以本說明書（包括定義）為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實 例僅為舉例說明而不構(gòu)成限制。
[0111] I.定義
[0112] 如本文中使用的，詞語"一個/種"、"該"、和"所述"意味著"至少一個/種"，除非 另有明確說明。
[0113] 術(shù)語"分離的"和"純化的"與物質(zhì)（例如多肽、抗體、多核苷酸等）相關(guān)聯(lián)使用時， 指該物質(zhì)基本上不含至少一種原本會包括在天然來源中的物質(zhì)。因此，分離的或純化的抗 體指基本上不含細(xì)胞材料（例如來自所述蛋白質(zhì)（抗體）的細(xì)胞或組織來源的碳水化合 物、脂質(zhì)或其它污染性蛋白質(zhì)）或者在化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品的抗 體。術(shù)語"基本上不含細(xì)胞材料"包括多肽的制備物，其中所述多肽與分離出該多肽的或重 組產(chǎn)生該多肽的細(xì)胞的細(xì)胞組分是分離的。如此，基本上不含細(xì)胞材料的多肽包括多肽制 備物，其具有小于約30%、20%、10%或5% (以干重計）的異源蛋白質(zhì)（在本文中也稱為 "污染蛋白質(zhì)")。在多肽以重組方式生成時，在一些實施方案中，它也基本上不含培養(yǎng)基，包 括多肽的其中培養(yǎng)基小于蛋白質(zhì)制備物體積的約20%、10%或5%的制備物。當(dāng)多肽系通 過化學(xué)合成生成時，它優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，包括多肽的這樣的制備物， 其中多肽合成涉及的化學(xué)前體或其它化學(xué)品小于多肽制備物體積的約30%、20%、10%、 5% (以干重計）。特定蛋白質(zhì)制備物含有經(jīng)分離或純化的多肽的事實可以例如通過在蛋白 質(zhì)制備物的十二烷基硫酸鈉（SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳和對凝膠進行考馬斯亮藍(lán)染色等 處理后出現(xiàn)單一條帶來示明。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的肽和多核苷酸是分離的或 純化的。
[0114] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該 術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是一個或多個修飾殘基或非天然存在型殘基（諸 如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物）的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸 聚合物。
[0115] 本說明書中有時使用的術(shù)語"寡肽"用于指長度為20個氨基酸殘基或更少，典型 地為15個氨基酸殘基或更少的肽，通常由約8個-約11個氨基酸殘基，經(jīng)常為9個或10 個氨基酸殘基組成。后者在本文中分別稱為"九肽"和"十肽"。
[0116] 如本文中使用的，術(shù)語"氨基酸"指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有與天然 存在的氨基酸相似的功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸可以是L-氨基酸或 D-氨基酸。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后被修飾 的氨基酸（例如羥脯氨酸、羧基谷氨酸、和〇-磷酸絲氨酸）。短語"氨基酸類似物"指 與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)（α碳與氫、羧基、氨基、和R基團結(jié)合）但 具有經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物（例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞 砜、甲硫氨酸甲基锍）。短語"氨基酸模擬物"指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與 一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。
[0117] 氨基酸在本文中可以通過它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委 員會推薦的單字母符號來指稱。
[0118] 術(shù)語"基因"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"、和"核酸"在本文中除非另有明確說明可互 換使用，并用它們普遍接受的單字母代碼來指稱它們。
[0119] 術(shù)語"（作用）劑"和"組合物"和在本文中可以互換使用，指包含規(guī)定量的規(guī)定成 分的產(chǎn)品，以及通過所述規(guī)定量的規(guī)定成分的組合直接或間接地得到的任何產(chǎn)品。這些術(shù) 語當(dāng)與修飾語"藥物"（如"藥物作用劑"和"藥物組合物"）關(guān)聯(lián)使用時，意在涵蓋：包括活 性成分以及組成擔(dān)載體的惰性成分的產(chǎn)品，以及通過所述任何兩種或更多種成分的組合、 復(fù)合或聚集，或通過一種或多種組分的解離，或通過一種或多種成分的其他類型的反應(yīng)或 相互作用而直接或間接地得到的產(chǎn)品。相應(yīng)地，在本發(fā)明的語境中，術(shù)語"藥物作用劑"和 "藥物組合物"指任何涵蓋任何通過混合本發(fā)明的分子或化合物與藥學(xué)或生理學(xué)上可接受 的擔(dān)載體而制成的產(chǎn)品。
[0120] 術(shù)語"活性成分"在本文中意指作用劑或組合物中具有生物學(xué)活性或生理學(xué)活性 的物質(zhì)。尤其是，在藥劑或藥物組合物的語境中，術(shù)語"活性成分"是指顯示客觀的藥理學(xué)效 果的成分物質(zhì)。例如，在用于治療或預(yù)防癌癥的藥劑或藥物組合物的場合，作用劑或組合物 中的活性成分可直接或間接地導(dǎo)致對于癌細(xì)胞和/或組織的至少一種生物學(xué)或生理學(xué)作 用。優(yōu)選地，這樣的作用可包括減少或抑制癌細(xì)胞生長、破壞或殺死癌細(xì)胞和/或癌組織， 等等。典型地，活性成分的間接效果是誘導(dǎo)識別或殺死癌細(xì)胞的CTL。在配制之前，"活性 成分"又可稱"原料藥"（bulk)、"藥物物質(zhì)"（drug substance)或"技術(shù)產(chǎn)品"（technical product)〇
[0121] 本文中所用的短語"藥學(xué)上可接受的擔(dān)載體"或"生理學(xué)上可接受的擔(dān)載體"意 思是藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的材料、組合物、物質(zhì)或媒介，包括但不限于液體或固體填充 齊U、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包埋材料。
[0122] 本發(fā)明的某些藥劑或藥物組合物特別可以用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語"疫 苗"（又稱"免疫原性組合物）是指在接種到動物體內(nèi)后具有改善、增強和/或誘導(dǎo)抗腫瘤 免疫功能的作用劑或組合物。
[0123] 除非另有定義，術(shù)語"癌癥"指過表達Τ0ΡΚ基因的癌癥或腫瘤，其實例包括但不 限于急性髓細(xì)胞樣白血?。ˋML)、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃 癌、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、小細(xì)胞肺癌（SCLC)和軟組織 腫瘤。
[0124] 除非另有定義，術(shù)語"細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞"、"細(xì)胞毒性T細(xì)胞"和"CTL"在本文 中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細(xì)胞（例如腫瘤/癌細(xì)胞、病毒 感染的細(xì)胞）并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。
[0125] 除非另有定義，本文中使用的術(shù)語"HLA-A24"包含亞型的HLA-A24型，亞型的例子 包括但不限于 HLA-A*2401, HLA-A*2402, HLA-A*2403, HLA-A*2404, HLA-A*2407, HLA-A*2408 ,HLA-A*2420, HLA-A*2425 和 HLA-A*2488。
[0126] 除非另有定義，本文中使用的術(shù)語"HLA-A2"代表性地指亞型，其例子包括但不 限于 HLA-A*0201, HLA-A*0202, HLA-A*0203, HLA-A*0204, HLA-A*0205, HLA-A*0206, HLA-A*0207, HLA-A*0210, HLA-A*0211, HLA-A*0213, HLA-A*0216, HLA-A*0218, HLA-A*0219,H LA-A*0228 和 HLA-A*0250。
[0127] 除非另有定義，如本文中所用的術(shù)語"試劑盒"是指試劑及其他材料的組合?？紤] 術(shù)語"試劑盒"可包括微陣列、芯片、標(biāo)記物、等等。術(shù)語"試劑盒"不意圖限于某種特定的 試劑和/或材料組合。
[0128] 如本文中使用的，在受試者或者患者的語境中，短語"受試者的（或患者的）HLA抗 原為HLA A24或HLA-A2"是指受試者或患者純合地或者雜合地?fù)碛蠬LA-A24或HLA-A2抗 原基因作為MHC (主要組織相容性復(fù)合物）I類分子，并且HLA-A24或HLA-A2抗原在受試者 或患者的細(xì)胞中作為HLA抗原表達。
[0129] 以本發(fā)明的材料和方法在"治療"癌癥的語境中有用為限，如果治療導(dǎo)致臨床上的 收益，例如受試者體內(nèi)Τ0ΡΚ基因表達的減少、癌癥的尺寸、普遍性（prevalence)或轉(zhuǎn)移潛 力的降低，阻礙癌癥的進展，減輕癌癥的臨床癥狀，延長生存時間，抑制術(shù)后復(fù)發(fā)，等等，則 認(rèn)為治療是"有效的"。當(dāng)預(yù)防性地進行治療時，"有效的"意思是其阻礙或阻止癌癥的形成， 或者阻止或減輕癌癥的臨床癥狀。"有效性"結(jié)合用于診斷或治療特定腫瘤類型的任何已知 方法來確定。
[0130] 以本發(fā)明的方法和組合物可用于"預(yù)防"和"防范"的語境為限，此類術(shù)語在本文 中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于 "一級、二級和三級預(yù)防水平"。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范 水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并 發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動?；蛘?，預(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥 的嚴(yán)重性（例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等）的多種多樣的預(yù)防性療法。
[0131] 在本發(fā)明的語境中，治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述 步驟，諸如手術(shù)去除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌 癥發(fā)生、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其 預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減 輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10%、20%、30%或更多降低，或?qū)崿F(xiàn)病情穩(wěn)定。
[0132] 在本發(fā)明的語境中，術(shù)語"抗體"指可以與指定的蛋白或其肽具有特異性反應(yīng)性的 免疫球蛋白及其片段。抗體可以包括人抗體、靈長源化（primatized)抗體、嵌合抗體、雙特 異性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標(biāo)記物融合的抗體、和抗體片段。另外，在本文 中，抗體以最廣義使用，具體涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成 的多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學(xué)活性。"抗 體"指示所有類別（例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
[0133] 除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義均與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。
[0134] II.狀
[0135] 下面詳細(xì)描述的本發(fā)明的肽可稱為"Τ0ΡΚ肽"或"Τ0ΡΚ多肽"。
[0136] 為了證明源自Τ0ΡΚ的肽發(fā)揮被CTL所識別的抗原的功能，對源自T0PK(SEQ ID N0:86)的肽進行了分析以確定它們是否為HLA-A24或HLA-A2限制性的抗原表位，HLA-A24 或A2是經(jīng)常遇到的HLA等位基因 （Date Y et al.，Tissue Antigens47:93_101，1996;Kondo A et al.，J Immunoll55:4307_12，1995;Kubo RT et al.，J Immunoll52:3913_24，1994)。
[0137] 基于它們對HLA-A24的結(jié)合親和力鑒定的衍生自TOPK的HLA-A24結(jié) 合肽的候選者包括：T0PK-A24-9-230(SEQ ID N0:2)，T0PK-A24-9-130(SEQ ID NO :3)，T0PK-A24-9-237 (SEQ ID NO :4)，TOPK-A24-9-155 (SEQ ID NO : 5)，T0PK-A24-9-232 (SEQ ID N0 : 6 )，T0PK-A 24-9 - 1 74 ( SEQ ID NO:7)，T0PK-A24-9-73(SEQ ID NO:8)，T0PK-A24-9-235(SEQ ID NO:9)，T0PK-A24-9-19(SEQ ID NO : 10)，T0PK-A24-9-205 (SEQ ID NO : 11)，T0ΡΚ-Α24-9-77 (SEQ ID NO: 12), TOPK-A 24-9-270 (SEQ ID NO : 1 3 ) , TOPK-A 24-9 - 58 (SEQ ID NO: 14), TOPK-A 24-9-81 (SEQ ID NO: 15), TOPK-A 24-9-278 (SEQ ID NO: 16), TOPK-A 24-9-183 (SEQ ID NO : 1 7) , TOPK-A 24-9 - 227 ( SEQ ID NO : 18) , T0PK-A24-9-13 (SEQ ID NO : 1 9), T0PK-A24-9 - 146 (SEQ ID NO:20), TOPK-A24-9-140 (SEQ ID NO :21) , T0ΡΚ-A24-9 - 103 ( SEQ ID NO:22), TOPK-A24-9-105 (SEQ ID NO : 23 ) , TOPK-A24-9 - 118(SEQ ID NO :24), TOPK-A24-10-31(SEQ ID NO :25), Τ0ΡΚ-Α24-10-155 (SEQ ID NO :26), TOPK-A24-10-288 (SEQ ID NO :2 7), TOPK-A24-10-289 (SEQ ID NO :28), TOPK-A24-10-130 (SEQ ID NO :29), TOPK-A24-10-47 (SEQ ID NO :30), TOPK-A24-10-73 (SEQ ID NO :31), TOPK-A24-10-102 (SEQ ID NO :32) , T0PK-A24- 10-39 (SEQ ID NO:33), TOPK-A 24-10-4(SEQ ID NO :34), TOPK-A24-10-77 (SEQ ID NO :35), TOPK-A24-10-241 (SEQ ID NO :36), Τ0ΡΚ-Α24-10-12 (SEQ ID NO :37), TOPK-A24-10-148 (SEQ ID N0:38),T0PK-A24-10-145(SEQ ID N0:39)和 T0PK-A24-10-114(SEQ ID N0:40)。
[0138] 在上述這些中，用加載有下述每一種肽的樹突細(xì)胞（DC)體外刺激T細(xì)胞后，用這 些肽成功地建立了 CTL :
[0139] Τ0ΡΚ-Α24-9-230 (SEQ ID N 0 : 2 )，T 0 P K - A 2 4 - 9 - 1 3 0 ( S E Q ID N0:3)，T0PK-A24-9-232(SEQ ID N0:6)，T0PK-A24-10-288(SEQ ID N0:27)和 T0PK-A24-10-289(SEQ ID N0:28)。
[0140] 基于它們對HLA-A2的結(jié)合親和力鑒定的衍生自TOPK的HLA-A2結(jié)合肽的候選者 包括：
[0141] T0PK-A2 -9 -2 40 (SEQ ID N 0 : 4 2 )，T 0 P K - A 2 - 9 - 3 4 ( S E Q ID NO : 43)，T0PK-A2-9-2 36 (SEQ ID N0:44)，T0PK-A 2-9 - 1 9 ( SEQ ID NO : 45)，T0PK-A2-9-134 (SEQ ID N0:46 )，T0PK-A 2-9 - 1 83 (SEQ ID NO : 47)，T0PK-A2-9-8 1 (SEQ ID N0 : 48)，T0PK-A 2 - 9 - 1 49 ( SEQ ID NO : 49)，T0PK-A2 -9 -2 3 5 (SEQ ID N0 : 50 )，T0PK-A 2 - 9 - 1 2 ( SEQ ID NO : 5 1)，T0PK-A2-9-2 2 7 (SEQ ID N0:52 )，T0PK-A 2-9 - 285 ( SEQ ID NO : 53)，T0PK-A2-9-47 (SEQ ID N0 : 54 )，T0PK-A 2 - 9 - 3 1 0 ( SEQ ID NO : 55)，T0PK-A2-9-132 (SEQ ID N0:56)，TOPK-A 2-9 - 242 (SEQ ID NO :57)，T0PK-A2-9-156 (SEQ ID N0:58 )，T0PK-A 2-9 - 138 ( SEQ ID NO :59), TOPK-A 2-9-142 (SEQ ID NO :60), TOPK-A2-10-190 (SEQ ID NO : 6 1)，T0PK-A2- 1 0-236 (SEQ ID NO :62)，TOPK_A2-10-231 (SEQ ID NO :63), TOPK-A2-10-47(SEQ ID NO :64), TOPK-A2-10-234 (SEQ ID NO :65), Τ0ΡΚ-Α2-10-239 (SEQ ID NO :66), Τ0ΡΚ-Α2-10-290 (SEQ ID NO : 67)，T0PK-A2-10-37 (SEQ ID N0 : 68)，T0PK-A 2 - 10 - 20 (SEQ ID NO :69), Τ0ΡΚ-Α2-10-241 (SEQ ID NO :70), Τ0ΡΚ-Α2-10-272 (SEQ ID NO : 7 1)，T0PK-A2-10-88 (SEQ ID N0:72)，T0PK-A 2 - 10-81 (SEQ ID NO:73), TOPK-A 2-10-313(SEQ ID NO :74), TOPK-A 2-10-54(SEQ ID NO:75), TOPK-A2-10-142(SEQ ID NO :76) , T0PK-A2-10-35(SEQ ID NO :77), T0PK-A2-10-110 (SEQ ID NO :78), TOPK-A2-10-223 (SEQ ID NO :79), TOPK-A2-10-274 (SEQ ID NO :80), TOPK-A2-10-173(SEQ ID N0:81)，T0PK-A2-10-141(SEQ ID N0:82)，T0PK-A2-10-292(SEQ ID N0:83)和 T0PK-A2-10-180(SEQ ID N0:84)。
[0142] 在上述這些中，用加載有下述每一種肽的樹突細(xì)胞（DC)體外刺激T細(xì)胞后，用這 些肽成功地建立了 CTL :
[0143] T0PK-A02-9-240 (SEQ ID N 0 : 4 2 )，T 0 P K - A 0 2 - 9 - 1 9 ( S E Q ID NO :45), TOPK-A02-9-183 (SEQ ID NO :47), TOPK-A02-9-235 (SEQ ID NO :50)，T0PK-A02-9-12(SEQ ID NO :5 1)，T0PK-A02 - 9 - 285 ( SEQ ID NO:53), TOPK-A02-9-47 (SEQ ID NO :54), TOPK-A02-10-236 (SEQ ID NO :62) , T0PK-A02-10-23 1 (SEQ ID NO :63), T0ΡΚ-Α02-10-47 (SEQ ID NO :6 4) , T0PK-A02-10-2 39 (SEQ ID NO :6 6) , Τ0ΡΚ-Α02-10-272 (SEQ ID N0:71),T0PK-A02-10-88(SEQ ID N0:72)和 T0PK-A02-10-142(SEQ ID N0:76)。
[0144] 這些建立的CTL針對用相應(yīng)肽沖激過的靶細(xì)胞顯示了強的特異性CTL活性。這些 結(jié)果顯示TOPK是被CTL識別的抗原，且被測試的肽是TOPK的受HLA-A24或HLA-A2限制的 表位肽；因此，這些肽可能是CTL的細(xì)胞毒作用的有效靶抗原。
[0145] 由于Τ0ΡΚ基因在癌細(xì)胞和組織，包括例如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞 癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤的細(xì) 胞和組織中過表達，而在大多數(shù)正常器官中不表達，它代表了一種良好的免疫治療靶標(biāo)。因 此，本發(fā)明提供與來自Τ0ΡΚ的被CTL識別的表位對應(yīng)的九肽（由九個氨基酸殘基組成的 肽）和十肽（由十個氨基酸殘基組成的肽）。本發(fā)明的九肽和十肽的尤其優(yōu)選的例子包括 具有選自SEQ ID NO :2-40和42-84的氨基酸序列的肽。
[0146] -般而言，目前可以通過例如互聯(lián)網(wǎng)訪問的軟件程序，如Parker KC et al.，J Immunoll994，152(l):163-75 和 Nielsen et al. (Protein Sci.，12:1007-17,2003，Bio informatics, 20 (9) : 1388-97, 2004)等中描述的那些，可以用來在計算機上計算不同肽 與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。與HLA抗原的結(jié)合親和力可以按照例如下列文獻中描述 的那樣進行測定：Parker KC et al.，J Immunoll994, 152(1) :163_75，Kuzushima K et al., Blood2001, 98(6):1872-81,Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 ；8:424,Buus S et al.Tissue Antigens. , 62:378-84, 2003, Nielsen M et al. , Protein Sci2003 ； 12:1007-17,和 Nielsen M et al.PLoS 0NE2007;2:e796,這些在例如 Lafuente EM et al·，Current Pharmaceutical Design, (2009, 15, 3209-3220 中有總結(jié)。用于測定結(jié)合親 和力的方法在例如Journal of Immunological Methods, (1995,185:181-190);和Protein Science, (2000,9:1838-1846)中有描述。因而可以容易地利用這樣的軟件程序來選擇具有 高度的HLA抗原結(jié)合親和力的源自Τ0ΡΚ的片段，利用這樣的軟件程序。因此，本發(fā)明涵蓋 由任何可通過這些已知程序被確定為與HLA抗原結(jié)合的Τ0ΡΚ片段構(gòu)成的肽。此外，這樣的 肽可包括由Τ0ΡΚ序列全長構(gòu)成的肽。
[0147] 本發(fā)明的肽，尤其是本發(fā)明的九肽和十肽，在其側(cè)翼可以具有額外的氨基酸殘基， 只要所得的肽保持其CTL誘導(dǎo)能力即可。具體的額外氨基酸殘基可以由任何種類的氨基酸 構(gòu)成，只要其不損害原來的肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明涵蓋具有CTL誘導(dǎo)能力的肽， 尤其是源自 Τ0ΡΚ 的肽（例如，包含 SEQ ID N0:2、3、6、27、28、42、45、47、50、51、53、54、62、 63、64、66、71、72或76的氨基酸序列的肽）。這樣的肽為例如少于約40個氨基酸，經(jīng)常少 于約20個氨基酸，且通常少于約15個氨基酸。
[0148] -般而言，肽中一個、兩個或更多個氨基酸的修飾不會影響肽的功能，而且在有 些情況下甚至?xí)鰪娫鞍踪|(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽（即由與原 始參照序列相比已有一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基修飾（即取代、添加、缺失和/或插 入）的氨基酸序列構(gòu)成的肽）保留原始肽的生物學(xué)活性（Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA1984,81:5662-6 ;Zoller and Smith, Nucleic Acids Resl982,10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA1982, 79:6409-13)。因此，在一個實 施方案中，本發(fā)明的肽既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有選自SEQ ID NO: 2-40和42-84的氨基 酸序列，其中所述序列添加、缺失、插入和/或取代了一個、兩個或甚至更多個氨基酸。本發(fā) 明的肽既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有選自SEQ ID NO:2-40和42-84的氨基酸序列中添加、 缺失、插入和/或取代了一個、兩個或數(shù)個氨基酸而得到的氨基酸序列。
[0149] 本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，對氨基酸序列進行改變?nèi)堪被嵝蛄兄械膯蝹€氨基酸 或少數(shù)百分比氨基酸的個別修飾（例如缺失、插入、添加和/或取代）傾向于導(dǎo)致原始 氨基酸側(cè)鏈的特性的保留；因此其被稱作"保守替代"或"保守修飾"，其中對蛋白質(zhì)的 改變導(dǎo)致具有與原始蛋白質(zhì)類似的功能的修飾蛋白質(zhì)。提供功能上相似的氨基酸的保 守取代表是本領(lǐng)域公知的。期望保留的氨基酸側(cè)鏈特征的例子包括例如疏水性氨基酸 (A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸（R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能 團或特征的側(cè)鏈：脂肪族側(cè)鏈（G，A，V，L，I，P);含羥基側(cè)鏈（S，T，Y);含硫原子側(cè)鏈（C，M); 含羧酸和酰胺側(cè)鏈（D，N，E，Q);含堿側(cè)鏈（R，K，H);和含芳香側(cè)鏈（H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的 八組各自含有本領(lǐng)域認(rèn)可互為保守替代的氨基酸：
[0150] 1)丙氨酸（A)，甘氨酸（G);
[0151] 2)天冬氨酸（D)，谷氨酸（E);
[0152] 3)天冬酰胺（N)，谷氨酰胺（Q);
[0153] 4)精氨酸（R)，賴氨酸（K);
[0154] 5)異亮氨酸（I)，亮氨酸（L)，甲硫氨酸（M)，繳氨酸（V);
[0155] 6)苯丙氨酸（F)，酪氨酸（Y)，色氨酸（W);
[0156] 7)絲氨酸⑶，蘇氨酸（T);和
[0157] 8)半胱氨酸（C)，甲硫氨酸（M)(參見例如 Creighton, Proteinsl984)。
[0158] 此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，可包括非保守 修飾，只要該肽保留原始未修飾肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除源自Τ0ΡΚ 的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因的可誘導(dǎo)CTL的肽。
[0159] 可以對本發(fā)明的肽插入、取代或添加氨基酸殘基，或者，可以從本發(fā)明的肽缺失氨 基酸殘基，以實現(xiàn)更高的結(jié)合親和力。為了保持所需的CTL誘導(dǎo)能力，可以修飾（即缺失、插 入、添加和/或取代）少數(shù)（例如，1個、2個或數(shù)個）或小百分比的氨基酸。這里，術(shù)語"數(shù) 個"意指5個以下的氨基酸，如4個或3個以下。要被修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選為20% 以下，更優(yōu)選15%以下，進一步更優(yōu)選10%以下，例如1-5%。
[0160] 當(dāng)在免疫療法的語境中使用時，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上， 優(yōu)選作為與HLA抗原的復(fù)合物。因此，優(yōu)選選擇不僅誘導(dǎo)CTL而且具有對HLA抗原的 高結(jié)合親和力的肽。為此目的，可以對肽通過取代、插入、缺失和/或添加氨基酸殘基 來加以修飾以產(chǎn)生具有更好的結(jié)合親和力的修飾肽。除了天然被展示的肽之外，由 于通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列規(guī)律是已知的（J Immunoll994, 152:3913; Immunogeneticsl995, 41:178 ;J Immunoll994, 155:4307)，可將基于此類規(guī)律的修飾引入 本發(fā)明的免疫原性肽。
[0161] 例如，具有高的HLA-A24結(jié)合親和力的肽的自N端起的第二個氨基酸傾向于被取 代為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸。類似地，C端氨基酸被取代為苯丙氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽往往具有高的HLA-A24結(jié)合親和力。由此，可能期望 將自N端起的第二個氨基酸取代為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或?qū)端氨 基酸取代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸，以增加 HLA-A24結(jié)合親和力。 因此，具有選自SEQ ID NO:2-40 (尤其是SEQ ID N0:2, 3, 6, 27和28)的氨基酸序列，其中所 述SEQ ID N0的氨基酸序列的自N端起的第二個氨基酸被取代為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨 酸或色氨酸，和/或其中所述SEQ ID N0的氨基酸序列的C端被取代為苯丙氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。此外，本發(fā)明涵蓋這樣的肽，其包含 在選自SEQ ID N0:2-40(尤其是SEQ ID N0:2,3,6,27和28)的氨基酸序列中取代、缺失、 插入、和/或一個、兩個或數(shù)個氨基酸而得到的氨基酸序列，這樣的肽具有下述特征之一或 二者：(a)自N端起的第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；和（b)C末端 氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的 肽包括在選自SEQ ID NO:2-40 (尤其是SEQ ID NO: 2, 3, 6, 27和28)的氨基酸序列中自N 端起的第二個氨基酸被取代為苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，和/或C末端氨基酸 被取代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸而得到的氨基酸序列。
[0162] 類似地，具有高的HLA-A2結(jié)合親和力的肽的自N端起的第二個氨基酸傾向于被取 代為亮氨酸或甲硫氨酸和/或C端氨基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸。由此，可能期望將自N 端起的第二個氨基酸取代為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或?qū)端氨基酸取代為纈氨酸或亮氨 酸，以增加 HLA-A2結(jié)合親和力。因此，具有選自SEQIDN0:42-84(尤其是SEQIDN0:42 ，45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76)的氨基酸序列，其中所述 SEQ ID N0 的氨 基酸序列的自N端起的第二個氨基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸，和/或其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列的C端被取代為纈氨酸或亮氨酸的肽涵蓋在本發(fā)明之內(nèi)。此外，本發(fā)明涵 蓋這樣的肽，其包含在選自 SEQ ID N0:42-84(尤其是 SEQ ID N0:42,45,47,50,51，53,54， 62, 63, 64, 66, 71，72和76)的氨基酸序列中取代、缺失、插入、和/或一個、兩個或數(shù)個氨基 酸而得到的氨基酸序列，這樣的肽具有下述特征之一或二者：(a)自N端起的第二個氨基酸 是亮氨酸或甲硫氨酸；和（b)C末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā) 明的肽包括在選自 SEQ ID N0:42-84(尤其是 SEQ ID N0s:42、45、47、50、51、53、54、62、63、 64、66、71、72和76)的氨基酸序列中自N端起的第二個氨基酸被取代為亮氨酸或甲硫氨酸， 和/或C末端氨基酸被取代為纈氨酸或亮氨酸而得到的氨基酸序列。
[0163] 不僅可以在肽的末端氨基酸處引入取代，而且可以在肽的潛在TCR識別 位置處引入取代。數(shù)項研究已證明了具有氨基酸取代的肽可等同于或好于原來， 例 如 CAP1、p53(264_272)、Her-2/neu(369_ 377)或 gplOO(209_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) ； 168 (3) : 1338-47. , S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003)52:199-206 及 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53, 307-314) 〇
[0164] 本發(fā)明還考慮也可以向本發(fā)明的肽的N和/或C端添加1個、2個或數(shù)個氨基酸。 此類具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽也包含在本發(fā)明之內(nèi)。
[0165] 例如，本發(fā)明提供長度少于15、14、13、12、11或10個氨基酸的分離的肽，其具有 CTL誘導(dǎo)能力并且包含選自下組的氨基酸序列：
[0166] (i)選自SEQ ID NO:2-24和42-60的氨基酸序列，
[0167] (ii)在選自SEQ ID N0:2-24和42-60的氨基酸序列中修飾了 1、2或數(shù)個氨基酸， 其中所述肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的能力，和
[0168] (ii) (iii)的氨基酸序列，其中，在HLA-A24的背景下，該氨基酸序列具有所述氨 基酸序列具有下述特征之一或二者：
[0169] (a)所述SEQ ID N0的自N末端起的第二個氨基酸為或被修飾為選自苯丙氨酸、酪 氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和
[0170] (b)所述SEQ ID NO的C末端氨基酸為或被修飾為選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；和
[0171] (iv) (ii)的氨基酸序列，其中，在HLA-A2的背景下，該氨基酸序列具有所述氨基 酸序列具有下述特征之一或二者：
[0172] (c)所述SEQ ID N0的自N末端起的第二個氨基酸為或被修飾為選自亮氨酸和甲 硫氨酸的氨基酸；和
[0173] (d)所述SEQ ID N0的C末端氨基酸為或被修飾為選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸。
[0174] 此外，本發(fā)明提供長度少于15、14、13、12、11或10個氨基酸的分離的肽，其具有 CTL誘導(dǎo)能力并且包含選自下組的氨基酸序列：
[0175] (i，）選自 SEQ ID NO:25-40 和 61-84 的氨基酸序列，
[0176] (ii''）在選自SEQ ID N0:25-40和61-84的氨基酸序列中修飾了 1、2或幾個氨 基酸，其中所述肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的能力，和
[0177] (iii'）（i'）的氨基酸序列，其中，在HLA-A24的背景下，該氨基酸序列具有所述氨 基酸序列具有下述特征之一或二者：
[0178] (a'）所述SEQ ID Ν0的自Ν末端起的第二個氨基酸為或被修飾為選自苯丙氨酸、 酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和
[0179] (b'）所述SEQ ID N0的C末端氨基酸為或被修飾為選自苯丙氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。
[0180] (iii'）α'）的氨基酸序列，其中，在HLA-A2的背景下，該氨基酸序列具有所述氨 基酸序列具有下述特征之一或二者：
[0181] (c'）所述SEQ ID Ν0的自Ν末端起的第二個氨基酸為或被修飾為選自亮氨酸和 甲硫氨酸的氨基酸；和
[0182] (d'）所述SEQ ID N0的C末端氨基酸為或被修飾為選自纈氨酸和亮氨酸的氨基 酸。
[0183] 當(dāng)這些肽與APC接觸時，這些肽與APC上的HLA抗原結(jié)合，作為與HLA抗原的復(fù)合 物被呈遞在APC上。或者，當(dāng)這些肽與APC接觸時，這些肽被導(dǎo)入APC，在APC中被加工成具 有選自（i)-(iv)或（i'）-(iv'）的氨基酸序列的片段，作為與HLA抗原的復(fù)合物被呈遞在 APC上。結(jié)果，誘導(dǎo)出對這些肽特異性的CTL。
[0184] 然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分相同 時，可能誘導(dǎo)不良副作用，諸如自身免疫性病癥和/或針對特定物質(zhì)的變應(yīng)性癥狀。因此， 可能理想的是首先利用可用的數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索，以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的 氨基酸序列匹配的情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索清楚了自然界不存在與目標(biāo)肽相同或僅有1個 或2個氨基酸差異的肽時，可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高 其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任何發(fā)生此類副作用的危險。
[0185] 雖然如上所述的對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽預(yù)期是高度有效的，但還是對 根據(jù)高結(jié)合親和力的存在為指標(biāo)選出的候選肽檢查了 CTL誘導(dǎo)能力的存在。這里，短語 "CTL誘導(dǎo)能力"指肽被呈遞到抗原呈遞細(xì)胞（APC)上時誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)的 能力。另外，"CTL誘導(dǎo)能力"包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細(xì)胞、和提高 CTL的IFN-γ生成的能力。
[0186] CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實現(xiàn)，誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的APC(例如B-淋巴細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞（DC))，或者更具體地說，源自人外周血單核白細(xì)胞的DC，并且在用 測試肽刺激APC后，將APC與CD8陽性T細(xì)胞混合以誘導(dǎo)CTL，然后測量由CTL針對靶細(xì)胞生 成和釋放的IFN-γ。作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)制成的表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物（例如 BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000,61 (8):764-79Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H)response中描述的那些）。或者，可以用51Cr等放射性標(biāo)記革巴細(xì) 胞，并且可以自靶細(xì)胞釋放的放射性計算CTL的細(xì)胞毒性活性?；蛘撸珻TL誘導(dǎo)能力可以如 下評估：測量在攜帶固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞（APC)存在下由CTL生成和釋放的IFN-γ， 并使用抗IFN-γ單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)。
[0187] 作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選自由SEQ ID N0:2, 3, 6, 27, 2 8, 42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72和76所示的氨基酸序列的九肽或十肽不但 具有對HLA抗原的高親和力，還具有特別高的CTL誘導(dǎo)能力。因此，例舉這些肽為本發(fā)明優(yōu) 選的實施方案。
[0188] 另外，同源性分析的結(jié)果顯示了這些肽與自任何其它已知人基因產(chǎn)物衍生的肽沒 有顯著的同源性。因此，降低了用于免疫療法時發(fā)生未知的或不想要的免疫應(yīng)答的可能性。 因此，也是根據(jù)這個方面，這些肽可用于在癌癥患者中引發(fā)針對Τ0ΡΚ的免疫力。因此，本發(fā) 明的肽的優(yōu)選例子包括，但不限于，具有選自SEQ ID N0:2, 3, 6, 27, 28, 42, 45, 47, 50, 51，53 ，54, 62, 63, 64, 66, 71，72和76的氨基酸序列的肽和它們的修飾肽。
[0189] 如上所述，本發(fā)明的肽具有誘導(dǎo)針對Τ0ΡΚ特異性的CTL的能力。例如，具有選自 SEQ ID N0s:2、3、6、27和28的氨基酸序列的肽、或其修飾肽，具有誘導(dǎo)CTL的能力，其誘導(dǎo) 的CTL能夠顯示針對藉由HLA-A24呈遞衍生自Τ0ΡΚ的肽的細(xì)胞（S卩，表達Τ0ΡΚ和HLA-A24 的細(xì)胞）的特異性細(xì)胞毒活性。這樣的細(xì)胞的例子包括HLA-A24陽性癌細(xì)胞。類似地，具 有選自 SEQ ID 勵:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72和76的氨基酸序列的肽、 或其修飾肽，具有誘導(dǎo)CTL的能力，其誘導(dǎo)的CTL能夠顯示針對藉由HLA-A2呈遞衍生自 Τ0ΡΚ的肽的細(xì)胞（S卩，表達Τ0ΡΚ和HLA-A2的細(xì)胞）的特異性細(xì)胞毒活性。這樣的細(xì)胞包 括HLA-A2陽性癌細(xì)胞。
[0190] 除上述的修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它肽，只要所得的連接肽保留 原始肽所需的CTL誘導(dǎo)能力，并且，優(yōu)選地，還保留所需的HLA結(jié)合能力。合適的"其 他"肽的例子包括：從其他TAA衍生的能誘導(dǎo)CTL的肽。本發(fā)明的肽可以通過接頭直 接或間接地連接于"其他"肽。合適的肽間接頭是本領(lǐng)域公知的，且包括例如AAY(P. M. Daftarian et al. , J Trans Med2007, 5: 26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al. , J Immunol. 2000, 165:7308-7315)或K(S. Ota et al·，Can Res. 62, 1471-1476, K.S.Kawamura et al. , J Immunol. 2002, 168:5709-5715)〇
[0191] 例如，也可以序貫地或者同時地使用非Τ0ΡΚ腫瘤相關(guān)抗原肽，來增加藉由HLA I 類和/或HLA II類的免疫應(yīng)答。公認(rèn)癌細(xì)胞能表達多于一種腫瘤相關(guān)基因。故而，確定特 定的受試者是否表達其他腫瘤相關(guān)基因，并進一步將衍生這樣的基因產(chǎn)物的HLA I類結(jié)合 肽和/或HLA II類結(jié)合肽包含在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物或疫苗中，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常 規(guī)實驗的范圍之內(nèi)的。
[0192] 某些I類HLAI和II類HLA結(jié)合肽是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉的（例如參見 Coulie，Stem Cellsl3:393-403，1995)，而且可以以與本文公開類似的方式用于本發(fā)明。因 此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程來容易地制備包括一種或多種Τ0ΡΚ 肽和一種或多種非Τ0ΡΚ肽的多肽，或編碼此類多肽的核酸。
[0193] 上文所述的連接的肽在本文中被稱為"多表位"（polytope) "，即兩個或更多個潛 在免疫原性或免疫應(yīng)答刺激性肽構(gòu)成的組，這些肽可以以各種排列方式（例如串聯(lián)、交疊） 連接在一起。該多表位（或編碼該多表位的核酸）可以以標(biāo)準(zhǔn)免疫方案來施用，例如施用 于動物，以測試該多表位刺激、增強和/或引起免疫應(yīng)答的有效性。
[0194] 肽可直接地或經(jīng)使用側(cè)翼序列連接在一起以形成多表位，而且多表位作 為疫苗的用途是本領(lǐng)域公知的（參見例如Thomson et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA92(13):5845-5849, 1995 ；Gilbert et al., Nature Biotechnol.15(12):1280-12 84，1997 ;Thomson et al.，J Immunol. 157 (2) :822-826, 1996 ;Tarn et al.，J Exp. Med. 171(1) :299-306, 1990)。可制備含有不同數(shù)目和組合的表位的多表位并測試它們被 CTL識別的情況及提高免疫應(yīng)答的功效。
[0195] 本發(fā)明的肽還可連接至其它物質(zhì)，只要所得的連接肽保留原始肽的所需的CTL誘 導(dǎo)能力。合適的物質(zhì)的例子包括例如：肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；⑻烊坏暮秃铣傻木酆衔?等。肽還可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等等，條件是該修飾不破壞如原始肽 的生物學(xué)活性?？蛇M行這些類型的修飾可賦予額外的功能（例如靶向功能和投遞功能）或 使肽穩(wěn)定。
[0196] 例如，為了提高肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或非 天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于此處的肽。肽的穩(wěn)定性可以以多種方式測定。例如，可使 用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)（諸如人血漿和血清）來測試穩(wěn)定性（參見例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokinl986, 11:291-302) 〇
[0197] 此外，如上文所述，在上述取代、缺失、插入或添加了 1個、2個或數(shù)個氨基酸殘基 的修飾肽中，可以篩選或選擇與原始肽相比活性相同或更高者。因此，本發(fā)明還提供由于篩 選或選擇與原始肽相比活性相同或更高的修飾肽的方法。一種示例的方法包括下述步驟：
[0198] a:對本發(fā)明的肽修飾（即取代、缺失、插入或添加）至少一個氨基酸殘基，
[0199] b:測定肽的活性，
[0200] c :選擇具有與原始肽相比相同或更高活性的肽。
[0201] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種用于篩選具有誘導(dǎo)CTL的能力的肽的方 法，所述CTL具有針對呈遞有衍生自Τ0ΡΚ的片段的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性，其中所述方 法包括如下步驟：
[0202] (i)提供由對原始氨基酸序列通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個 氨基酸殘基而修飾得到的氨基酸序列組成的候選序列，其中所述原始氨基酸序列選自SEQ ID N0:2、3、6、27、28、42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72 和 76，
[0203] (ii)選擇與衍生自除Τ0ΡΚ之外的任何已知人基因產(chǎn)物的肽均無實質(zhì)顯著同源性 (或序列同源性）的候選序列；
[0204] (iii)使由步驟（ii)中選擇的候選序列組成的肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸；
[0205] (iv)使步驟（c)的抗原呈遞細(xì)胞與CD8陽性細(xì)胞接觸；和
[0206] (V)鑒定其CTL誘導(dǎo)能力相同于或高于與由原始氨基酸序列組成的肽的肽。
[0207] 本文中，要測定的活性可包括MHC結(jié)合活性，APC或CTL誘導(dǎo)能力，和細(xì)胞毒活性。
[0208] 優(yōu)選地，要測定的肽的活性是CTL誘導(dǎo)能力。
[0209] III. Τ0ΡΚ 狀的制各
[0210] 本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或 化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或合成為包括兩個或更多個肽的較長多肽。然 后可以分離，即純化或分離所述肽，以使其基本上沒有其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)及 其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。
[0211] 本發(fā)明的肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提是該修飾不破 壞原始肽的生物學(xué)活性。其他示例性的修飾包括摻入一種或多種D-氨基酸或其他可用的 氨基酸模擬物，以便例如增加肽的血清半壽期。
[0212] 可以根據(jù)選定的氨基酸序列，借助化學(xué)合成來獲得本發(fā)明的肽?？蛇m用于合成的 常規(guī)肽合成法的例子包括：
[0213] (i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
[0214] (ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
[0215] (iii) Peptide Synthesis (日文），Maruzen Co.，1975 ;
[0216] (iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),Maruzen Co.,1985 ；
[0217] (v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文），Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；
[0218] (vi)W099/67288 ;和
[0219] (vii)Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2, ^Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
[0220] 或者，可適用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽（例如 Morrison J, J Bacteriologyl977,132:349-51 ；Clark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，制備包含處于可表達形式（例 如處于相當(dāng)于啟動子序列的調(diào)節(jié)序列下游）的編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化 入合適的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體 外生產(chǎn)肽。
[0221] IV.多核苷酸
[0222] 本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括源自天然存在型Τ0ΡΚ 基因（例如GenBank Accession No. NM_018492(SEQ ID N0:85))的多核苷酸，以及具有它們 的經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語"經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列" 指編碼相同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，對于任何給定蛋 白質(zhì)都有極其多種功能上相同的核酸來編碼它。例如，密碼子60八、60：、606、和6(^都編碼 氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子規(guī)定為丙氨酸的任何位置處，該密碼子可改變成任何相應(yīng) 所述密碼子，而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是"沉默變異"，是保守修飾變異的一 種。本文中編碼肽的每一種核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員會認(rèn)識到，核酸中的每一個密碼子（AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨 酸的唯一密碼子，而TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子）都可以被修飾以產(chǎn)生功能 上相同的分子。因而，每一種所公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。
[0223] 本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。如本領(lǐng)域公知的，DNA由堿 基諸如A、T、C、和G合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到非天然 存在的堿基也包括在多核苷酸中。
[0224] 本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，其中它們之間有或無居間氨基酸序列。 例如，居間氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻譯的肽的切割位點（例如酶識別序列）。另 夕卜，多核苷酸除編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可 以是包括表達肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達 載體（質(zhì)粒）。一般而言，此類重組多核苷酸可通過常規(guī)重組技術(shù)操作多核苷酸來制備，例 如通過使用聚合酶和內(nèi)切核酸酶。
[0225] 重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn) 染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘撸山柚鶳CR技術(shù)或通過在 合適宿主中的表達來擴增多核苷酸（參見例如Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)?；蛘?，可使用固相 技術(shù)來合成多核苷酸，如 Beaucage SL&Iyer RP，Tetrahedronl992, 48:2223-311 ;Matthes et al.，EMB0 J1984, 3:801-5 中記載的。
[0226] V.夕卜來體（exosomes)
[0227] 本發(fā)明進一步提供了稱作外來體的細(xì)胞內(nèi)囊泡，這些外來體在它們的表面上呈遞 本發(fā)明肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合體。外來體可以通過，例如在日本專利申請公表公報 平11-510507和W099/03499中詳細(xì)描述的方法來制備，并可以用從作為治療和/或預(yù)防對 象的患者獲得的APC制備。本發(fā)明的外來體可以作為疫苗以與本發(fā)明的肽相似的方式進行 接種。
[0228] 復(fù)合體中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的類型 匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24和HLA-A2 (尤其是HLA-A*2402和HLA-A*0201和 HLA-A*0206)是普遍存在的，因此對于日本人患者的治療可能是適合的。使用在日本人和白 種人中高度表達的HLA-A24型對于獲得有效的結(jié)果是有利的，而且也可以使用HLA-A2402、 HLA-A*0201和HLA-A*0206等亞型。典型地，在臨床上，預(yù)先考察需要治療的患者的HLA抗 原類型，這樣就能夠合適地選擇對該特定抗原具有高水平的結(jié)合親和力、或者具有藉由抗 原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。此外，為了獲得同時具有高結(jié)合親和力和CTL誘導(dǎo)能力的肽， 可以在天然存在的Τ0ΡΚ部分肽的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進行1個、2個或數(shù)個氨基酸的取代、 插入、缺失和/或添加。
[0229] 當(dāng)本發(fā)明的外來體具有HLA-A24型作為抗原時，包含選自SEQ ID NO: 2-40(尤其 是SEQ ID NO:2、3、6、27和28)的肽是特別有用的。
[0230] 或者，當(dāng)本發(fā)明的外來體具有HLA-A2型作為抗原時，包含選自SEQ ID N0:42-84(尤其是SEQ ID 勵:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72和76)的肽是特 別有用的。
[0231] 在一些實施方案中，本發(fā)明的外來體是在它們的表面上呈遞本發(fā)明的肽與 HLA-A24或HLA-A2抗原的復(fù)合物的外來體。
[0232] VI.抗原旱遞細(xì)朐（APC)
[0233] 本發(fā)明還提供在其表面上呈遞在HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的分離 的抗原呈遞細(xì)胞（APC)。所述APC可源自作為治療和/或預(yù)防對象的患者，而且可作為疫苗 單獨地或與其它藥物（包括本發(fā)明的肽、外來體、或CTL)組合來施用。
[0234] APC不限于特定種類的細(xì)胞。APC的例子包括，但不限于，樹突細(xì)胞（DC)、 Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知這些細(xì)胞可在它們的細(xì)胞表面上 呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，以供淋巴細(xì)胞識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導(dǎo)活性的代 表性APC，DC可以優(yōu)選地用作本發(fā)明的APC。
[0235] 例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后在體外、離體或在體內(nèi)用本發(fā)明的肽 接觸（刺激）它們來獲得APC。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導(dǎo)出呈 遞本發(fā)明肽的APC。本文中，短語"誘導(dǎo)APC"包括使本發(fā)明的肽接觸（刺激）抗原呈遞細(xì) 胞，或?qū)⒕幋a本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞，以將HLA抗原與本發(fā)明的肽之間 形成的復(fù)合物呈遞到其表面。例如，可以通過對受試者施用一種或多種本發(fā)明的肽，然后從 受試者收集APC，來獲得本發(fā)明的APC?；蛘撸梢酝ㄟ^使從受試者收集而來的APC與本發(fā) 明的肽接觸來獲得本發(fā)明的APC。
[0236] 本發(fā)明的APC可以單獨或者與其他藥物，包括本發(fā)明的肽、外來體或CTL組合施用 給受試者，以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答。例如，離體施用可包括下述步驟：
[0237] a :自第一受試者收集APC ;
[0238] b :使步驟a的APC接觸肽；并
[0239] c :對第二受試者步驟b的APC。
[0240] 第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體。通過步驟b獲 得的APC可以作為治療和/或預(yù)防癌癥用的疫苗配制和施用，所述癌癥例如膀胱癌、乳腺 癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、CML、結(jié)直腸癌、食道癌、胃癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、 卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、SCLC、軟組織腫瘤和睪丸癌，但不限于這些。
[0241] 在本發(fā)明的語境中，可以利用一種或多種本發(fā)明的肽來制造用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì) 胞的藥物組合物。本文中提供了用于制備誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞用的藥物組合物的方法或工 藝，其優(yōu)選包括混合或本發(fā)明的肽與可藥用載體的步驟。
[0242] 本發(fā)明還提供本發(fā)明的肽用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的用途。
[0243] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的APC具有CTL誘導(dǎo)能力。在APC的語境下，短語 "CTL誘導(dǎo)能力"指APC與⑶8陽性細(xì)胞接觸時誘導(dǎo)CTL的能力。此外，"CTL誘導(dǎo)能力"包 括APC肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細(xì)胞、和提高CTL的IFN- γ生成的能力。 尤其是，本發(fā)明的APC具有誘導(dǎo)對Τ0ΡΚ特異性的CTL的能力。
[0244] 這樣的具有CTL誘導(dǎo)能力的APC除了用上文描述的方法外，還包括在體外將含 有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟的方法來制備。所導(dǎo)入的基因可以 是DNA或RNA的形式。用于進行導(dǎo)入的方法的例子包括但不具體限于本領(lǐng)域中常規(guī)實施 的各種方法，例如可使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、或磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Resl996, 56:5672-7 ;J Immunol 1998, 161:5607-13 ;J Exp Medl996, 184:465-72 ;國際公開 文本No. 2000-509281的已
【公開日】文翻譯中所述來實施。通過將編碼本發(fā)明的肽的基因轉(zhuǎn) 移入APC，基因在細(xì)胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工， 并經(jīng)由呈遞途徑呈遞給本發(fā)明的肽?；蛘撸梢酝ㄟ^包括使APC與本發(fā)明的肽接觸的步驟 的方法來制備本發(fā)明的APC。
[0245] 在一些實施方案中，本發(fā)明的APC是在它們的表面上呈遞HLA-A24或HLA-A2抗原 與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的APC。
[0246] 在典型的實施方案中，本發(fā)明的APC在其表面上呈遞著具有氨基酸序列SEQ ID NO:2, 3, 6, 27或28的肽（或其修飾肽）與HLA-A24的復(fù)合物。在其他的實施方案中，本發(fā) 明的APC其表面上呈遞著具有氨基酸序列SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 6 6, 71，72或76的肽（或其修飾肽）與HLA-A2的復(fù)合物。
[0247] VII.細(xì)朐毒件T細(xì)朐（CTL)
[0248] 誘導(dǎo)出的針對任何一種本發(fā)明肽的CTL可在體內(nèi)加強靶向癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并 且因此可以以與肽本身相似地用作疫苗。因此，本發(fā)明提供由任何一種本發(fā)明肽特異性誘 導(dǎo)或活化的、分離的CTL。
[0249] 此類CTL可通過下述步驟來獲得：（1)對受試者施用本發(fā)明的肽；（2)在體外用本 發(fā)明的肽接觸（刺激）源自受試者的APC，以及CD8陽性T細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞；（3) 在體外使CD8陽性T細(xì)胞或外周血單核白細(xì)胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與肽之間形成 的復(fù)合物的APC或外來體；或（4)向CTL中導(dǎo)入T細(xì)胞受體（TCR)亞單位的多核苷酸，所 述T細(xì)胞亞單位能夠形成具有結(jié)合細(xì)胞表面上的HLA抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的能力的 TCR。上述（3)的APC或外來體可通過上文記載的方法來制備。（4)的方法的詳情記載于下 文"VIII. T細(xì)胞受體（TCR) "部分。
[0250] 本發(fā)明的CTL可以從要進行治療和/或預(yù)防的患者獲取，而且可以將它們單獨施 用，或者與其它藥物（包括本發(fā)明的肽、APC或外來體）組合施用以產(chǎn)生調(diào)節(jié)效果。所得到 的CTL特異性針對呈遞本發(fā)明的肽（例如與用于誘導(dǎo)的肽相同的肽）的靶細(xì)胞起作用。靶 細(xì)胞可以是內(nèi)源表達Τ0ΡΚ的細(xì)胞，例如癌細(xì)胞，或者或被Τ0ΡΚ基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因本 發(fā)明肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞本發(fā)明肽的細(xì)胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。
[0251] 在一些實施方案中，本發(fā)明的CTL是這樣的CTL，其識別在其表面上呈遞HLA-A24 或HLA-A2抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物的細(xì)胞。在CTL的語境中，短語"識別細(xì)胞"是指通 過其TCR結(jié)合HLA-A24或HLA-A2抗原與本發(fā)明的肽的復(fù)合物并顯示針對該細(xì)胞的特異性 細(xì)胞毒活性。這里，"特異性細(xì)胞毒活性"是指針對呈遞HLA-A24或HLA-A2抗原與本發(fā)明的 肽的復(fù)合物的細(xì)胞，但不針對其他細(xì)胞顯示細(xì)胞毒活性。相應(yīng)地，顯示針對呈遞有本發(fā)明的 肽的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性的CTL包含在本發(fā)明中。
[0252] 在典型的實施方案中，本發(fā)明的CTL能夠識別通過HLA-A24呈遞具有氨基酸序列 SEQ ID N0:2、3、6、27或28的肽（或其修飾肽）的細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的此 類CTL能夠識別表達Τ0ΡΚ和HLA-A24的細(xì)胞（例如HLA-A24陽性癌細(xì)胞）。
[0253] 在其他實施方案中，本發(fā)明的CTL能夠識別通過HLA-A2呈遞具有氨基酸序列SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 或 76 的肽（或其修飾肽）的細(xì)胞。在 優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的此類CTL能夠識別表達Τ0ΡΚ和HLA-A2的細(xì)胞（例如HLA-A2 陽性癌細(xì)胞）。
[0254] VIII. T 細(xì)朐夸體（TCR)
[0255] 本發(fā)明還提供包含編碼一種或多種能夠形成T細(xì)胞受體（TCR)的亞單位的多肽 的多核苷酸的組合物，及使用該組合物的方法。這樣的TCR亞基能夠形成TCR，后者賦予T 細(xì)胞以針對呈遞Τ0ΡΚ的腫瘤細(xì)胞的特異性。通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可鑒定出在用 本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的CTL中分別編碼TCR亞基的α和β鏈的多核苷酸（W02007/032255及 Morgan et al.，J Immunol, 171，3288 (2003))。例如，優(yōu)選用 PCR 方法分析 TCR。用于分析 的PCR引物可以是，例如，作為5'側(cè)引物的5' -R引物（5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3'） (SEQ ID N0:87)，以及作為3'側(cè)引物的對TCRa鏈C區(qū)特異的3-TRa-C引物 (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'）（SEQIDN0:88)，對TCRβ鏈Cl區(qū)特異的3-TRb-Cl 引物（5'-tcagaaatcctttctcttgac_3，）（SEQ ID N0:89),或?qū)?TCRP 鏈 C2 區(qū)特異的 3_TRbeta_C2 引物（5'-ctagcctctggaatcctttctctt_3'）（SEQ ID N0:90)，但不限于此。衍 生的TCR能夠以高親合力結(jié)合呈遞Τ0ΡΚ肽的靶細(xì)胞，并任選地在體內(nèi)和體外介導(dǎo)針對呈遞 本發(fā)明的Τ0ΡΚ肽的靶細(xì)胞的高效殺傷。
[0256] 可以將編碼TCR亞單位的多核苷酸（即編碼兩個TCR亞單位的一個多核苷酸和分 別編碼一個TCR亞單位的兩個多核苷酸）摻入合適的載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。這些 載體是本領(lǐng)域公知的?？梢詫⑺龆嗪塑账峄蛘甙鼈兊妮d體有用地轉(zhuǎn)入T細(xì)胞（例如 CD8陽性T細(xì)胞），例如來自患者的T細(xì)胞中。有利的是，本發(fā)明提供一種即配即用型組合 物，其容許快速修飾患者自己的T細(xì)胞（或其他哺乳動物的T細(xì)胞）以快速且容易地生成 具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的修飾型T細(xì)胞。
[0257] 針對本發(fā)明的肽的特異性的TCR應(yīng)當(dāng)能夠特異性地識別本發(fā)明的肽與HLA分子的 復(fù)合物，當(dāng)TCR呈遞于T細(xì)胞的表面上時給予T細(xì)胞針對靶細(xì)胞的特異性。要求的活性可以 通過任何已知方法來確認(rèn)，通過導(dǎo)入編碼此類TCR亞單位的多核苷酸而制備的CTL可以特 異性識別此類靶細(xì)胞。所述方法的優(yōu)選例子包括：利用HLA分子和本發(fā)明的肽的四聚體分 析、以及ELISP0T測定。通過實施ELISP0T測定，可以確認(rèn)通過該方法制備的CTL能夠特異 性識別靶細(xì)胞，且通過此識別產(chǎn)生的信號在細(xì)胞內(nèi)傳遞。也可以通過已知方法來確認(rèn)通過 如上所述的方法制備的CTL具有針對靶細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性。此類方法的例子包括， 例如，使用表達Τ0ΡΚ以及HLA-A24或HLA-A2的細(xì)胞的鉻釋放測定。
[0258] 在一個方面，本發(fā)明提供通過用編碼TCR亞單位多肽的多核苷酸（即編碼兩個TCR 亞單位的一個多核苷酸或分別編碼一個TCR亞單位的兩個多核苷酸）轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的CTL，其 中所述TCR亞單位所形成的TCR能夠結(jié)合細(xì)胞表面上具有選自SEQ ID N0:2-40的氨基酸 序列的Τ0ΡΚ肽與HLA-A24的復(fù)合物，或者能夠結(jié)合細(xì)胞表面上具有選自SEQ ID N0:42-84 的氨基酸序列的Τ0ΡΚ肽與HLA-A2的復(fù)合物。
[0259] 經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL在體內(nèi)能夠歸巢（homing)到癌細(xì)胞，并且可以利用公知的培養(yǎng)方 法體外擴增（例如 Kawakami et al.，J Immunol. ,142, 3452-3461 (1989))?？梢岳帽景l(fā) 明的T細(xì)胞來形成免疫原性組合物，所述組合物可以用來在需要治療和/或保護的患者中 治療或預(yù)防癌癥（參見W02006/031221，通過提述并入其全部內(nèi)容）。
[0260] IX.藥物作用劑或藥物纟目合物:
[0261] 由于Τ0ΡΚ表達在癌癥（如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌 漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤）中與正常組織相比 上調(diào)，本發(fā)明的肽或多核苷酸可用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答，從而用于治療和/或預(yù)防 癌癥，和/或用于預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供配制為用于治療和/或 預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或藥物作用劑，此組合物或作用劑 包括一種或多種本發(fā)明的肽或多核苷酸作為活性成分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì) 胞諸如APC的表面上表達本發(fā)明的肽，以用作藥物組合物或藥物作用劑。另外，上述靶向任 何一種本發(fā)明的肽的CTL也可用作本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑的活性成分。
[0262] 相應(yīng)地，本發(fā)明提供包含選自下組的至少一種活性成分的作用劑或組合物：
[0263] (a) -種或多種本發(fā)明的肽，
[0264] (b) -種或多種處于可表達形式的編碼如本文中公開的肽的多核苷酸，
[0265] (c) 一種或多種本發(fā)明的APC或外來體，和
[0266] (d) -種或多種本發(fā)明的CTL。
[0267] 本發(fā)明藥物組合物或藥物作用劑也可以用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語"疫 苗"（又稱"免疫原性組合物）是指在接種到動物體內(nèi)后具有改善、增強和/或誘導(dǎo)抗腫瘤 免疫功能的作用劑或組合物。換言之，本發(fā)明提供了作用劑或組合物用于在受試者中誘導(dǎo) 針對癌癥的免疫應(yīng)答。
[0268] 本發(fā)明的藥物組合物或作用劑可用于在受試者或患者中治療和/或預(yù)防癌癥，和 /或預(yù)防其手術(shù)后或轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)。此類受試者的例子包括人和任何其它哺乳動物，包括但不 限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑猩猩，特別是商業(yè) 上重要的動物或馴養(yǎng)的動物。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物作用劑或組合物可以配制 為供施用給抗原為HLA-A24或HLA-A2的受試者。
[0269] 在另一實施方案中，本發(fā)明還提供活性成分在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫 瘤，和/或防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或藥物作用劑中的用途，所述活性成分選自：
[0270] (a)本發(fā)明的肽；
[0271] (b)處于可表達形式的編碼此類本發(fā)明的肽的多核苷酸；
[0272] (c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC，
[0273] (d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來體；和
[0274] (e)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0275] 或者，本發(fā)明進一步提供用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或防止其手術(shù)后復(fù) 發(fā)的活性成分，所述活性成分選自下組：
[0276] (a)本發(fā)明的肽；
[0277] (b)處于可表達形式的編碼此類本發(fā)明的肽的多核苷酸；
[0278] (c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC ;
[0279] (d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來體；和
[0280] (e)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0281] 或者，本發(fā)明進一步提供一種制備用于治療或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或防止其手 術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或藥物作用劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生 理學(xué)上可接受的擔(dān)載體與選自下組的活性成分的步驟：
[0282] (a)本發(fā)明的肽；
[0283] (b)處于可表達形式的編碼此類本發(fā)明的肽的多核苷酸；
[0284] (c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC ;
[0285] (d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來體；和
[0286] (e)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0287] 在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療或預(yù)防癌癥或腫瘤、和/ 或防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)的藥物組合物或藥物作用劑的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混 合活性成分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟，其中所述活性成分選自下組：
[0288] (a)本發(fā)明的肽；
[0289] (b)處于可表達形式的編碼此類本發(fā)明的肽的多核苷酸；
[0290] (c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC ;
[0291] (d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來體；和
[0292] (e)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0293] 在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供用于治療或預(yù)防癌癥或腫瘤、和/或防止其 手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，其中所述方法包括對受試者施用選自下列的至少一種活性成分的步 驟：
[0294] (a)本發(fā)明的肽；
[0295] (b)處于可表達形式的編碼此類本發(fā)明的肽的多核苷酸；
[0296] (c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC ;
[0297] (d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來體；和
[0298] (e)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0299] 依照本發(fā)明，具有選自SEQ ID NO :2-40中的氨基酸序列的肽可以是HLA-A24限制 性表位肽。在這些肽中，具有選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列的肽能夠在受 試者中有效地誘導(dǎo)針對表達HLA-A24和Τ0ΡΚ的癌癥的強且特異性的免疫應(yīng)答。類似地，具 有選自SEQ ID N0:42-84中的氨基酸序列的肽可以是HLA-A2限制性表位肽。在這些肽中， 具有選自 SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76 的氨基酸序列的肽 能夠在受試者中有效地誘導(dǎo)針對表達HLA-A2和Τ0ΡΚ的癌癥的強且特異性的免疫應(yīng)答。因 此，包含任何具有選自SEQIDN0 :2-40(尤其是SEQIDN0:2、3、6、27和28)的氨基酸序列 的肽的藥物組合物或藥物作用劑特別適合于對HLA抗原為HLA-A24的受試者施用。類似 地，包含任何具有選自 SEQ ID NO:42-84(尤其是 SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 6 3, 64, 66, 71，72和76)的氨基酸序列的肽的藥物組合物或藥物作用劑特別適合于對HLA抗 原為HLA-A2的受試者施用。對于包含編碼這些肽中的任一個的多核苷酸（即本發(fā)明的多 核苷酸）的藥物組合物和藥劑也是如此。
[0300] 要用本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑治療的癌癥或腫瘤包括其中涉及（例如 過表達）Τ0ΡΚ的任何癌癥，包括例如AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、 彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0301] 本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑除上述活性成分之外還可含有其它具有誘導(dǎo) 針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其 它細(xì)胞，等等。此類"其它"具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽的實例包括但不限于 癌癥特異性抗原（例如已鑒定的ΤΑΑ)。
[0302] 如果必要，本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑可任選包括其它治療性物質(zhì)作為額 外的活性成分，只要該物質(zhì)不抑制活性成分（例如任何本發(fā)明肽）的抗腫瘤效果。例如，配 制劑可包括抗炎物質(zhì)、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。除了在藥物自身中包括其它治療性物質(zhì) 之外，本發(fā)明的藥物還可以與一種或多種其它藥理學(xué)組合物順序或同時施用。藥物和藥理 學(xué)組合物的量取決于例如所使用的藥理學(xué)組合物的類型、所治療的疾病、及施用的時序安 排和路徑。
[0303] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，除在本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物組合 物或藥物作用劑可包括與所討論的配制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它物質(zhì)（例如填充 齊U、粘合劑、稀釋劑、賦形劑等等）。
[0304] 在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑可包括在制品和 試劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病（例如癌癥）的病理狀況的材料。 制品可包括任何本發(fā)明藥物組合物或藥物作用劑的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形 瓶、和試管。容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該組合物或 劑用于治療或預(yù)防疾病的一種或多種狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。
[0305] 除上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物組合物或藥物作用劑的試劑盒還可任選 進一步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的稀釋劑。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場 看期望的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和載有使用說明的包裝 插頁。
[0306] 如果期望的話，藥物組合物或藥物作用劑可包裝在藥包或分配器裝置中提供，該 藥包或分配器裝置可裝有一個或多個含有活性成分的單位劑型。例如，藥包可包括金屬或 塑料箔，諸如泡罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。
[0307] (1)含有肽作為活性成分的藥物作用劑或藥物組合物
[0308] 本發(fā)明的肽可以作為藥物組合物或藥物作用劑直接施用，或者如果必要，通過常 規(guī)配制方法來配制。在后一種情況中，除本發(fā)明的肽之外，還可以視情況包括通常用于藥物 的擔(dān)載體、賦形劑、等等，沒有特別限制。此類擔(dān)載體的例子包括，但不限于滅菌水、生理鹽 水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液、等等。另外，藥物組合物或藥物作用劑可在必要時含有穩(wěn)定劑、 懸浮液、防腐劑、表面活性劑等等。本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑可用于抗癌目的。
[0309] 本發(fā)明的肽可制備成組合，由兩種或更多種本發(fā)明的肽組成，以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。 肽組合可以采取雞尾酒的形式，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個肽化學(xué)連 接或表達成為單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本發(fā) 明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA抗原之間形 成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL。或者，從受試者分離APC (例如DC)，然后用本發(fā)明的肽刺 激它們，來獲得在其細(xì)胞表面上展示任何所述本發(fā)明肽的APC，將這些APC重新施用給受試 者而在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出CTL，結(jié)果，可提高針對腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的攻擊性。
[0310] 任何本發(fā)明的肽作為活性成分的用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物或藥物 作用劑還可包括已知可有效地建立細(xì)胞免疫的佐劑。或者，所述藥物組合物或藥物作用劑 可以與其它活性成分一起施用，或者通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性 的蛋白質(zhì)一起（或順序）施用時增強針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。此處考慮到的佐 劑包括文獻中記載的那些（Clin Microbiol Revl994, 7:277-89)。合適佐劑的例子包括但 不限于磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、IFA(不完全弗氏佐劑）、CFA(完 全弗氏佐劑）、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG，0/W 乳液等等。
[0311] 另外，可方便地使用脂質(zhì)體配制劑、其中肽結(jié)合至幾微米直徑的珠子的顆粒配制 齊U、和其中脂質(zhì)結(jié)合至肽的配制劑。
[0312] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的肽還可以作為可藥用鹽的形式施用。優(yōu) 選的鹽的實例包括與堿金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機堿的鹽、與有機酸（例如乙酸、甲酸、 丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等）的鹽、 和與無機酸（例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸等等）的鹽。本文中所用的短語"可藥用鹽"是 指保留所述化合物的生物學(xué)有效性和性質(zhì)，通過與無機酸或堿（如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝 酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等）反應(yīng)所得到的鹽。
[0313] 在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑還可進一步包括引發(fā) (prime)CTL的成分。已經(jīng)確認(rèn)脂質(zhì)是能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的組分。例 如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε-和α-氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后 脂化肽可以在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化。作為脂質(zhì)引發(fā)CTL 應(yīng)答的另一個例子，大腸桿菌（E.coli)脂蛋白，諸如三棕櫚酰基-S-甘油基半胱氨酰絲 氨酰-絲氨酸（P3CSS)，當(dāng)與適宜的肽共價連接時，可用來引發(fā)CTL(參見例如Deres et al. , Naturel989, 342:561-4) 〇
[0314] 合適的施用方法的例子包括，但不一定限于，口服、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、骨內(nèi)、腹膜 內(nèi)和靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近（即直接注射）。施用可以通 過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患 者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Olmg至 lOOmg，例如0. lmg至10mg，例如0. 5mg至5mg，而且可以每少數(shù)天施用一次至每少數(shù)月施用 一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地選擇合適和最優(yōu)的劑量。
[0315] (2)含有多核苷酸作為活性成分的藥物作用劑或藥物組合物
[0316] 本發(fā)明的藥物組合物或藥物作用劑也可含有處于可表達形式的編碼本發(fā)明的 肽的核酸。在本文中，短語"處于可表達形式的"意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時會在體 內(nèi)表達成誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸 的核酸序列包括多核苷酸表達所必需的調(diào)節(jié)元件。多核苷酸可具有為實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶 細(xì)胞的基因組所需的配置（關(guān)于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR&Capecchi MR，Celll987,51:503-12)。參見例如 Wolff et al.，Sciencel990,247:1465-8;美國 專利 No. 5, 580, 859 ;5, 589, 466 ;5, 804, 566 ;5, 739, 118 ;5, 736, 524 ;5, 679, 647 ;及 W098/04720。基于DNA的投遞技術(shù)的例子包括"裸DNA"、易化（布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo) 的）投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介導(dǎo)的（"基因槍"）或壓力介導(dǎo)的投遞（參見例如美 國專利 No. 5, 922, 687)。
[0317] 本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒 宿主，諸如牛痘或禽痘。這種辦法涉及使用例如牛痘病毒作為載體來表達編碼肽的 核苷酸序列。在導(dǎo)入宿主后，重組牛痘病毒表達表達免疫原性肽，并由此引發(fā)免疫應(yīng) 答。可用于免疫接種方案的牛痘載體和方法記載于例如美國專利No. 4, 722, 848。另 一種載體是卡介苗（BCG, Bacilie Calmette Guerin)。BCG 載體記載于 Stover et al.，Naturel991, 351:456-60。有很多種可用于治療性施用或免疫接種的其它載體是容 易想到的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此類。參見例如Shata et al.，Mol Med Today2000,6:66-71 ;Shedlock et al.，J Leukoc Biol2000,68:793-806 ;Hipp et al·，In Vivo2000, 14:571-85〇
[0318] 將多核苷酸投遞入患者可以是直接的，其中使患者直接暴露于攜帶多核苷酸的載 體，或者是間接的，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入患 者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。
[0319] 關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy1993,12:488-505 ；ffu and ffu, Biotherapy1991, 3:87-95 ；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicoll993, 33:573-96 ；Mulligan,Sciencel993, 260:926-32 ； Morgan&Anderson, Ann Rev Biochem1993, 62: 1 9 1 -2 1 7 ；Trends in Biotechnologyl993, 11 (5):155-215。 在 eds. Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, (John ffiley&Sons, NY, 1993)；及 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990 中描述了可應(yīng)用于本發(fā)明的 重組DNA【技術(shù)領(lǐng)域】的公知方法。
[0320] 和肽的使用一樣，多核苷酸的施用可以通過口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、骨 內(nèi)、和/或腹膜內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局部施用至靶位點附近。施用可以通過 單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。合適的擔(dān)載體或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的多核苷酸的劑量可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等 等恰當(dāng)加以調(diào)整，通常是〇· ooimg至lOOOmg，例如0· Olmg至lOOmg，例如0· lmg至10mg，例 如0. 5mg至5mg，而且可以每數(shù)天施用一次至每數(shù)月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地選 擇合適的和最優(yōu)的劑量。
[0321] X. #用狀、外來體、APC和CTL的方法
[0322] 本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于制備或誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外 來體和APC也可用于制備或誘導(dǎo)CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物 組合使用，只要該其他的化合物不抑制CTL誘導(dǎo)能力。因此，任何前文所述的本發(fā)明的藥物 組合物或藥物作用劑均可用于誘導(dǎo)CTL。除它們之外，包括肽和多核苷酸者也可用于誘導(dǎo) APC，如下文討論的。
[0323] (1)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞（APC)的方法
[0324] 本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或多核苷酸來誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC的方 法。
[0325] 本發(fā)明的方法包括在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸的步驟。例如，離 體誘導(dǎo)APC的方法可包括下述步驟：
[0326] a :從受試者收集APC ;和
[0327] b :使步驟a的APC與本發(fā)明的肽接觸。
[0328] APC不限于特定種類的細(xì)胞。APC的例子包括但不限于DC、Langerhans細(xì)胞、巨噬 細(xì)胞、B細(xì)胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而 被淋巴細(xì)胞識別。優(yōu)選地可使用DC，因為它們在APC中具有最強的CTL誘導(dǎo)能力。任何一 種本發(fā)明肽均可以單獨或與其它本發(fā)明的肽或源自Τ0ΡΚ之外的TAA的CTL可誘導(dǎo)肽組合 使用。
[0329] 另一方面，當(dāng)將本發(fā)明的肽施用給受試者時，APC在體內(nèi)接觸到所述肽，結(jié)果，在受 試者的身體中誘導(dǎo)出具有CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明的方法可包括將本發(fā)明的肽 施用于受試者以在該受試者的身體中誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的步驟。類似地，當(dāng)將 處于可表達形式的本發(fā)明的多核苷酸施用于受試者時，本發(fā)明的肽在體內(nèi)表達并與APC接 觸，結(jié)果，在受試者的身體中誘導(dǎo)出具有高CTL誘導(dǎo)能力的APC。因此，本發(fā)明還可包括將本 發(fā)明的多核苷酸施用于受試者以在該受試者的身體中誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC。短語 "可表達的形式"描述于上文"IX.藥物作用劑或藥物組合物（2)含有多核苷酸作為活性組 分的藥物作用劑或藥物組合物"部分。
[0330] 本發(fā)明的方法可包括將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC以誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo) 能力的APC的步驟。例如，該方法可包括下述步驟：
[0331] a :自受試者收集APC ;并
[0332] b :向步驟a的APC中導(dǎo)入編碼本發(fā)明肽的多核苷酸。
[0333] 步驟b可如上文"VI.抗原呈遞細(xì)胞"部分中所述來實施。
[0334] 或者，本發(fā)明的方法可包括通過下述步驟之一來制備能夠特異性誘導(dǎo)針對Τ0ΡΚ 的CTL活性的抗原呈遞細(xì)胞（APC)的方法：
[0335] (a)在體外、離體或體內(nèi)使APC與本發(fā)明的肽接觸；和
[0336] (b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC中。
[0337] 或者，本發(fā)明的方法可用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC，其中所述方法包括選自 下組的步驟：
[0338] (a)使APC與本發(fā)明的肽接觸；
[0339] (b)將編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC中。
[0340] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)或制備具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方 法，所述方法包括下述步驟之一：
[0341] (a)在體外、離體或體內(nèi)使表達HLA-A24的APC接觸具有選自SEQIDN0:2至 40 (尤其是SEQ ID N0:2, 3, 6, 27和28)的肽或其修飾肽；和
[0342] (b)向表達HLA-A2的APC中導(dǎo)入編碼具有選自SEQ ID N0:2-40 (尤其是SEQ ID N0:2、3、6、27和28)的氨基酸序列的肽或其修飾肽的多核苷酸。
[0343] 通過上述方法誘導(dǎo)的APC通過HLA-A24將此類肽呈遞在其表面上，并且能夠誘導(dǎo) 具有針對表達HLA-A24和Τ0ΡΚ的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性的CTL。
[0344] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)或制備具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的方 法，所述方法包括下述步驟之一：
[0345] (a)在體外、離體或體內(nèi)使表達HLA-A2的APC接觸具有選自SEQ ID N0:42至 84(尤其是 SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76)的肽或其修飾 肽；和
[0346] (b)向表達HLA-A2的APC中導(dǎo)入編碼具有選自SEQ ID N0:42至84(尤其是SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76)的氨基酸序列的肽或其修飾肽 的多核苷酸。
[0347] 通過上述方法誘導(dǎo)的APC通過HLA-A2將此類肽呈遞在其表面上，并且能夠誘導(dǎo)具 有針對表達HLA-A2和Τ0ΡΚ的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性的CTL。
[0348] 本發(fā)明的方法可以在體外、離體或體內(nèi)實施。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以在體外或 離體實施。用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC的APC可以優(yōu)選地是表達HLA-A24或HLA-A2 抗原的APC。這樣的APC可以通過本領(lǐng)域公知的方法從獲自HLA抗原為HLA-A24或HLA-A2 的受試者的外周血單核細(xì)胞（PBMC)制備。通過本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的APC可以是在其表面 中呈遞本發(fā)明的肽與HLA抗原（HLA-A24或HLA-A2抗原）的復(fù)合物的APC。當(dāng)將通過本發(fā) 明的方法誘導(dǎo)的APC施用給受試者以在該受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答時，該受試者 優(yōu)選是APC所來源的同一受試者。不過，受試者可以不同于APC供體，只要該受試者具有與 APC供體相同的HLA類型即可。
[0349] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于在誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的APC中使用的 作用劑或組合物，此類作用劑或組合物包括一種或多種本發(fā)明的肽或多核苷酸。
[0350] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸在制備配 制為用于誘導(dǎo)APC的作用劑或組合物中的用途。
[0351] 或者，本發(fā)明還提供本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸用于在誘導(dǎo)具有CTL誘 導(dǎo)能力的APC中使用。
[0352] (2)誘導(dǎo)CTL的方法
[0353] 本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的肽、多核苷酸、外來體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。
[0354] 本發(fā)明還提供了使用編碼能形成T細(xì)胞受體（TCR)的多肽（即TCR亞單位）的多 核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，所述TCR識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物。優(yōu)選地，所述誘 導(dǎo)CTL的方法包括選自下組的至少一個步驟：
[0355] a)使⑶8陽性T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞接觸，所述抗原呈遞細(xì)胞在其表面上呈遞有 HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物；
[0356] b)使CD8陽性T細(xì)胞與外來體接觸，所述外來體在其表面上呈遞有HLA抗原與本 發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物；
[0357] c)向⑶8陽性T細(xì)胞中導(dǎo)入編碼能夠形成TCR的多肽的多核苷酸，所述TCR可識 別HLA抗原與本發(fā)明的肽之間形成的復(fù)合物。
[0358] 當(dāng)本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體被施用給受試者后，受試者的身體中誘導(dǎo) 出CTL，而且靶向表達Τ0ΡΚ的癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的強度增強。因此，取代上述步驟，本發(fā)明 的方法可包括將本發(fā)明的肽、多核苷酸、APC或外來體施用于受試者的步驟。
[0359] 或者，也可通過離體或體內(nèi)使用它們來誘導(dǎo)CTL，并且在誘導(dǎo)CTL后，將活化的CTL 返還給受試者。例如，所述方法可包括下述步驟：
[0360] a:自受試者收集APC;
[0361] b :用本發(fā)明的肽接觸步驟a的APC ;并
[0362] c :將步驟b的APC與⑶8陽性T細(xì)胞共培養(yǎng)。
[0363] 上文步驟c中要與⑶8陽性T細(xì)胞共培養(yǎng)的APC也可通過將包括本發(fā)明多核苷酸 的基因轉(zhuǎn)移入APC來制備，如上文"VI.抗原呈遞細(xì)胞"部分所述，但是本發(fā)明不限于此，而 且涵蓋任何在其表面上有效呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合物的APC。
[0364] 作為上述APC的替代，可任選地使用在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的 復(fù)合物的外來體。即，本發(fā)明還可包括將在其表面上呈遞HLA抗原和本發(fā)明肽形成的復(fù)合 物的外來體與CD8陽性細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟。此類外來體可通過上文"V.外來體"部分中描 述的方法來制備。適用于本發(fā)明的方法的APC和外來體在其表面上呈遞有本發(fā)明的肽與 HLA-A24或HLA-A2的復(fù)合物。例如，呈遞有HLA-A24與具有選自SEQ ID N0:2、3、6、27和/ 或28的氨基酸序列的肽（或其修飾肽）的APC或外來體可優(yōu)選地用于誘導(dǎo)具有針對表達 HLA-A24和TOPK的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性的CTL。同樣地，呈遞有HLA-A2與具有選自 SEQ ID N0:42, 45, 47, 50, 51，53, 54, 62, 63, 64, 66, 71，72 和 76 的氨基酸序列的肽（或其修 飾肽）的APC或外來體可優(yōu)選地用于誘導(dǎo)具有針對表達HLA-A2和TOPK的細(xì)胞的特異性細(xì) 胞毒活性的CTL。
[0365] 另外，可通過將包括編碼TCR亞單位的多核苷酸的基因?qū)擘?陽性細(xì)胞來誘導(dǎo) 本發(fā)明的CTL，其中由這樣的TCR亞單位形成的TCR能夠結(jié)合細(xì)胞表面上的HLA抗原與本發(fā) 明的肽的復(fù)合物。此類轉(zhuǎn)導(dǎo)可如上文"VIII. T細(xì)胞受體（TCR)"部分中所述來實施。
[0366] 本發(fā)明的方法可以在體外、離體或體內(nèi)實施。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以在體外或 離體實施。用于誘導(dǎo)CTL的CD8陽性T細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域公知的方法從獲自的受試者的 PBMC制備。在優(yōu)選的實施方案中，CD8陽性T細(xì)胞的供體可以是其HLA抗原為HLA-A24或 HLA-A2抗原的受試者。通過本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的CTL可以是識別在其表面上呈遞本發(fā)明的 肽與HLA抗原的復(fù)合物的細(xì)胞的CTL。這樣的CTL顯示針對在其表面上呈遞有本發(fā)明的肽 的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性，因此，能夠顯示針對表達Τ0ΡΚ的細(xì)胞（例如癌細(xì)胞）的特異 性細(xì)胞毒活性。當(dāng)將通過本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的CTL施用給受試者以在該受試者中誘導(dǎo)針對 癌癥的免疫應(yīng)答時，該受試者優(yōu)選是CD8陽性T細(xì)胞所來源的同一受試者。不過，受試者可 以不同于CD8陽性T細(xì)胞供體，只要該受試者具有與CD8陽性T細(xì)胞供體相同的HLA類型 即可。
[0367] 另外，本發(fā)明提供了一種制造用于誘導(dǎo)CTL的藥物組合物或藥物作用劑的方法或 工藝，其中該方法包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的擔(dān)載體的步驟。
[0368] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)CTL的作用劑或組合物，其中所述作 用劑或組合物包括本發(fā)明的一種或多種肽、一種或多種多核苷酸、或一種或多種APC或外 來體。
[0369] 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的肽、多核苷酸、或APC或外來體在制備 配制為用于誘導(dǎo)CTL的作用劑或組合物中的用途。
[0370] 或者，本發(fā)明還提供本發(fā)明的肽、多核苷酸、或APC或外來體用于在誘導(dǎo)CTL中使 用。
[0371] XI.誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法
[0372] 此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)針對涉及Τ0ΡΚ的疾病的免疫應(yīng)答的方法?？紤]的疾病包 括癌癥，其例子包括但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型 胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0373] 本發(fā)明的方法可包括施用含有任何本發(fā)明肽或編碼它們的多核苷酸的作用劑或 組合物的步驟?；蛘撸景l(fā)明的方法也可以包括施用呈遞任何本發(fā)明肽的外來體或APC的 步驟。關(guān)于詳情參見"IX.藥物作用劑或藥物組合物"項，特別是描述本發(fā)明的藥物組合物 作為疫苗的用途的部分。另外，可用于本發(fā)明誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法的外來體和APC詳細(xì)描 述于上文"V.外來體"、"VI.抗原呈遞細(xì)胞（APC)"、和"X.使用肽、外來體、APC和CTL的方 法"的⑴和⑵部分。
[0374] 本發(fā)明還提供了一種制造用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的藥物組合物或藥物作 用劑的方法或工藝，其中該方法可包括混合或配制本發(fā)明的肽與藥學(xué)可接受的載體的步 驟。
[0375] 或者，本發(fā)明的方法可包括施用本發(fā)明的疫苗或藥物組合物或藥物物質(zhì)的步驟， 所述疫苗或藥物組合物或藥物作用劑包含：
[0376] (a)本發(fā)明的肽；
[0377] (b)處于可表達的形式的編碼如本發(fā)明的此類肽的核酸；
[0378] (c)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的APC ;
[0379] (d)在其表面上呈遞本發(fā)明的肽的外來體；或
[0380] (d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0381] 在本發(fā)明的語境中，過表達Τ0ΡΚ的癌癥可用這些活性組分來治療。所述癌癥的例 子包括但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃癌、NSCLC、 淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。因而，在施用包括上述的活性組分的 疫苗或藥物組合物或藥物作用劑之前，優(yōu)選確認(rèn)要治療的受試者中Τ0ΡΚ表達水平是否提 高了。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于在有需要的患者中治療（過）表達Τ0ΡΚ 的癌癥的方法，該方法包括下述步驟：
[0382] i)測定自具有要治療的癌癥的受試者獲得的生物學(xué)樣品中的Τ0ΡΚ表達水平；
[0383] ii)將Τ0ΡΚ表達水平與正常對照比較；并
[0384] iii)對具有與正常對照相比過表達Τ0ΡΚ的癌癥的受試者施用至少一種選自上文 所述（a)至⑷的成分。
[0385] 或者，本發(fā)明提供包括至少一種選自上文所述（a)至（d)的成分的疫苗或藥物組 合物，用于對具有過表達Τ0ΡΚ的癌癥的受試者施用。換言之，本發(fā)明進一步提供了用于鑒 定要用本發(fā)明Τ0ΡΚ多肽來治療的受試者的方法，所述方法包括測定源自受試者的生物學(xué) 樣品中的Τ0ΡΚ表達水平的步驟，其中該水平與該基因的正常對照水平相比的升高指示該 受試者可能具有可用本發(fā)明Τ0ΡΚ多肽來治療的癌癥。本發(fā)明的治療癌癥的方法將在下面 更加詳細(xì)的加以敘述。
[0386] 任何源自受試者的細(xì)胞或組織均可用于測定Τ0ΡΚ表達水平，只要其包括目標(biāo)的 Τ0ΡΚ轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。合適樣品的例子包括但不僅限于身體組織與體液，例如血液、痰與尿 液。優(yōu)選地，源自受試者的細(xì)胞或組織樣品含有這樣的細(xì)胞群體，該群體包括上皮細(xì)胞，更 優(yōu)選癌性上皮細(xì)胞或源自懷疑為癌性的組織的上皮細(xì)胞。進一步，如果必要，可從所得的身 體組織與體液中純化所述細(xì)胞，然后將其用作源自受試者的樣品。
[0387] 需用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例 如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。
[0388] 根據(jù)本發(fā)明，可以測定在自受試者獲得的生物學(xué)樣品中Τ0ΡΚ的表達水平。表達 水平可在轉(zhuǎn)錄（核酸）產(chǎn)物水平確定，使用本領(lǐng)域已知方法。舉例而言，Τ0ΡΚ的mRNA可通 過雜交方法（例如，Northern雜交）使用探針定量。檢測可在芯片或陣列上實施。對檢測 Τ0ΡΚ的表達水平而言，可優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用Τ0ΡΚ的序列信息制備上述 探針。舉例而言，Τ0ΡΚ的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例 如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達水平可以作為所雜交的標(biāo)記物的強度檢測。
[0389] 此外，Τ0ΡΚ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還可通過基于擴增的檢測方法（例如，RT-PCR)使用引物定 量。此類引物也可基于所述基因的可得序列信息制備。
[0390] 具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下 與Τ0ΡΚ的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語"嚴(yán)格（雜交）條件"是指這樣的條件，在該 條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的， 而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。 一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強度和pH下的熱熔點（Tm)低大約 5攝氏度。Tm是（在限定的離子強度、pH和核酸濃度下）平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列 互補的探針與靶序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm，平衡時50%的探 針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會是這樣的：其中鹽濃度小于大約1. 0M鈉離子，典型地大約 0· 01-1. 0M鈉離子（或其它鹽），ρΗ7· 0-8. 3,溫度對于較短的探針或引物（例如10-50個核 苷酸）是至少大約30攝氏度，用于較長的探針或引物是至少大約60攝氏度。嚴(yán)格條件也 可以通過添加去穩(wěn)定物質(zhì)，例如甲酰胺，來實現(xiàn)。
[0391] 本發(fā)明的探針或引物典型地是基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸典型地包括這樣 的核苷酸序列區(qū)域，其在嚴(yán)格條件下與包括Τ0ΡΚ序列的核酸的至少大約2000, 1000, 500， 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50,或25個連續(xù)有義鏈核苷酸序列，或者包括Τ0ΡΚ序列 的核酸的反義鏈核苷酸序列，或者些序列的天然存在的突變體雜交。尤其是，例如，在優(yōu)選 的實施方案中，可以使用長度為5-50的寡核苷酸作為引物來擴增要檢測的基因。更優(yōu)選 地，可以用特定大小，一般是長度15-30b的寡核苷酸探針或引物來檢測Τ0ΡΚ基因的mRNA 或cDNA。大小范圍可以是至少10個核苷酸，至少12個核苷酸，至少15個核苷酸，至少20 個核苷酸，至少25個核苷酸，至少30個核苷酸，且探針和引物的大小范圍可為5-10個核 苷酸，10-15個核苷酸，15-20個核苷酸，20-25個核苷酸，和25-30個核苷酸。在優(yōu)選的實 施方案中，寡核苷酸探針或引物的長度可以從15-25中選擇。使用此類寡核苷酸探針或引 物檢測基因的測定程序、裝置或試劑是公知的（例如寡核苷酸微陣列或PCR)。在這些測定 中，探針或引物也可以包括標(biāo)簽或接頭序列。此外，可以使用可檢測的標(biāo)記物或待捕捉的親 和配體來修飾探針或引物。或者，在基于雜交的檢測程序中，也可以使用長度為數(shù)百個（例 如約100-200個）堿基至數(shù)千個（例如約1000-2000個）堿基的多核苷酸用于探針（例如 Northern印跡測定或cDNA微陣列分析）。
[0392] 或者，可以檢測翻譯產(chǎn)物以進行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定Τ0ΡΚ蛋白（SEQ ID N0:86)或其免疫學(xué)活性片段的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此 類方法使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何 片段或修飾（例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab'） 2、Fv等）均可用于檢測，只要該片段或經(jīng) 修飾抗體保留對Τ0ΡΚ蛋白的結(jié)合能力即可。本發(fā)明也提供這樣的針對本發(fā)明的肽的抗體 或其片段。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā) 明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。
[0393] 作為另一種基于Τ0ΡΚ的翻譯產(chǎn)物檢測Τ0ΡΚ基因的表達水平的方法，可利用針對 Τ0ΡΚ蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析測量其染色的強度。意即，在這種測量中，強染色表 明所述蛋白質(zhì)存在/水平增加，且同時表明Τ0ΡΚ基因的高表達水平。
[0394] 對于癌細(xì)胞中的靶基因（例如Τ0ΡΚ基因），如果其較之靶基因的對照水平（例如 正常細(xì)胞中的水平）增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍， 超過2. 0倍，超過5. 0倍，超過10倍或者更多，則可以認(rèn)為其在癌細(xì)胞中的表達水平增加 了。
[0395] 對照水平可以與癌細(xì)胞同時確定，使用先前從疾病狀態(tài)（患癌或未患癌）已知的 受試者/受試者們收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得 的正常細(xì)胞可用作正常對照?；蛘?，對照水平可以借助統(tǒng)計方法，根據(jù)通過分析先前測定的 來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的Τ0ΡΚ基因表達水平獲得的結(jié)果加以確定。進一步，對 照水平可以是來自先前測試過的細(xì)胞的表達模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可 以將生物樣品中Τ0ΡΚ基因的表達水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選 地使用從來自與源自受試者的樣品的組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水 平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中Τ0ΡΚ基因表達水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn) 值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如,平均值+/-2S. D.或平均值+/-3S. D.的范 圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。
[0396] 在本發(fā)明的語境中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作"正常對照水 平"。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則會稱作"癌性對照水平"。樣品表達水 平與對照水平間的差異可以相對已知表達水平不會隨著細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照 核酸（例如管家基因）的表達水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例的對照基因包括，但不僅限于，肌 動蛋白、甘油醛-3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Ρ1。
[0397] 當(dāng)Τ0ΡΚ基因的表達水平相比正常表達水平有所提高，或與癌性對照水平相似/等 同，則受試者可診斷為具有要治療的癌癥。
[0398] 本發(fā)明還提供了一種⑴診斷受試者是否疑似具有要治療的癌癥，和/或（ii)選 擇受試者進行癌癥治療的方法，該方法包括下述步驟：
[0399] a)測定Τ0ΡΚ在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的生物學(xué)樣品中的表達水 平；
[0400] b)將Τ0ΡΚ的表達水平與正常對照水平比較；
[0401] c)若Τ0ΡΚ的表達水平與正常對照水平相比升高的話，將受試者診斷為具有要治 療的癌癥；并
[0402] d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥 治療。
[0403] 或者，此類方法可包括下述步驟：
[0404] a)測定Τ0ΡΚ在自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的生物學(xué)樣品中的表達水 平；
[0405] b)將Τ0ΡΚ的表達水平與癌性對照水平比較；
[0406] c)若Τ0ΡΚ的表達水平與癌性對照水平相似或等同的話，將受試者診斷為具有要 治療的癌癥；并
[0407] d)若在步驟c)中受試者被診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇受試者進行癌癥 治療。
[0408] 本發(fā)明還提供了用于診斷或確定患有、或疑似患有、或有風(fēng)險發(fā)生能用本發(fā)明的 Τ0ΡΚ多肽來治療的癌癥的受試者的診斷試劑盒，其亦可用于評價和/或監(jiān)測癌癥免疫療法 的功效或適用性。優(yōu)選地，癌癥包括，但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié) 直腸癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。更特別 地，所述試劑盒優(yōu)選可包含至少一種在源自受試者的細(xì)胞中檢測TOPK基因表達的試劑，所 述試劑可選自下組：
[0409] (a)用于檢測Τ0ΡΚ基因的mRNA的試劑；
[0410] (b)用于檢測Τ0ΡΚ蛋白或其免疫學(xué)活性片段的試劑；和
[0411] (c)用于檢測Τ0ΡΚ蛋白的生物學(xué)活性的試劑。
[0412] 適于檢測Τ0ΡΚ基因 mRNA的試劑的例子可包括特異性結(jié)合或識別TOPK mRNA的 核酸，諸如具有與TOPK mRNA的一部分互補的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對 TOPK mRNA特異性的引物與探針。這類寡核苷酸可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。如果 需要，用于檢測TOPK mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多 于一種檢測TOPK mRNA的試劑。
[0413] 另一方面，適于檢測Τ0ΡΚ蛋白或其免疫學(xué)活性片段的試劑可包括針對Τ0ΡΚ蛋白 或其免疫學(xué)活性片段的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進一步，任何所述抗體 的片段或修飾（例如，嵌合抗體、80?￥、？&13、？(313'） 2、？￥等等）均可用作所述試劑，只要所 述片段或經(jīng)修飾抗體保留與Τ0ΡΚ蛋白或其免疫學(xué)活性片段的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備 此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其 等價物。進一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進行標(biāo)記。 標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及檢測抗體與其靶的結(jié)合的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可 使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種用于檢測Τ0ΡΚ蛋白的試 劑。
[0414] 所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。所述試劑盒還可包含用于結(jié)合針對Τ0ΡΚ 基因的探針或者針對TOPK肽的抗體的固體基質(zhì)和試劑、用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基和容器、陽 性和陰性對照試劑、和用于檢測針對Τ0ΡΚ肽的抗體的第二抗體。舉例而言，從沒有癌癥或 患有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進一步包括 其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾器、針頭、注射器和帶有使 用說明書（例如，書面的、磁帶、CD-ROM等等）的裝箱單。這些試劑之類的可標(biāo)上標(biāo)簽包含 在容器中。合適的容器包括瓶、管狀瓶（vials)和試管。所述容器可用多種材料制造，例如 玻璃或塑料。
[0415] 在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)所述試劑是針對TOPK mRNA的探針時，所述試劑可 固定化于固體基質(zhì)例如多孔條上，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區(qū) 域可包含多個位置，每個都包含核酸（探針）。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位 置?；蛘?，對照位置可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的 固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在后面的位置上量較小。在加入測試樣品之 后，顯示可檢測信號位置的數(shù)目提供了在樣品中存在的TOPK mRNA量的定量指征。所述檢 測位置可設(shè)置成具有任何合適可檢測的形狀，通常是橫跨測試條寬度的條狀或點狀。
[0416] 本發(fā)明所述試劑盒可進一步包括陽性對照樣品或Τ0ΡΚ標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述 陽性對照樣品可通過收集Τ0ΡΚ陽性樣品，隨后測定其Τ0ΡΚ水平來制備。或者，可將純化的 Τ0ΡΚ蛋白或多核苷酸添加到不表達Τ0ΡΚ的細(xì)胞中以形成所述陽性樣品或Τ0ΡΚ標(biāo)準(zhǔn)樣品。 在本發(fā)明中，純化的TOPK可以是重組蛋白。例如，陽性對照樣品的TOPK水平大于截留值。
[0417] 在一個實施方案中，本發(fā)明進一步提供了一種診斷試劑盒，其包括被本發(fā)明抗體 特異性識別的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。
[0418] 本發(fā)明的蛋白的部分肽的例子包括由本發(fā)明蛋白的氨基酸序列中的至少8個、優(yōu) 選15個、和更優(yōu)選20個連續(xù)氨基酸組成的多肽。癌癥可通過使用本發(fā)明的蛋白或肽（多 肽）檢測樣品（例如血液、組織）中的抗體來診斷。上文描述了用于制備本發(fā)明的肽或蛋 白質(zhì)的方法。
[0419] 本發(fā)明用于診斷癌癥的方法可通過如上所述測定抗Τ0ΡΚ抗體量和相應(yīng)對照樣品 中的量之間的差異來進行。若受試者的細(xì)胞或組織含有針對該基因的表達產(chǎn)物（Τ0ΡΚ)的 抗體并且測得的抗Τ0ΡΚ抗體的量大于截留值（與正常對照中的水平相比）的話，則該受試 者懷疑患有癌癥。
[0420] 在另一個實施方案中，本發(fā)明的診斷試劑盒可包括本發(fā)明的肽及與它結(jié)合的HLA 分子。使用抗原性肽和HLA分子檢測抗原特異性CTL的合適方法早已確立（例如Altman JD et al.，Science. 1996, 274 (5284): 94-6)。因此，本發(fā)明肽和HLA分子形成的復(fù)合物可 用于檢測方法來檢測腫瘤抗原特異性CTL，由此能夠較早檢測癌癥的復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。進一 步，它可用于選擇適合包含本發(fā)明肽作為活性組分的藥物的受試者或評估該藥物的治療效 果。
[0421] 特別地，依照已知方法（參見例如 Altman JD et al.，Science. 1996, 274(5284): 94-6)，可制備放射性標(biāo)記的HLA分子和本發(fā)明肽的寡聚物復(fù)合物，諸如四聚體。使用該復(fù) 合物，可通過例如來對源自懷疑患有癌癥的受試者的外周血淋巴細(xì)胞中的抗原-肽特異性 CTL定量來進行診斷。
[0422] 本發(fā)明進一步提供了使用如本文所述的肽表位來評估受試者的免疫學(xué)應(yīng)答的方 法和診斷劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用本文所述的HLA-A24或HLA-A2限制肽作為 試劑來評估或預(yù)測受試者的免疫應(yīng)答。要評估的免疫應(yīng)答是通過在體外或在體內(nèi)使免疫原 接觸免疫活性細(xì)胞來誘導(dǎo)的。在優(yōu)選的實施方案中，用于評估免疫應(yīng)答的免疫活性細(xì)胞可 以選自外周血、外周血淋巴細(xì)胞（PBL)、和外周血單個核細(xì)胞（PBMC)。用于收集或分離此類 免疫活性細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的。在一些實施方案中，任何可導(dǎo)致識別和結(jié)合肽表位 的抗原特異性CTL的生成的作用劑均可用作所述試劑。肽試劑無需用作免疫原。用于此類 分析的測定系統(tǒng)包括相對較新的技術(shù)發(fā)展，諸如四聚體、胞內(nèi)淋巴因子染色和干擾素釋放 測定法、或ELISP0T測定法。在一個優(yōu)選的實施方案中，要與肽試劑接觸的免疫活性細(xì)胞可 以是抗原呈遞細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞。
[0423] 例如，本發(fā)明的肽可用于四聚體染色測定法，評估外周血單個核細(xì)胞在暴露于 腫瘤細(xì)胞抗原或免疫原后抗原特異性CTL的存在。HLA四聚體復(fù)合物可用于直接顯現(xiàn) 抗原特異性 CTL(參見例如 Ogg et al.，Science279:2103-2106, 1998;和 Altman et al，Science174:94-96, 1996)和測定抗原特異性CTL群體在外周血單個核細(xì)胞樣品中的頻 率。使用本發(fā)明肽的四聚體試劑可如下所述來生成。
[0424] 與HLA分子結(jié)合的肽在相應(yīng)HLA重鏈和β 2-微球蛋白存在下重折疊以生成三分 子復(fù)合物。在該復(fù)合物中，重鏈的羧基末端在先前工程化到蛋白質(zhì)中的位點處被生物素化。 然后，將鏈霉親合素添加至復(fù)合物以形成由三分子復(fù)合物和鏈霉親合素組成的四聚體。借 助熒光標(biāo)記的鏈霉親合素，四聚體能用于對抗原特異性細(xì)胞染色。然后可鑒定細(xì)胞，例如通 過流式細(xì)胞術(shù)。此類分析可用于診斷或預(yù)后目的。通過該規(guī)程鑒定的細(xì)胞也可用于治療目 的。
[0425] 本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明肽的用于免疫回憶應(yīng)答的試劑（參見例 如 Bertoni et al，J. Clin. Invest. 100:503-513，1997 和 Penna et al.，J Exp. Med. 174:1565-1570, 1991)。例如，使用特定肽對來自具有要治療的癌癥的個體的患者PBMC 樣品分析抗原特異性CTL的存在。含有單個核細(xì)胞的血液樣品可如下評估：培養(yǎng)PBMC，并 用本發(fā)明的肽刺激該細(xì)胞。適宜培養(yǎng)時段后，可對擴增的細(xì)胞群體進行分析，例如分析CTL 活性。
[0426] 肽還可作為試劑用于評估疫苗的功效?？墒褂美缟衔乃龇椒▉矸治鲎砸?苗接種免疫原的患者獲得的PBMC。測定患者的HLA型，并選擇識別該患者中存在的等 位基因特異性分子的肽表位試劑進行分析。疫苗的免疫原性可通過PBMC樣品中表位特 異性CTL的存在來指示。本發(fā)明的肽還可用于制備抗體，使用本領(lǐng)域公知技術(shù)（參見例 如 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene，NY;和 Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作為試劑 用于診斷或監(jiān)測癌癥。此類抗體可包括識別HLA分子背景中的肽的抗體，即結(jié)合肽-MHC復(fù) 合物的抗體。
[0427] 本發(fā)明的肽和組合物還具有多種其他應(yīng)用，本文中描述了其中一些。例如，本發(fā)明 提供了一種用于診斷或檢測以Τ0ΡΚ免疫原性多肽表達或呈遞為特征的病癥的方法。這些 方法涉及測定Τ0ΡΚ HLA結(jié)合肽、或Τ0ΡΚ HLA結(jié)合肽與I類HLA分子形成的復(fù)合物在生物 學(xué)樣品中的表達。肽或肽和I類HLA分子形成的復(fù)合物的表達可通過用針對肽或復(fù)合物的 結(jié)合配偶測定來測定或檢測。在一個優(yōu)選的實施方案中，針對肽或復(fù)合物的結(jié)合配偶是識 別和特異性結(jié)合所述肽的抗體。Τ0ΡΚ在生物學(xué)樣品諸如腫瘤活檢中的表達也可使用Τ0ΡΚ 引物通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增方案來測試。本文中呈遞了腫瘤表達的一個例子，而且用于Τ0ΡΚ擴 增的例示性條件和引物的進一步公開內(nèi)容可見于W02003/27322。
[0428] 優(yōu)選地，診斷方法涉及使自受試者分離的生物學(xué)樣品接觸對Τ0ΡΚ HLA結(jié)合肽特異 性的作用劑以檢測Τ0ΡΚ HLA結(jié)合肽在生物學(xué)樣品中的存在。如本文中使用的，"接觸"意味 著在適宜條件（例如濃度、溫度、時間、離子強度）下放置生物學(xué)樣品使其足夠接近所述作 用劑，以容許作用劑和生物學(xué)樣品中存在的Τ0ΡΚ HLA結(jié)合肽之間的特異性相互作用。一般 地，作用劑接觸生物學(xué)樣品的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道的可促進生物學(xué)樣品中分子 與其關(guān)聯(lián)物（例如蛋白質(zhì)與其受體關(guān)聯(lián)物、抗體與其蛋白質(zhì)抗原關(guān)聯(lián)物、核酸與其互補序 列關(guān)聯(lián)物）之間的特異性相互作用的條件。用于促進分子與其關(guān)聯(lián)物之間的特異性相互作 用的最優(yōu)條件記載于授權(quán)給Low等人的美國專利No. 5, 108, 921。
[0429] 本發(fā)明的診斷方法可以在體內(nèi)和/或在體外實施。因而，生物學(xué)樣品在本發(fā)明中 可位于體內(nèi)或體外。例如，生物學(xué)樣品可以是體內(nèi)組織，而且可使用對Τ0ΡΚ免疫原性多肽 特異性的作用劑來檢測此類分子在組織中的存在?；蛘?，可在體外收集或分離生物學(xué)樣品 (例如血液樣品、腫瘤活檢、組織提取物）。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，生物學(xué)樣品可以 是含有細(xì)胞的樣品，更優(yōu)選自要診斷或治療的受試者收集的含有腫瘤細(xì)胞的樣品。
[0430] 或者，診斷可使用容許通過對熒光素標(biāo)記的HLA多聚體復(fù)合物染色而直接定 量抗原特異性T細(xì)胞的方法來進行（例如Altman, J.D.et al.，1996, Science 274:94; Altman, J. D. et al.，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:10330)。還提供 了對胞內(nèi)淋巴 因子的染色和干擾素釋放測定法或ELISP0T測定法。四聚體染色、胞內(nèi)淋巴因子染 色和ELISP0T測定法都表現(xiàn)出比更常規(guī)的測定法靈敏至少10倍（Murali-Krishna，K. et al. , 1998, Immunity8:177 ；Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186:859 ；Dunbar, P. R. et al. , 1998, Curr. Biol. 8:413 ;)。也可使用五聚體（例如 US2004-209295A)、Dextramers (例 如 W002/072631)、和 Str印tamers (例如 Nature medicine6. 631-637 (2002))。
[0431] 例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于診斷或評價被施用了至少一種本 發(fā)明的Τ0ΡΚ肽的受試者的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括下述步驟：
[0432] (a)在適合誘導(dǎo)對免疫原特異性的CTL的條件下使免疫原與具免疫活性細(xì)胞接 觸；
[0433] (b)檢測或測定步驟（a)中誘導(dǎo)的CTL的誘導(dǎo)水平；和
[0434] (c)將所述受試者的免疫應(yīng)答與所述CTL誘導(dǎo)水平相關(guān)聯(lián)。
[0435] 在本發(fā)明的語境中，免疫原優(yōu)選包括下述中至少一種：（a)選自SEQ ID N0:2-40 和42-84中的氨基酸序列的Τ0ΡΚ肽，具有所述氨基酸序列的肽，和具有所述氨基酸序列中 已經(jīng)過1個、2個或更多個氨基酸取代而修飾的氨基酸序列的肽。同時，適合誘導(dǎo)免疫原特 異性CTL的條件是本領(lǐng)域公知的。例如，可以在體外在免疫原存在下培養(yǎng)具免疫活性細(xì)胞 來誘導(dǎo)免疫原特異性CTL。為了誘導(dǎo)免疫原特異性CTL，可以將任何刺激因子添加至細(xì)胞培 養(yǎng)物。例如，IL-2是用于CTL誘導(dǎo)的優(yōu)選的刺激因子。
[0436] 在一些實施方案中，對要用肽癌癥療法治療的受試者的免疫應(yīng)答的監(jiān)測或評價步 驟可以在治療之前、之中和/或之后進行。一般而言，在癌癥治療規(guī)程中，反復(fù)地對要治療 的受試者施用免疫原性肽。例如，可以每周施用免疫原性肽3-10周。相應(yīng)地，可以在整個 癌癥治療程序中評價或監(jiān)測受試者的免疫應(yīng)答。或者，評價或監(jiān)測免疫應(yīng)答的步驟可以在 治療程序完成時進行。
[0437] 根據(jù)本發(fā)明，免疫原特異性CTL的誘導(dǎo)相對于對照增強，表明要評價或診斷的受 試者對已施用的免疫原免疫應(yīng)答。用于評價免疫應(yīng)答的合適的對照可包括，例如，具免疫活 性細(xì)胞未接觸肽時的CTL誘導(dǎo)水平，或者與具有Τ0ΡΚ肽之外的氨基酸序列（例如隨機氨基 酸序列）的對照肽接觸時的CTL誘導(dǎo)水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，以序列特異性的方 式評價受試者的免疫應(yīng)答，方法是在施用給受試者的各種免疫原之間比較免疫應(yīng)答。具體 地，即使當(dāng)數(shù)種Τ0ΡΚ肽的混合物被施用給受試者時，免疫應(yīng)答也會依賴于肽而改變。在這 種情況下，通過比較每種肽的免疫應(yīng)答，可以鑒定出受試者對其顯示更高應(yīng)答的肽。
[0438] XII.抗體
[0439] 本發(fā)明進一步提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。優(yōu)選的抗體特異性結(jié)合本發(fā)明的 肽且不會結(jié)合（或會微弱結(jié)合）其他肽?；蛘?，抗體能結(jié)合本發(fā)明的肽及其同源物。針對 本發(fā)明肽的抗體可用于癌癥診斷和預(yù)后測定法、及成像方法學(xué)。類似地，此類抗體可用于其 它癌癥的治療、診斷、和/或預(yù)后，只要癌癥患者中也表達或過表達Τ0ΡΚ。此外，胞內(nèi)表達的 抗體（例如單鏈抗體）在治療上可用于治療涉及Τ0ΡΚ表達的癌癥，這樣的癌癥的例子包括 但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、 骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0440] 本發(fā)明還提供了多種免疫學(xué)測定法，用于檢測和/或定量Τ0ΡΚ蛋白（SEQ ID N0:86)或其片段，包括具有選自SEQ ID N0:2-40和42-84的氨基酸序列的多肽。此類測定 法可根據(jù)需要包括一種或多種能夠識別和結(jié)合Τ0ΡΚ蛋白或其片段的抗Τ0ΡΚ抗體。在本發(fā) 明的語境中，與Τ0ΡΚ多肽結(jié)合的抗Τ0ΡΚ抗體優(yōu)選識別具有選自SEQ ID N0:2-40和42-84 的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選不包括其他肽?？贵w的結(jié)合特異性可用抑制測試來確認(rèn)。艮P， 當(dāng)要分析的抗體與全長Τ0ΡΚ多肽之間的結(jié)合在任何具有選自SEQ ID N0:2-40和42-84的 氨基酸序列的片段多肽存在下受到抑制時，視為該抗體特異性結(jié)合該片段。在本發(fā)明的語 境中，此類免疫學(xué)測定法以本領(lǐng)域公知的各種免疫學(xué)測定形式實施，包括但不限于各種類 型的放射免疫測定法、免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光測定法 (ELIFA)、等等。
[0441] 本發(fā)明的相關(guān)免疫學(xué)的但非抗體的測定法也包括T細(xì)胞免疫原性測定法（抑制性 的或刺激性的）以及MHC結(jié)合測定法。另外，本發(fā)明考慮能夠檢測表達Τ0ΡΚ的癌癥的免疫 學(xué)成像方法，其例子包括但不限于使用經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明抗體的放射閃爍成像方法。此類測 定法在臨床上可用于表達Τ0ΡΚ的癌癥的檢測、監(jiān)測、和預(yù)后，表達Τ0ΡΚ的癌癥的例子包括 但不限于AML、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、膽管細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、彌漫型胃癌、NSCLC、淋巴瘤、 骨肉瘤、前列腺癌、腎癌、SCLC和軟組織腫瘤。
[0442] 本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以以任何形式使用， 例如單克隆或多克隆抗體，而且還可包括通過用本發(fā)明的肽免疫動物（諸如家兔）而獲得 的抗血清、所有種類的多克隆和單克隆抗體、及通過遺傳重組生成的人抗體和人源化抗體。
[0443] 本發(fā)明的作為抗原用于獲得抗體的肽可來源于任何動物物種，但優(yōu)選來源于哺乳 動物，諸如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選來源于人。來源于人的肽可以由本文所公開的核苷酸或 氨基酸序列獲得。
[0444] 根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)的完整和部分肽可以用作免疫抗原。合適的部分肽的例子包 括，例如，本發(fā)明肽的氨基（N)末端或羧基（C)末端片段。
[0445] 在本文中，抗體定義為能與Τ0ΡΚ肽的全長或片段起反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的 實施方案中，本發(fā)明的抗體可識別具有選自SEQ ID NO :2-40和42-84的氨基酸序列的Τ0ΡΚ 的片段肽。用于合成寡肽的方法是本領(lǐng)域公知的。合成后，可任選在作為免疫原使用之前 純化肽。在本發(fā)明的語境中，寡肽（例如9或10聚物）可與載體綴合或連接以增強免疫原 性。匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白（KLH)作為擔(dān)載體是公知的。用于綴合KLH和肽的方法也是本領(lǐng)域 公知的。
[0446] 或者，可以將編碼本發(fā)明肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然后用該載體 轉(zhuǎn)化本文所述宿主細(xì)胞。可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞外部或內(nèi)部回收所需肽或其片 段，然后可將其用作抗原?；蛘?，表達肽的完整細(xì)胞或其溶胞物或者化學(xué)合成的肽也可用作 抗原。
[0447] 可以用抗原免疫任何哺乳動物，但優(yōu)選考慮與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的相容 性。通常，可使用卩齒齒目（Rodentia)、兔形目（Lagomorpha)或靈長目（Primate)的動物。 嚙齒科動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形科動物包括例如家兔。靈長科動物包括例如狹 鼻猿（Catarrhini)(東半球猴（old world monkey))諸如食蟹猴（Macaca fascicularis)、 恒河猴（rhesus monkey)、狒狒（sacred baboon)和黑猩猩（chimpanzee)。
[0448] 用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳 動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體的說，可以在適量的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)、生理鹽水等中稀釋和 懸浮抗原。如果需要，可將抗原懸浮液與適量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑諸如弗氏（Freund)完全佐劑混 合，制成乳狀液，然后施用于哺乳動物。優(yōu)選的是，其后每4-21天施用數(shù)次與適量弗氏不完 全佐劑混合的抗原。還可使用適宜的擔(dān)載體進行免疫。如上所述進行免疫后，可通過標(biāo)準(zhǔn) 方法檢驗血清中所需抗體的量的增加。
[0449] 可以如下制備針對本發(fā)明肽的多克隆抗體：從經(jīng)過免疫的哺乳動物（該哺乳動物 經(jīng)檢驗其血清中所需抗體增加）收集血液，并通過任何常規(guī)方法從血液中分離血清。多克 隆抗體可包括含有多克隆抗體的血清，以及可以從所述血清中分離的、含有該多克隆抗體 的級分?？梢允褂美缗悸?lián)有本發(fā)明肽的親和柱從僅識別本發(fā)明肽的級分中制備免疫球蛋 白G或M，并進一步使用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
[0450] 為了制備用于本發(fā)明語境下的單克隆抗體，從經(jīng)過抗原免疫并如上所述檢查出血 清中所需抗體水平升高的哺乳動物收集免疫細(xì)胞，并進行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫 細(xì)胞可優(yōu)選獲自脾。其它要與上述免疫細(xì)胞融合的優(yōu)選親本細(xì)胞包括例如哺乳動物的骨髓 瘤細(xì)胞，更優(yōu)選具有為了用藥物選擇融合細(xì)胞而獲得的特性的骨髓瘤細(xì)胞。
[0451] 可根據(jù)已知的方法，例如 Milstein 等（Galfre 和 Milstein, Methods Enzym〇173:3-46 (1981))的方法，將上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進行融合。
[0452] 對于由細(xì)胞融合得到的雜交瘤，可在標(biāo)準(zhǔn)選擇培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基（含次黃嘌 呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基）中培養(yǎng)以進行選擇。通常，細(xì)胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基中連續(xù)進 行數(shù)天至數(shù)周，培養(yǎng)的時間足以使除了所需雜交瘤之外的所有其它細(xì)胞（非融合的細(xì)胞） 死亡。然后，可進行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋（standard limiting dilution)來篩選和克隆生成所需 抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0453] 除了上述用抗原免疫非人動物來制備雜交瘤的方法外，還可以在體外用肽、表達 肽的細(xì)胞或其溶胞物免疫人淋巴細(xì)胞，諸如那些感染了 EB病毒的人淋巴細(xì)胞。然后，可 以使經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細(xì)胞諸如U266融合，以產(chǎn) 生期望的生成能夠與所述肽結(jié)合的人抗體的雜交瘤（已公開但未審查的日本專利申請 No. Sho63-17688)〇
[0454] 隨后可以將所得雜交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的單克隆抗體可通過 例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明肽的親和柱進行 純化。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本發(fā)明的肽，還可以用作本發(fā)明肽的激動劑和 拮抗劑的候選物。
[0455] 或者，可以通過癌基因使生成抗體的免疫細(xì)胞（諸如經(jīng)過免疫的淋巴細(xì)胞）永生 化，并用于制備單克隆抗體。
[0456] 如此獲得的單克隆抗體也可以使用遺傳工程技術(shù)來重組制備（參見例 如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由 MacMillan Publishers LTD在英國出版（1990))。例如，可以從生成抗體的免疫細(xì)胞諸如雜交瘤或經(jīng) 免疫淋巴細(xì)胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以制備重組 抗體。本發(fā)明還提供如上所述制備的重組抗體。
[0457] 此外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)過修飾的抗體，只要它結(jié)合一種或多 種本發(fā)明的肽。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab'）2、Fv或?qū)碜驭ф満蚅鏈的Fv片 段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv) (Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA85:5879-83 (1988))。更具體的說，可以通過用酶諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理 抗體來生成抗體片段?；蛘撸梢詷?gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，并在 合適的宿主細(xì)胞中表達（參見例如Co et al.，J Immunoll52:2968_76(1994) ;Better and Horwitz, Methods Enzymol178:476-96(1989) ；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol178:497-515(1989) ；Lamoyi,Methods Enzymo1121:652-63(1986)； Rousseaux et al., Methods Enzymol121:663-9(1986) ；Bird and Walker, Trends Biotechnol9:132-7(1991))〇
[0458] 抗體可以通過與多種分子諸如聚乙二醇（PEG)綴合來修飾。本發(fā)明提供了經(jīng)過這 樣修飾的抗體?？赏ㄟ^化學(xué)修飾抗體來獲得經(jīng)過修飾的抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī) 的。
[0459] 或者，可以以源自非人抗體的可變區(qū)與源自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體 或者包含源自非人抗體的互補決定區(qū)（CDR)、源自人抗體的框架區(qū)（FR)及恒定區(qū)的人 源化抗體的形式來獲得本發(fā)明的抗體。此類抗體可依照已知技術(shù)來制備。人源化可通 過用嚙齒類的CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進行（參見例如Verhoeyen et al.，Science239:1534-1536 (1988))。因而，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中人可變域的 一小部分已被來自非人物種的相應(yīng)序列所取代。
[0460] 也可以使用完全的人抗體，這樣的抗體除了人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變 區(qū)。此類抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來制備。例如，體外方法包括使用展示在噬菌 體上的人抗體片段的重組文庫（例如Hoogenboom&Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991))。 類似的，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物，例如內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或 完全滅活的小鼠，來生成人抗體。該方法記載于例如美國專利Nos. 6, 150, 584 ;5, 545, 807 ; 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 661，016。
[0461] 可以將如上獲得的抗體純化至同質(zhì)。例如，可依照用于一般蛋白質(zhì)的分離和 純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當(dāng)選擇和組合使用柱層析諸如親 和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦來分出和分離抗 體（Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可 使用的蛋白 A 柱包括例如 Hyper D、P0R0S 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。
[0462] 除親和層析外的合適層析技術(shù)的例子包括例如離子交換層析、疏水層析、 凝膠過濾、反相層析、吸附層析、等等（Strategies for Protein Purification和 Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))?？梢酝ㄟ^液相層析來進行層析規(guī)程，諸如HPLC 和 FPLC。
[0463] 例如，可使用吸光度測量、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)、酶免疫測定法（EIA)、放 射免疫測定法（RIA)和/或免疫熒光來測量本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合活性。在ELISA中，將 本發(fā)明的抗體固定化在板上，將本發(fā)明的肽施加到該板上，再施加含有所需抗體的樣品，諸 如生成抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體。然后施加用酶（諸如堿性磷酸酶）標(biāo)記 的、識別第一抗體的第二抗體，并將板溫育。接著，在洗滌后，向板中加入酶底物，諸如磷酸 對硝基苯酯，并測量吸光度以評估樣品的抗原結(jié)合活性?？梢允褂秒牡钠危T如c-末端 或N-末端片段作為抗原來評估抗體的結(jié)合活性?？梢允褂肂IAcore (Pharmacia)來評估本 發(fā)明抗體的活性。
[0464] 上述方法允許通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明肽的樣品，并檢測或測 量由抗體與肽形成的免疫復(fù)合物，來檢測或測量本發(fā)明的肽。
[0465] 因為依照本發(fā)明的肽檢測或測量方法可特異性的檢測或測量肽，所以該方法可用 于使用肽的各種實驗。
[0466] XII.載體和宿豐細(xì)朐
[0467] 本發(fā)明還提供了導(dǎo)入有編碼本發(fā)明肽的核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的載體 可用于在宿主細(xì)胞中充當(dāng)本發(fā)明的核苷酸、尤其是DNA的運載體，用于表達本發(fā)明的肽，或 者用于施用本發(fā)明的核苷酸以用于基因療法。
[0468] 當(dāng)宿主細(xì)胞選用大腸桿菌且在大腸桿菌（例如JM109、DH5 α、HB101或XLlBlue) 中大量擴增和生成載體時，載體應(yīng)具有適合于在大腸桿菌中擴增的"（復(fù)制）起點"和適合 用于選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)志基因（例如通過藥物諸如氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那 霉素、氣霉素等進行選擇的藥物抗性基因）。例如，可以使用M13系列載體、pUC系列載體、 pBR322、pBluescript、pCR_Script 等。另外，與上述載體一樣，pGEM_T、pDIRECT 和 pT7 也可 以用于亞克隆和提取cDNA。當(dāng)使用載體來生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，表達載體是有用的。例 如，要在大腸桿菌中表達的表達載體應(yīng)具備上述在大腸桿菌中擴增的特征。當(dāng)使用大腸桿 菌諸如JM109、DH5a、HB101或XLlBlue作為宿主細(xì)胞時，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中高效 表達所需基因的啟動子，例如lacZ啟動子（Ward et al.，Nature341:544-6(1989) ;FASEB J6:2422-7 (1992))、araB 啟動子（Better et al.，Science240:1041-3 (1988))、T7 啟動子 等。在這方面，可以使用例如 pGEX_5X_l (Pharmacia)、"QIAexpress 系統(tǒng)"（Qiagen)、pEGFP 和pET(在這種情況中，宿主優(yōu)選為表達T7RNA聚合酶的BL21)來取代上述載體。另外，載 體還可以包含用于肽分泌的信號序列。指導(dǎo)肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的例示性信號序列有 pelB信號序列（Lei et al.，J Bacteriol 169:4379 (1987))。用于將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞 的手段包括例如氯化鈣法和電穿孔法。
[0469] 除了大腸桿菌夕卜，還可以使用例如源自哺乳動物的表達載體（例如 pcDNA3(Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Resl8 (17):5322 (1990))、pEF、 pCDM8)、源自昆蟲細(xì)胞的表達載體（例如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)"（GIBCO BRL)、 pBacPAK8)、源自植物的表達載體（例如pMHl、pMH2)、源自動物病毒的表達載體（例如 pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達載體（例如pZIpneo)、源自酵母的表達載體 (例如"畢赤酵母表達試劑盒"（Invitrogen)、pNVll、SP-Q01)及源自枯草芽孢桿菌的表達 載體（例如pPL608、pKTH50)來生成本發(fā)明的多肽。
[0470] 為了在動物細(xì)胞諸如CH0、C0S或NIH3T3細(xì)胞中表達載體，載體應(yīng)具有在所述細(xì)胞 中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子（Mulligan et al.，Nature277:108(1979))、 MMLV-LTR 啟動子、EFla 啟動子（Mizushima et al·，Nucleic Acids Resl8:5322 (1990))、 CMV啟動子、等等，及優(yōu)選用于選擇轉(zhuǎn)化子的標(biāo)志基因（例如通過藥物（例如新霉素、 G418)進行選擇的藥物抗性基因）。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM、pDR2、 pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 pOP13。
[0471] 下面援引實施例來對本發(fā)明進行更詳細(xì)的說明。但是，雖然下面的材料、方法和實 施例可以協(xié)助本領(lǐng)域技術(shù)人員制造和使用本發(fā)明的特定實施方案，但它們僅意在例示本發(fā) 明的方面而絕不限制本發(fā)明的范圍。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，與本文中描述的那些 類似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實施或測試。 實施例
[0472] 材料和方法
[0473] 細(xì)朐系
[0474] HLA_A*2402陽性B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系TISI購自IHWG Cell and Gene Bank (Seattle WA)。HLA-A*0201陽性B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系T2和非洲綠猴腎細(xì)胞系C0S7 購自ATCC。
[0475] 源自Τ0ΡΚ的狀的候詵者詵擇
[0476] 使用"NetMHC3. 0"結(jié)合預(yù)測服務(wù)器（http://www. cbs. dtu. dk/services/ NetMHC/) (Buus et al.,Tissue Antigens.2003Nov,62 (5):378-84 ；Nielsen et al., Protein Sci.2003May,12 (5):1007-17, Bioinformatics. 2004Junl2:20(9):1388-97) 預(yù)測了 衍生自 T0PK(GenBank Accession No. NM_018492;例如 SEQ ID No :85)的 結(jié)合HLA-A*2402分子和/或HLA-A*0201的9聚體和10聚體肽。這些肽由 Biosynthesis (Lewisville, Texas)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成，并通過反相高效液相色譜 (HPLC)純化。分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜分析來確定肽的純度（>90% )和身份。將肽以 20mg/ml溶解在二甲基亞砜中并保存于-80°C。
[0477] 體外CTL誘導(dǎo)
[0478] 使用單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞（DC)作為抗原呈遞細(xì)胞來誘導(dǎo)針對呈遞在人 白細(xì)胞抗原（HLA)上的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)應(yīng)答。如他處所述（Nakahara S et al.,Cancer Res2003Jull5,63(14):4112-8)體外制備 DC。具體地說，對于用 Ficoll-Plaque (Pharmacia)溶液從正常志愿者（HLA_A*2402 陽性或 HLA_A*0201 陽性）分 離的外周血單個核細(xì)胞，通過粘附塑料組織培養(yǎng)盤（Becton Dickinson)加以分離，以將它 們作為單核細(xì)胞級分加以富集。將富集了單核細(xì)胞的群體在含2%熱滅活的自體血清（AS) 的AIM-V培養(yǎng)基（Invitrogen)中，在1000U/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（R&D System)和1000U/ml白介素（IL)-4(R&D System)的存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因 子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合 成肽于37°C沖激3小時。所生成的細(xì)胞表觀上在它們的細(xì)胞表面上表達DC相關(guān)分子，諸如 ⑶80、⑶83、⑶86和HLA II類（數(shù)據(jù)未顯示）。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用X輻照（20Gy) 滅活，并以1:20比例與用⑶8陽性分離試劑盒（Dynal)通過正選擇獲得的自體⑶8+T細(xì)胞 混合。在48孔板（Corning)中設(shè)立這些培養(yǎng)物；每個孔在0. 5ml AM-V/2% AS培養(yǎng)基中 含有 1. 5xl04 個經(jīng)肽沖激的 DC、3xl05 個 CD8+T 細(xì)胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天 后，給這些培養(yǎng)物補充IL-2(CHIR0N)至終濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將這些T細(xì) 胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進一步刺激。DC每次通過與上文所述相同的方式來制備。在第 21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的TISI或T2細(xì)胞的CTL(Tanaka H et al.，Br J Cancer2001Jan5, 84(1) :94-9 ；Umano Y et al. , Br J Cancer2001Apr20, 84(8):1052-7 ； Uchida N et al.,Clin Cancer Res2004Decl5, 10(24):8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci2006May, 97(5) :411-9 ;Watanabe T et al·，Cancer Sci2005Aug, 96 (8):498-506)。
[0479] CTL擴增規(guī)稈
[0480] 使用與 Riddell 等人（Walter EA et al.，N Engl J Medl9950ctl9, 333(16) :1038-44 ；Riddell SR et al. , Nat Medl996Feb, 2(2):216-23) 記載的方法相似的方法在培養(yǎng)中擴增CTL。將總共5xl04個CTL在25ml AM-V/5%AS 培養(yǎng)基中懸浮，其中有在40ng/ml抗CD3單克隆抗體（Pharmingen)存在下經(jīng)絲裂霉 素 C滅活的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系。啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng)物補加新鮮的含有30IU/ml IL-2的 AM-V/5 % AS 培養(yǎng)基（Tanaka H et al.，Br J Cancer2001Jan5, 84 (1):94-9 ;Umano Y et al.,Br J Cancer2001Apr20, 84(8):1052-7 ；Uchida N et al.,Clin Cancer Res2004Decl5, 10(24):8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci2006May, 97(5):411-9 ； Watanabe T et al·, Cancer Sci2005Aug, 96(8):498-506)。
[0481] CTL克降的律立
[0482] 在96圓底微量滴定板（Nalge Nunc International)中進行稀釋以獲得0· 3、1和 3個CTL/孔。在總共150微升/孔的含5% AS的AIM-V培養(yǎng)基中，將CTL與lxlO4個細(xì)胞 /孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體，和125U/ml的IL-2-起培 養(yǎng)。10天后向培養(yǎng)基中加入50微升/孔的IL-2以達到終濃度125U/ml的IL-2。在第14 天測試CTL活性，并使用如上所述的相同方法擴增CTL克?。║chida N et al.，Clin Cancer Res2004, 10(24) :8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci2006, 97(5) :411-9 ；ffatanabe T et al·，Cancer Sci2005, 96 (8):498-506)。
[0483] 特異件CTL活件
[0484] 為了檢查特異性CTL活性，實施了干擾素（IFN)- γ酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT)測定 法和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)。制備經(jīng)肽沖激的TISI(lxl0 4/孔）作為刺激細(xì) 胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞、CTL細(xì)胞和CTL克隆作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實施 IFN- γ ELISP0T 測定法和 IFN- γ ELISA 測定法。
[0485] 強迫表汰靶某閔和/或HLA-A24或HLA-A2的細(xì)朐的律立
[0486] 通過PCR來擴增編碼靶基因可讀框或HLA-A*2402或HLA-A*0201的cDNA。將PCR 擴增產(chǎn)物克隆入表達載體。使用Lip〇fectamine2000(Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C0S7 (靶基因陰性、HLA-A*0201陰性、和HLA-A*2402陰性的細(xì)胞系）。自轉(zhuǎn) 染起2天后，用Versene (Invitrogen)收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作CTL活性測定法的祀細(xì)胞 (5X104個細(xì)胞/孔）。
[0487] CTL的識別內(nèi)源表汰Τ0ΡΚ和HLA-A*2402或HLA-A*0201的靶細(xì)朐系的能力
[0488] 考察了 CTL克隆是否具有識別內(nèi)源表達Τ0ΡΚ和HLA-A*2402或HLA-A*0201的 靶細(xì)胞系的能力。將已建立的CTL克隆與靶細(xì)胞系（5X10 4/孔）一起之后兩夜一天（two overnight)。溫育之后，通過ELISA測量培養(yǎng)基中的IFN-γ。IFN-γ ELISA根據(jù)生產(chǎn)商的 程序進行。
[0489] 結(jié)果
[0490] 癌癥中升高的Τ0ΡΚ表汰
[0491] 利用cDNA微陣列從不同癌癥中獲得了廣泛的基因表達譜數(shù)據(jù)，顯示 T0PK(GenBank Accession Ν〇·ΝΜ_018492 ;例如 SEQ ID No:85)表達升高。與相應(yīng)的正常組 織相比，Τ0ΡΚ表達在15例AML中的1例，18例膀胱癌中的15例，40例乳腺癌中的36例，6 例宮頸癌中的2例，6例膽管細(xì)胞癌中的6例，6例結(jié)直腸癌中的2例，1例彌漫型胃癌中的 1例,5例NSCLC中的5例，2例淋巴瘤中的1例，11例骨肉瘤中的7例，19例前列腺癌中的 12例，12例腎癌中的3例，14例SCLCs中的14例，和29例軟組織腫瘤中的15例中有效升 高（表1)。
[0492] 表 1
[0493] 與正常相應(yīng)組織相比在癌組織中觀察到Τ0ΡΚ上調(diào)的病例的比例

【權(quán)利要求】
1. 一種分離的肽，其選自下面的⑴和（ii): (i) 下述（a)或（b)的分離的肽： (a) 分離的肽，其包含選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列； (b) 分離的肽，其包含選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列，所述序列中取代、 插入、缺失和/或添加了 1個、2個或數(shù)個氨基酸，其中所述肽具有CTL誘導(dǎo)能力， (ii) 下述（c)或（d)的分離的肽： (c) 分離的肽，其包含選自 SEQ ID 勵:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72和 76的氨基酸序列； (d) 分離的肽，其包含選自 SEQ ID 勵:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72和 76的氨基酸序列，所述序列中取代、插入、缺失和/或添加了 1個、2個或數(shù)個氨基酸，其中 所述肽具有CTL誘導(dǎo)能力。
2. 權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽具有下述特征之一或二者： (a) 選自SEQ ID NO: 2、3、6、27和28的氨基酸序列的自N端起的第二個氨基酸被取代 為選自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸的氨基酸；和 (b) 選自SEQ ID N0:2、3、6、27和28的氨基酸序列的C末端氨基酸被取代為選自苯丙 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。
3. 權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽具有下述特征之一或二者： (a) 選自 SEQ ID 吣:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72和76的氨基酸序列 的自N端起的第二個氨基酸被取代為選自亮氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；和 (b) 選自 SEQ ID 吣:42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72和76的氨基酸序列 的C末端氨基酸被取代為選自纈氨酸和亮氨酸的氨基酸。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項的分離的肽，其中所述肽具有結(jié)合HLA抗原的能力。
5. 權(quán)利要求4的分離的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項的分離的肽，其中所述肽是九肽或十肽。
7. 分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-6中任一項的分離的肽。
8. -種用于誘導(dǎo)CTL的組合物，其中所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-6中任一 項的分離的肽，或一種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸。
9. 一種藥物組合物，其包含： (a) -種或多種權(quán)利要求1-6中任一項的肽， (b) -種或多種權(quán)利要求7的多核苷酸， (c) 一種或多種在其表面上呈遞有權(quán)利要求1-6中任一項的肽與HLA抗原的復(fù)合物的 APC ； (d) -種或多種在其表面上呈遞有權(quán)利要求1-6中任一項的肽與HLA抗原的復(fù)合物的 外來體；或 (e) -種或多種能夠識別在其表面上呈遞有權(quán)利要求1-6中任一項的肽與HLA抗原的 復(fù)合物的細(xì)胞的CTL， 及與之組合的可藥用的載體， 其中所述藥物組合物配制為用于治療和/或預(yù)防癌癥，防止其手術(shù)后復(fù)發(fā)，和/或誘導(dǎo) 針對癌癥的免疫應(yīng)答。
10. 權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述藥物組合物配制為供施用于HLA抗原為 HLA-A24或A2的受試者。
11. 一種用于誘導(dǎo)具有CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞（APC)的方法，該方法包括選自下 組的步驟： (a) 在體外、離體或在體內(nèi)使APC與權(quán)利要求1-6中任一項的肽接觸，和 (b) 將編碼權(quán)利要求1-6中任一項的肽的多核苷酸導(dǎo)入APC。
12. -種誘導(dǎo)CTL的方法，該方法包括選自下組的步驟： (a) 將CD8陽性T細(xì)胞與在表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-6中任一項的肽的復(fù)合 物的APC共培養(yǎng)； (b) 將CD8陽性T細(xì)胞與在表面上呈遞HLA抗原與權(quán)利要求1-6中任一項的肽的復(fù)合 物的外來體共培養(yǎng)；和 (c) 將包含編碼結(jié)合權(quán)利要求1-6中任一項的肽的T細(xì)胞受體（TCR)亞單位多肽的多 核苷酸導(dǎo)入CD8陽性T細(xì)胞，其中由所述TCR亞單位多肽形成的TCR能夠結(jié)合細(xì)胞表面上 的HLA抗原與權(quán)利要求1-6中任一項的肽的復(fù)合物。
13. -種分離的APC，所述APC在其表面上呈遞有HLA抗原與權(quán)利要求1-6中任一項的 肽的復(fù)合物。
14. 權(quán)利要求13的APC，其是通過權(quán)利要求11的方法誘導(dǎo)的。
15. -種分離的CTL，其靶向權(quán)利要求1-6中任一項的肽。
16. 權(quán)利要求15的CTL，其是通過權(quán)利要求12的方法誘導(dǎo)的。
17. -種在受試者中誘導(dǎo)針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對受試者施用包 含權(quán)利要求1-6中任一項的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼所述肽或所述片段的多核苷酸 的組合物的步驟。
18. 針對權(quán)利要求1-6中任一項的肽的抗體或其免疫學(xué)活性片段。
19. 一種載體，其包含編碼權(quán)利要求1-6中任一項的肽的核苷酸序列。
20. 用權(quán)利要求19的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過的宿主細(xì)胞。
21. -種診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求1-6中任一項的肽、權(quán)利要求7的多核苷酸、或權(quán) 利要求18的抗體。
22. -種用于篩選具有誘導(dǎo)CTL的能力的肽的方法，所述CTL具有針對呈遞有衍生自 TOPK的片段的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒活性，其中所述方法包括如下步驟： (i) 提供由對原始氨基酸序列通過取代、缺失、插入和/或添加一個、兩個或數(shù)個氨基 酸殘基而修飾得到的氨基酸序列組成的候選序列，其中所述原始氨基酸序列選自SEQ ID N0:2、3、6、27、28、42、45、47、50、51、53、54、62、63、64、66、71、72 和 76， (ii) 選擇與衍生自除TOPK之外的任何已知人基因產(chǎn)物的肽均無顯著實質(zhì)同源性的候 選序列； (iii) 使由步驟（ii)中選擇的候選序列組成的肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸； (iv) 使步驟（c)的抗原呈遞細(xì)胞與CD8陽性T細(xì)胞接觸；和 (v) 鑒定其CTL誘導(dǎo)能力相同于或高于由原始氨基酸序列組成的肽的肽。
【文檔編號】A61K38/00GK104066746SQ201280065049
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】中村佑輔, 角田卓也, 大澤龍司, 吉村祥子, 渡邊朝久, 中山岳 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司