專利名稱：用于制備基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法
用于制備基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法關(guān)于序列表本申請包括計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。通過述及將該計(jì)算機(jī)可讀形式收入本文。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于制備基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的酶促方法及此類水解產(chǎn)物的用途，例如在嬰兒配方組合物中。
背景技術(shù)：
已經(jīng)開發(fā)了嬰兒配方，其容許取代母乳喂養(yǎng)嬰兒。此類嬰兒配方應(yīng)當(dāng)完全滿足嬰兒的營養(yǎng)要求，直到引入適宜的補(bǔ)充喂食。另外，味道是重要的，因?yàn)橹辽偌议L更喜歡沒有苦味的嬰兒配方。代替普通牛奶，包含水解的乳蛋白質(zhì)(例如部分水解的乳清蛋白質(zhì)或廣泛水解的酪蛋白)的嬰兒配方常常用作此類配方，變應(yīng)原性較低且仍具有可接受的味道。文獻(xiàn)中記載的用于制備部分水解產(chǎn)物的方法常常包括使用胰酶，諸如通過對豬胰組織的提取生產(chǎn)的胰蛋白酶制備物(參見例如W09304593 A1,US5039532 A)。記載的一些方法包括使用胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物。例如EP0353122 A披露了一種使用胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物來制備低變應(yīng)原性乳清蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，其中糜蛋白酶/胰蛋白酶活性的比例為1.5-3.0。在EP0631731 Al中，以USP單位計(jì)，具有1. 3至18、更優(yōu)選4 至6的胰蛋白酶對糜蛋白酶比例的胰蛋白酶和糜蛋白酶混合物據(jù)說通常產(chǎn)生具有期望特性的水解產(chǎn)物。出于幾個(gè)原因，使用自微生物生成的蛋白水解酶可賦予益處。例如，自微生物生產(chǎn)酶高效且易于控制。因此，可大量地且高純度地生產(chǎn)此類酶。還有，使用微生物酶會有助于克服在自動物來源提取酶方面與QA升高有關(guān)的困難。本發(fā)明的發(fā)明人的一個(gè)目標(biāo)是開發(fā)一種用由微生物生成的酶來制備如下的基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，該基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有低變應(yīng)原性。另一個(gè)目標(biāo)是開發(fā)一種用由微生物生成的酶來制備如下的基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，該基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有與用包含胰蛋白酶和糜蛋白酶的提取制備物制備的水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)片段譜相似的蛋白質(zhì)片段譜。另一個(gè)目標(biāo)是開發(fā)一種用由微生物生成的酶來制備如下的基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，該基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有可接受的味道。特別地， 非常希望獲得如下的部分乳清蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其具有低變應(yīng)原性，具有與用包含胰蛋白酶和糜蛋白酶的提取制備物制備的水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)片段譜相似的蛋白質(zhì)片段譜，和/或具有可接受的味道，特別是在苦味方面。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)由微生物生成的酶可用于生產(chǎn)基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，例如供包括在嬰兒配方中。因此，本發(fā)明涉及一種用于制備基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，其包括用a)自微生物生成的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶和b)至少一種自微生物生成的其它內(nèi)肽酶處理基于乳的蛋白質(zhì)材料(proteinaceous material)的溶液。附圖簡述

圖1顯示與豬胰蛋白酶(上部描記線)相比，鐮孢屬(Fusarium)胰蛋白酶(底部描記線)的UV層析圖，而且顯示了一些主峰的肽序列身份。圖2顯示與牛糜蛋白酶(上部描記線)相比，小枝孢屬(Brachysporiella)蛋白酶(底部描記線)的UV層析圖，而且顯示了一些主峰的肽序列身份。發(fā)明詳述在依照本發(fā)明的方法中，使用基于乳的蛋白質(zhì)材料作為起始材料。此類基于乳的蛋白質(zhì)材料可例如由基于乳清的蛋白質(zhì)材料、酪蛋白或基于乳清的蛋白質(zhì)材料和酪蛋白的混合物組成?；谌榍宓牡鞍踪|(zhì)材料可來源于自奶酪制備獲得的乳清，特別是甜乳清諸如用粗制凝乳酶(rennet)使酪蛋白凝固而產(chǎn)生的?；谌榍宓牡鞍踪|(zhì)材料也可以在35-80% 蛋白質(zhì)的范圍中的濃縮物的形式使用，如通過超濾(UF乳清)或自乳清蛋白質(zhì)分離物獲得的。任選地，此基于乳清的蛋白質(zhì)材料也可通過離子交換和/或電滲析(ED乳清)來去除礦物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于乳的蛋白質(zhì)材料是乳清蛋白質(zhì)濃縮物(WPC)。酪蛋白來源可以是酸性酪蛋白或無脂乳固體?；谌榍宓牡鞍踪|(zhì)材料和/或該酪蛋白可以如液體濃縮物或粉的形式使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于乳的蛋白質(zhì)材料是基于乳清的蛋白質(zhì)材料。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類基于乳清的蛋白質(zhì)材料的來源是已去除酪蛋白-糖-巨肽 (CGMP)的甜乳清或乳清蛋白質(zhì)分離物。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，此類基于乳清的蛋白質(zhì)材料的來源是已去除酪蛋白-糖-巨肽的甜乳清。自甜乳清去除CGMP產(chǎn)生蘇氨酸含量接近人乳的蛋白質(zhì)材料。然后可給此經(jīng)修飾甜乳清補(bǔ)充含量低的那些氨基酸(主要是組氨酸和精氨酸)。EP880902中記載了一種用于自甜乳清去除CGMP的方法。對于本發(fā)明的方法，將蛋白質(zhì)材料稀釋或重建成溶液或懸浮液，優(yōu)選地包含以重量計(jì)2-35%左右、更優(yōu)選以重量計(jì)5-30%左右的蛋白質(zhì)材料。在本發(fā)明的方法中，用至少兩種均自微生物生成的內(nèi)肽酶處理基于乳的蛋白質(zhì)材料。要在本發(fā)明的方法中使用的此類內(nèi)肽酶可以是自任何屬的微生物生成的。就本發(fā)明而言，如本文中與給定生物體聯(lián)合使用的，術(shù)語“自...生成”應(yīng)當(dāng)表示依照本發(fā)明使用的多肽是通過給定生物體的細(xì)胞的發(fā)酵而生成的。多肽對于生成它的生物體可以是天然的，或者它可以自其中插入有編碼該多肽的核苷酸序列的宿主生物體異源生成。要在依照本發(fā)明的方法中使用的內(nèi)肽酶之一是胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶。術(shù)語“胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶”在本文中定義為優(yōu)先在精氨酸和/或賴氨酸的L-異構(gòu)體的C端側(cè)處切割肽或蛋白質(zhì)的內(nèi)肽酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶優(yōu)先在精氨酸和賴氨酸的C端側(cè)處切割肽或蛋白質(zhì)。這表示內(nèi)肽酶對于在精氨酸和賴氨酸二者后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶優(yōu)先在精氨酸或賴氨酸的C端側(cè)處切割肽或蛋白質(zhì)。這表示內(nèi)肽酶對于在精氨酸或賴氨酸任一后面的切割具有比在任何其切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶優(yōu)先在精氨酸的C端側(cè)處切割肽或蛋白質(zhì)。這表示內(nèi)肽酶對于在精氨酸后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶優(yōu)先在賴氨酸的C端側(cè)處切割肽或蛋白質(zhì)。這表示內(nèi)肽酶對于在賴氨酸后面的切割具有比在任何其它氨基酸后面的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶特異性地在精氨酸和賴氨酸的C 端側(cè)處切割肽或蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶具有超過100的胰蛋白酶比例，其中該胰蛋白酶比例是以在Arg或Lys (無論哪個(gè)更大)后面切割時(shí)酶的活性除以在Ala、Asp、Glu、Ile、Leu、Met、Phe或Val (無論哪個(gè)更大)任一后面切割時(shí)酶的活性測定的。即，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶對于在Arg或Lys (無論哪個(gè)更大)后面的切割具有特異性，其為在Ala、Asp、Glu、lie、Leu、Met、Phe或Val (無論哪個(gè)更大)任一后面的切割的特異性的至少100倍。此類測定胰蛋白酶比例的活性測量應(yīng)當(dāng)在內(nèi)肽酶的活性為該內(nèi)肽酶在其最適PH時(shí)的活性的至少一半的pH值實(shí)施。胰蛋白酶比例可以如本申請實(shí)施例1所述來測定。通常，此類胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶在約6. 0至約11. 0的pH、優(yōu)選在約8至約10的pH， 及在約40°C至約70°C的溫度、優(yōu)選在約45°C至約65°C或約45°C至約60°C的的溫度具有最佳蛋白水解活性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶是真菌內(nèi)肽酶。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶源自鐮孢屬，優(yōu)選尖鐮孢(Fusariumoxysporum)的菌株。例如，它可具有本申請的SEQ ID NO 2的成熟多肽的氨基酸序列(SWISSPROT No. P35049)。具有如SEQ ID NO :2的氨基酸25-248所示的氨基酸序列的來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶先前已有記載(US5, 288，627 ；US5, 693，520)。在一個(gè)實(shí)施方案，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶源自茄病鐮孢(Fusarium solani)，例如具有如本申請的SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的AP977S(GENESEQP :ADZ80577)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶源自茄病鐮孢(Fusariumcf. solani)，例如具有如本申請的SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的AP971。就本發(fā)明而言，如本文中與源自給定來源(即生物學(xué)生物體)的多核苷酸或多肽聯(lián)合使用的術(shù)語“源自...”可表示多核苷酸(或編碼多肽的多核苷酸)與該來源生物體中天然存在的多核苷酸序列相同或是其變體，不管是否將多核苷酸序列插入另一生物體或是否由另一生物體生成多肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶是自真菌生成的。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶是自鐮孢屬的菌株生成的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶選自下組i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :2、4或6任一的成熟多肽具有至少60%同一性；ii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下與下述雜交(i)SEQ ID NO :1、3或5任一的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :1、3或5任一的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；iii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :1、3或5任一的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和iv) SEQ ID NO :2、4或6任一的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失、和/或插入的變體。術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為具有內(nèi)肽酶活性的多肽，其處于翻譯和任何翻譯后修飾(諸如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式。術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有內(nèi)肽酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。SEQ ID NO 2的成熟多肽可以是氨基酸25-248。SEQ ID NO 4的成熟多肽可以是氨基酸沈-251。SEQ ID NO :6的成熟多肽可以是氨基酸18-250。就本發(fā)明而言，使用EMBOSS 包(EMBOSS :The European MolecularBiology Open Software Suite, Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277)(優(yōu)選 3. 0. 0 或更晚版本)的 Needle 程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來確定兩種氨基酸序列之間的同一性程度。所使用的任選參數(shù)是缺口打開罰分10，缺口延伸罰分0. 5，和EBL0SUM62 (EMBOSS版本的BL0SUM62)取代矩陣。使用 Needle標(biāo)示“最長同一性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的輸出作為百分比同一性且如下計(jì)算(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，使用EMBOSS 包(EMBOSS :The European MolecularBiology Open Software Suite, Rice等，2000，見上文)(優(yōu)選3. 0. 0或更晚的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上文)來確定兩種脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度。所使用的任選參數(shù)是缺口打開罰分10，缺口延伸罰分0. 5， 和EDNAFULL(EMBOSS版本的NCBI NUC4. 4)取代矩陣。使用Needle標(biāo)示“最長同一性”(使用-nobrief選擇獲得)的輸出作為百分比同一性且如下計(jì)算(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口的總數(shù))在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含與SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中， 胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO :2的成熟多肽的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含SEQ ID而2的氨基酸25至對8。在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由SEQ ID NO :2的成熟多肽的氨基酸序列組成。 在本發(fā)明的另一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由SEQ ID NO :2的氨基酸25 至對8組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含與SEQ IDNO 4的成熟多肽具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95 %、和最優(yōu)選至少98 %同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO :4的成熟多肽的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含SEQ ID而4的氨基酸沈至251。在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由SEQ ID NO :4的成熟多肽的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由SEQ IDNO :4的氨基酸 26至251組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含與SEQ IDNO 6的成熟多肽具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95 %、和最優(yōu)選至少98 %同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO :6的成熟多肽的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO :6的氨基酸18至250。在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由SEQ ID NO :6的成熟多肽的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由SEQ IDNO 6的氨基酸 18至250組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在很低嚴(yán)格條件、優(yōu)選低嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件、更優(yōu)選地中等-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i)SEQ ID NO 1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。(J. Sambrook, E. F. Fritsch,和 T. Maniatis, 1989，Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在很低嚴(yán)格條件、優(yōu)選低嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID N0:3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在很低嚴(yán)格條件、優(yōu)選低嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件、更優(yōu)選地中等-高嚴(yán)格條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID N0:5的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :5的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。在本發(fā)明的語境中，很低至很高嚴(yán)格條件定義為，遵循標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡規(guī)程， 在42°C在5X SSPE、0. 3% SDS、200y g/ml經(jīng)剪切且經(jīng)變性的鮭魚精DNA、和用于很低和低嚴(yán)格性的25%甲酰胺、用于中等和中等-高嚴(yán)格性的35%甲酰胺、或用于高和很高嚴(yán)格性的50%甲酰胺任一中預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時(shí)。最終使用2X SSC、0. 2% SDS將載體材料清洗三次，每次15分鐘，優(yōu)選在45°C (很低嚴(yán)格性)、更優(yōu)選在50°C (低嚴(yán)格性)、 更優(yōu)選在55°C (中等嚴(yán)格性)、更優(yōu)選在60°C (中等-高嚴(yán)格性)、甚至更優(yōu)選在65°C (高嚴(yán)格性)、和最優(yōu)選在70°C (很高嚴(yán)格性)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少 80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO 3的成熟多肽編碼序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少 80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO 5的成熟多肽編碼序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少 80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶是SEQ ID NO :2、4或6任一的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失、和/或插入的變體。在本發(fā)明的語境中，此類變體可以是等位(天然)變體，或者它可以是人工變體。 它可在成熟多肽中包含一個(gè)或多個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的取代、缺失、和/或插入。優(yōu)選地， 氨基酸變化是性質(zhì)上較不重要的，即對蛋白質(zhì)的折疊和/或活性沒有顯著影響的保守氨基酸取代或插入；小缺失，通常是一個(gè)至約30個(gè)氨基酸；小氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基；長達(dá)約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能來便于純化的小延伸，諸如多組氨酸束、抗原表位或結(jié)合域。胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶的濃度優(yōu)選為1，000-1, 000, 000、更優(yōu)選5，000-500，000、和最優(yōu)選地25，000-250, 000USP胰蛋白酶單位每g基于乳的蛋白質(zhì)。一個(gè)USP胰蛋白酶單位為使用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙基酯氫氯化物(BAEE)作為底物，在PH 7. 6和25°C，引起253nm處的吸光度改變0. 003的活性。比活性在不同胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶間可相當(dāng)顯著地變化，但是技術(shù)人員會輕易地能夠確定要使用的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶的量，例如基于水解程度。胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶對基于乳的蛋白質(zhì)的比例優(yōu)選為0. 01-10%重量/重量、更優(yōu)選0.01-5%、更優(yōu)選0. 05-2. 5%、甚至更優(yōu)選0. 5_1%、和最優(yōu)選0. 75%左右。在依照本發(fā)明的方法中，用胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶和至少一種其它內(nèi)肽酶處理基于乳的蛋白質(zhì)材料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶是絲氨酸內(nèi)肽酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶具有低于胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶特異性的活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶具有與哺乳動物糜蛋白酶， 例如自豬胰組織提取的糜蛋白酶的活性類似的活性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶對于在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或組氨酸任一的羧基末端側(cè)處的切割具有比在任何其它天然氨基酸羧基末端側(cè)上的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶對于在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或組氨酸羧基至少一種的末端側(cè)處的切割具有特異性，其為在丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、 脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和纈氨酸任一的羧基末端側(cè)處的切割的特異性的至少3倍、優(yōu)選至少5倍。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶對于在來自由酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和組氨酸組成的組的至少三種氨基酸每一種的羧基末端側(cè)處的切割具有比在精氨酸的羧基末端側(cè)上的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶對于在來自由酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和組氨酸組成的組的至少三種氨基酸每一種的羧基末端側(cè)處的切割具有比在賴氨酸的羧基末端側(cè)上的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶對于在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和組氨酸每一種的羧基末端側(cè)處的切割具有比在精氨酸和賴氨酸二者的羧基末端側(cè)上的切割更高的特異性。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶具有至少3、優(yōu)選至少5的糜蛋白酶比例。至少5的糜蛋白酶比例表示在I^he、Leu或Met (無論哪個(gè)更大)之一后面切割時(shí)酶的活性是在Ala、Arg、Asp、Glu、Ile、Lys或Val (無論哪個(gè)更大)任一后面切割時(shí)的活性的至少5倍。即，該至少一種其它內(nèi)肽酶對于在Phe、Leu或Met (無論哪個(gè)更大)之一后面的切割具有特異性，其為在Ala、Arg、Asp、Glu、lie、Lys或Val (無論哪個(gè)更大)任一后面的切割的特異性的至少3倍、優(yōu)選至少5倍。此類測定糜蛋白酶比例的活性測量應(yīng)當(dāng)在內(nèi)肽酶的活性為該內(nèi)肽酶在其最適PH時(shí)的活性的至少一半的pH值實(shí)施。糜蛋白酶比例可以如本申請實(shí)施例1所述來測定。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶是細(xì)菌內(nèi)肽酶。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶源自擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)的菌株、優(yōu)選自擬諾卡氏菌(Nocardiopsis sp.)NRRL 1擬62 (先前記載于例如WO 88/03947)。例如，它可具有本申請的SEQ ID NO :8的成熟多肽的氨基酸序列。源自擬諾卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列先前已經(jīng)公開于例如DK專利申請No. 1996 00013。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶源自綠僵菌屬 (Metarhizium)、優(yōu)選金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)，例如具有本申請的SEQ ID NO 10的成熟多肽的氨基酸序列的(TREMBL :Q9Y843)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶源自小枝孢屬、優(yōu)選美麗小枝孢(Brachysporiella gayana)，例如具有本申請的SEQ ID NO: 12的成熟多肽的氨基酸序列(CGMCC 0865)。源自金龜子綠僵菌和美麗小枝孢的蛋白酶的DNA和氨基酸序列先前已經(jīng)公開于例如W004072279。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶是自細(xì)菌生成的。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶選自下組i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :8、10或12任一的成熟多肽具有至少60%同一性；ii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID NO :7、9或11任一的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :7、9或11任一的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；iii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQ ID N0:7、9或11任一的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和iv) SEQ ID NO :8、10或12任一的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失、和/或插入的變體。
SEQ ID NO :10的成熟多肽可以是氨基酸187-374。SEQ ID NO 12的成熟多肽可以是氨基酸190-375。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含與SEQID NO 8 的成熟多肽具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含SEQID NO :8的成熟多肽的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO :8的氨基酸1至188。在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由SEQ ID NO :8的成熟多肽的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由SEQ ID NO 8的氨基酸1至188組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含與SEQID NO=IO 的成熟多肽具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含SEQID NO: 10的成熟多肽的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO 10的氨基酸187至374。 在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由SEQ ID N0:10的成熟多肽的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由SEQ ID NO 10的氨基酸187至374組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含與SEQID NO 12 的成熟多肽具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含SEQID NO: 12的成熟多肽的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶包含SEQ ID NO :12的氨基酸190至375。 在本發(fā)明的一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由SEQ ID N0:12的成熟多肽的氨基酸序列組成。在本發(fā)明的另一個(gè)甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由SEQ ID NO 12的氨基酸190至375組成。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述寡核苷酸在很低嚴(yán)格條件、優(yōu)選低嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID N0:7的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ IDNO :7的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述寡核苷酸在很低嚴(yán)格條件、優(yōu)選低嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID N0:9的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ IDNO :9的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述寡核苷酸在很低嚴(yán)格條件、優(yōu)選低嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等嚴(yán)格條件、更優(yōu)選中等-高嚴(yán)格條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)格條件、和最優(yōu)選很高嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID NO :11的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :11的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或 (iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :7的成熟多肽編碼序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少 80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :9的成熟多肽編碼序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少 80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種其它內(nèi)肽酶由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO :11的成熟多肽編碼序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%或至少80%、更優(yōu)選至少85%或至少90%、甚至更優(yōu)選至少95%、和最優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶是SEQ ID N0:8、10或12 任一的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失、和/或插入的變體。該至少一種其它內(nèi)肽酶的濃度優(yōu)選為100-100，000、更優(yōu)選500-50，000、和最優(yōu)選1，000-20, 000USP糜蛋白酶單位每g基于乳的蛋白質(zhì)。一個(gè)USP糜蛋白酶單位為使用N-乙?；?L-酪氨酸乙基酯(ATEE)作為底物，在 PH 7. 0和25°C，引起237nm處的吸光度改變0. 0075的活性。比活性在不同內(nèi)肽酶間可相當(dāng)顯著地變化，但是技術(shù)人員會輕易地能夠確定要使用的該至少一種其它內(nèi)肽酶的量，例如基于水解程度。該至少一種其它內(nèi)肽酶對基于乳的蛋白質(zhì)的比例優(yōu)選為0.001-1%重量/重量、 更優(yōu)選0. 001-0. 5 %、更優(yōu)選0. 005-0. 25 %、甚至更優(yōu)選0. 02-0. 1 %、和最優(yōu)選0. 05 %左
右ο優(yōu)選地，基于內(nèi)肽酶的重量，以胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶添加濃度的2% -50%，更優(yōu)選 5% -20%，甚至更優(yōu)選5% -15%，和最優(yōu)選約10%的濃度添加該至少一種其它內(nèi)肽酶。優(yōu)選地，以USP胰蛋白酶單位測量的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶活性為以USP糜蛋白酶單位測量的該至少一種其它內(nèi)肽酶活性的5倍-500倍、更優(yōu)選10倍-200倍。在水解之前的一個(gè)任選初步步驟是預(yù)加熱基于乳的蛋白質(zhì)材料的溶液或懸浮液， 例如為了確保乳清蛋白質(zhì)級分，例如血清清蛋白(BSA)、α -乳清蛋白、β -乳球蛋白和免疫球蛋白(特別是IgG)的變性。此步驟通常導(dǎo)致在通過免疫化學(xué)評估時(shí)殘余抗原性降低(如下所述)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，實(shí)施預(yù)處理步驟，其包括在約75-95°C加熱蛋白質(zhì)材料約5-30分鐘。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，實(shí)施預(yù)處理步驟，其包括在135°C以上加熱蛋白質(zhì)材料約1-5秒鐘。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，實(shí)施預(yù)處理步驟，其包括在約130°C加熱蛋白質(zhì)材料約30-60秒鐘。技術(shù)人員會知道優(yōu)選將哪些條件應(yīng)用于水解反應(yīng)。例如，可以如US5039532或 EP0631731A1中披露的那樣進(jìn)行。例如，可以在約40°C至60°C的溫度，在6. 5至8. 5，優(yōu)選 6. 5至8范圍內(nèi)的pH值在1至6小時(shí)的過程中進(jìn)行。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在用肽酶進(jìn)行第一處理之后，對蛋白質(zhì)材料進(jìn)一步進(jìn)行第二蛋白水解，之后是內(nèi)肽酶滅活。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在第一和第二蛋白水解之間對蛋白質(zhì)材料進(jìn)行熱處理，如US5039532中披露的。不管水解的條件，優(yōu)選對水解產(chǎn)物進(jìn)行滅活內(nèi)肽酶的額外步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此肽酶滅活包括在約70至110°C、優(yōu)選75至95°C的溫度約0. 1至30分鐘的熱處理。或者，可通過超高溫滅菌(例如在約130°C約30-60秒鐘)來滅活內(nèi)肽酶?？蛇M(jìn)一步澄清獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。它可以液體狀態(tài)貯藏。也可將水解產(chǎn)物超濾，可將它濃縮，例如通過蒸發(fā)，而且可將它干燥，例如通過噴霧干燥或凍干。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有中等(moderate)水解程度。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是部分水解產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有5-30%、優(yōu)選10-25%和更優(yōu)選12-20%的水解程度。特別優(yōu)選的水解程度是14%左右。另一種特別優(yōu)選的水解程度是15%左右。水解程度(DH)表示通過該方法獲得的蛋白質(zhì)水解的程度。在本發(fā)明的語境中，水解程度(DH)定義如下DH=(被切割肽鍵的數(shù)目/肽鍵的總數(shù))xl00%獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的水解程度(DH)可依照Church，F(xiàn). C.等(1983) Spectrophotometric Assay Using ο-Phthaldialdehyde for Determination ofProteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins, J. Dairy Sci. 66 :1219-1227 的方法通過分光光度法來測量?？蓽y定獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中肽的分子量分布，例如通過大小排阻層析(SEC) 進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的水解產(chǎn)物由肽構(gòu)成，其中以重量計(jì)，少于1 %具有 20, OOOkDa以上的分子量。通過本發(fā)明的方法獲得的水解產(chǎn)物優(yōu)選沒有可檢測的完整乳蛋白質(zhì)。水解產(chǎn)物中完整乳蛋白質(zhì)的缺失可通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來證明?？稍谕荒z中進(jìn)行水解產(chǎn)物和未水解的蛋白質(zhì)起始材料之間的直接比較。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的水解產(chǎn)物由肽構(gòu)成，其中以重量計(jì)，少于是完整的基于乳的蛋白質(zhì)。通過本發(fā)明的方法獲得的水解產(chǎn)物的殘余抗原性可使用酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)來測定。以落在該測定法建立的線性劑量響應(yīng)范圍內(nèi)的濃度在固相上固定化未水解的乳蛋白質(zhì)。類似地固定化水解產(chǎn)物制備物。隨后，與家兔抗牛乳蛋白質(zhì)和對家兔IgG有反應(yīng)性的酶綴合物的序貫溫育揭示作為抗原可識別的蛋白質(zhì)和肽的存在。以質(zhì)量為基礎(chǔ)， 比較用水解產(chǎn)物獲得的結(jié)果與用未水解的蛋白質(zhì)起始材料獲得的結(jié)果。然后計(jì)算水解產(chǎn)物的百分比抗原性降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)ELISA的測量，通過依照本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的抗原性相對于相應(yīng)的未水解的基于乳的蛋白質(zhì)材料具有至少約80%、優(yōu)選至少約85%、更優(yōu)選至少約90%或至少約95%、最優(yōu)選至少約98%的降低、和甚至最優(yōu)選抗原性的降低為至少約99%。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過依照本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物用于嬰兒配方組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于制備嬰兒配方組合物的方法，其包括如上所述獲得基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的步驟，且進(jìn)一步包括將基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物包括在嬰兒配方組合物中的步驟。此類嬰兒配方組合物可處于粉、濃縮液、或隨時(shí)可用的液體的形式。此類嬰兒配方組合物優(yōu)選含有為了達(dá)到人類嬰兒的營養(yǎng)需要而設(shè)計(jì)的組分。如此，在依照本發(fā)明的方法獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物之外，嬰兒配方應(yīng)當(dāng)優(yōu)選含有脂質(zhì)來源、碳水化合物來源、和其它營養(yǎng)諸如維生素和礦物質(zhì)。典型地，可將動物油、植物油、淀粉、蔗糖、 乳糖和/或玉米糖漿固體添加至配方以供應(yīng)部分或所有上述營養(yǎng)。優(yōu)選的是，本發(fā)明的包含蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的嬰兒配方組合物是營養(yǎng)完全的。術(shù)語 “營養(yǎng)完全”表示組合物含有足夠的營養(yǎng)以使健康人生命維持延長的時(shí)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的嬰兒配方組合物另外包括量為以蛋白質(zhì)重量計(jì)0. 1至2%的游離精氨酸和/或量為以蛋白質(zhì)重量計(jì)0. 1至3% 的游離組氨酸。如果在本發(fā)明的方法中使用經(jīng)過修飾的甜乳清或乳清蛋白質(zhì)分離物作為基于乳的蛋白質(zhì)材料的話，添加游離精氨酸和/或游離組氨酸是特別優(yōu)選的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的嬰兒配方組合物處于營養(yǎng)完全組合物的形式，其包含至少5%干固體、優(yōu)選約10至30%干固體的量的基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
實(shí)施例實(shí)施例1 自豬胰提取的胰蛋白酶制備物的微生物代替物胰的胰蛋白酶Novo 6. OS (可得自Novozymes A/S-下文稱作PTN)是通過提取豬胰組織而生產(chǎn)的產(chǎn)品。PTN中的主要成分是胰蛋白酶和糜蛋白酶，胰蛋白酶糜蛋白酶的比例為至少12. 5 1(以活性計(jì)，即USP胰蛋白酶單位USP糜蛋白酶單位)。為了鑒定提取的酶制備物像PTN的合適的微生物代替物，對10種不同 Suc-AAPX-pNA 底物(可得自 Bachem) (X = A、R、D、E、I、L、K、M、F 和 V)測量了不同微生物蛋白酶在PH 9的活性?；谶@些測量，計(jì)算了每種微生物蛋白酶的胰蛋白酶比例(TR)和糜蛋白酶比例(CR)。胰蛋白酶比例和糜蛋白酶比例定義如下TR =對 Suc-AAP (R/K) -pNA 的最大活性 / 對 Suc-AAPnon (R/K) -pNA 的最大活性CR =對 Suc-AAP (F/L/M) -pNA 的最大活性 / 對 Suc-AAPnon (F/L/M) -pNA 的最大活性胰蛋白酶比例胰蛋白酶是在精氨酸殘基或賴氨酸殘基任一的羧基末端側(cè)上切割的特異性絲氨酸內(nèi)肽酶，即它們嚴(yán)格地偏愛Pl位置中的R或K。因此，胰蛋白酶樣蛋白酶的一種合理限定為胰蛋白酶比例> 100，表示對任何其它8種Suc-AAPnon (R/K) -pNA底物的活性小于對最佳 Suc-AAP (R/K) -pNA 底物的活性的 10A。糜蛋白酶比例已知糜蛋白酶不太嚴(yán)格地偏愛在芳香族氨基酸殘基(Trp、Tyr或Wie)或疏水性氨基酸殘基Leu、Met和His任一的羧基末端側(cè)上切割。與胰蛋白酶相比，糜蛋白酶是一種不太特異的內(nèi)肽酶，糜蛋白酶樣蛋白酶的一種合理限定為糜蛋白酶比例>5，表示對任何其它 7種Suc-AAPnon (F/L/M) -pNA底物的活性小于對最佳Suc-AAP (F/L/M) -pNA底物的活性的20%。
Suc-AAPX-dNA 測定法
蛋白酶=PTN
豬胰蛋白酶(UNIPR0TP00761)
鐮孢屬胰蛋白酶(來自尖鐮孢的胰蛋白酶樣蛋白酶，SEQ ID NO 2)
牛經(jīng)TLCK處理的糜蛋白酶(Sigma，C-3142)
Alcalase (可得自 Novozymes A/S)
Bacillopeptidase F(來自地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)，UNIPROT :Q65JX1)
小枝孢屬蛋白酶(來自美麗小枝孢，SEQ ID NO 12)
Esperase (可得自 Novozymes A/S)
綠僵菌屬蛋白酶(來自金龜子綠僵菌，SEQ ID NO 10)
擬諾卡氏菌屬蛋白酶(來自擬諾卡氏菌NRRL 18262, SEQ ID NO 8)
Savinase (可得自 Novozymes A/S)
底物Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775)
Suc-AAPR-pNA(BachemL-1720)
Suc-AAPD-pNA(BachemL-1835)
Suc-AAPE-pNA(BachemL-1710)
Suc-AAPI-pNA(BachemL-1790)
Suc-AAPL-pNA(BachemL-1390)
Suc-AAPK-pNA(BachemL-1725)
Suc-AAPM-pNA(BachemL-1395)
Suc-AAPF-pNA(BachemL-1400)
Suc-AAPV-pNA(BachemL-1770)
溫度室溫(25 °C )
測定緩沖液IOOmM 琥珀酸，IOOmM HEPES, IOOmM CHES, IOOmM CABS, ImMCaCl2,
150mM KC1，0. 01% Triton X-100，pH 9. 0。測定法在微量滴定板的孔中放置20 μ 1肽酶稀釋液(在0. 01% Triton X-100中稀釋)。通過添加200 μ 1 ρΝΑ底物(在1. Oml DMSO中溶解50mg，并用測定緩沖液稀釋90 倍)來啟動測定。監(jiān)測0D405的初始升高，作為肽酶活性的量度。如果在4分鐘測量時(shí)間中沒有實(shí)現(xiàn)線性(或接近線性)曲線圖的話，將肽酶進(jìn)一步稀釋并重復(fù)測定。數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種用于制備基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法，其包括用a)自微生物生成的胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶和b)至少一種自微生物生成的其它內(nèi)肽酶處理基于乳的蛋白質(zhì)材料的溶液。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中該胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶源自鐮孢屬(Fusarium)的菌株。
3.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶選自下組i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQ ID NO :2、4或6任一的成熟多肽具有至少60%同一性； )由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下與下述雜交(i) SEQ ID NO :1、3或5任一的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :1、3或5任一的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；iii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQID NO :1、3或5任一的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和iv)SEQ ID NO :2、4或6任一的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失、和/或插入的變體。
4.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶對基于乳的蛋白質(zhì)的比例為0. 01-10%重量/重量、優(yōu)選0. 01-5%、更優(yōu)選0. 05-2. 5%、甚至更優(yōu)選0. 5_1%。
5.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該至少一種其它內(nèi)肽酶對在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和組氨酸的羧基末端側(cè)處的切割具有比在精氨酸和賴氨酸的羧基末端側(cè)上的切割更高的特異性。
6.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該至少一種其它內(nèi)肽酶具有至少3的糜蛋白酶比例。
7.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該至少一種其它內(nèi)肽酶是源自擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)、綠僵菌屬(Metarhizium)或小枝孢屬(Brachysporiella)的菌株。
8.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該至少一種其它內(nèi)肽酶選自下組i)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQID N0:8、10或12任一的成熟多肽具有至少60%同一性；ii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少低嚴(yán)格條件下與下述雜交(i)SEQ ID NO :7、9或11任一的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQ ID NO :7、9或11任一的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈；iii)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQID NO :7、9或11任一的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和iv)SEQ ID NO :8、10或12任一的成熟多肽的包含一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、 缺失、和/或插入的變體。
9.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中至少一種其它內(nèi)肽酶對基于乳的蛋白質(zhì)的比例為0. 001-1 %重量/重量、優(yōu)選0. 001-0. 5 %、更優(yōu)選0. 005-0. 25%、甚至更優(yōu)選 0. 02-0. 1%。
10.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中基于內(nèi)肽酶的重量，以胰蛋白酶樣內(nèi)肽酶添加濃度的2% -50%的濃度添加該至少一種其它內(nèi)肽酶。
11.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在約40°C至60°C的溫度，在范圍6.5至8. 5的PH值在1至6小時(shí)的過程中進(jìn)行水解。
12.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有5-30%、優(yōu)選 10-25%和更優(yōu)選12-20%的水解程度。
13.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物由肽構(gòu)成，其中以重量計(jì)，少于具有20，OOOkDa以上的分子量。
14.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)ELISA的測量，獲得的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的抗原性相對于相應(yīng)的未水解的基于乳的蛋白質(zhì)材料具有至少約80%、優(yōu)選至少約85%、 更優(yōu)選至少約90%或至少約95%、最優(yōu)選至少約98%、和甚至最優(yōu)選至少約99%的降低。
15.依照前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用于制備嬰兒配方組合物的方法，其進(jìn)一步包括將獲得的基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物包括在嬰兒配方組合物中的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備基于乳的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的酶促方法及此類水解產(chǎn)物的用途，例如在嬰兒配方組合物中。
文檔編號C12N9/64GK102378581SQ201080014596
公開日2012年3月14日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者G.B.林格萊夫, P.R.奧斯特加德, S.厄恩斯特 申請人:諾維信公司