專利名稱：潛在免疫原性降低的乳蛋白水解產(chǎn)物的制作方法
專利說明潛在免疫原性降低的乳蛋白水解產(chǎn)物 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及包含經(jīng)水解的乳蛋白和/或乳清蛋白的組合物及其制備方法。本發(fā)明還公開了潛在免疫原性降低的此類蛋白的蛋白水解產(chǎn)物，其用于存在對(duì)所述蛋白產(chǎn)生不利免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)用中。

背景技術(shù)：

乳(milk)是一種得到廣泛應(yīng)用的產(chǎn)品，其不僅以液態(tài)形式作為營養(yǎng)飲料使用，而且還是多種其它產(chǎn)品(例如冰淇淋、酸奶(yogurt)、黃油(butter)、奶油(cream)和干酪(cheese))的基料。另外，乳及其組分還廣泛地用作許多食品的營養(yǎng)成分和功能成分。

乳清(whey)是干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物。乳清已經(jīng)成為多種用途的食品成分或添加劑。常規(guī)的干酪生產(chǎn)方法每加工100磅乳僅產(chǎn)生約10磅干酪，但卻產(chǎn)生90磅乳清。乳清富含乳糖(lactose，一種天然存在的乳糖(milk sugar))，并且還包含在干酪制備過程中既不凝結(jié)也不沉淀而是保持可溶狀態(tài)的多種蛋白。已知乳清蛋白(whey proteins)的營養(yǎng)高并由此具有一定的價(jià)值，但它卻以鹽、乳糖、蛋白和一些脂質(zhì)的稀釋水溶液的形式存在。

盡管丟棄乳清會(huì)受到一定損失，但由于乳清的稀釋特性使得一些地方仍然經(jīng)常把乳清作為廢料或廢水來處理。在成本允許的情況，可將乳清噴霧干燥或者進(jìn)行進(jìn)一步加工以從水中分離蛋白和/或乳糖，并將乳糖和蛋白彼此分離。

可以將乳清或其各種成分加入到多種加工食品中，從而為加工者和消費(fèi)者提供優(yōu)異的營養(yǎng)特性和功能特性。

乳清蛋白可以占總?cè)榈鞍椎募s20％。在干酪生產(chǎn)中，“凝結(jié)”后得到的乳清組合物包含蛋白以及乳糖、脂肪和灰分(2-5％)。乳白蛋白(lactalbumin)和乳球蛋白(lactoglobulin)是乳清中的兩種主要乳蛋白。已報(bào)道所有這些蛋白中以及在乳中發(fā)現(xiàn)的其它蛋白都具有潛在免疫原性，例如作為變應(yīng)原。由于這些蛋白是潛在的免疫原或甚至是變應(yīng)原，某些消費(fèi)者可能要避免使用含有乳、乳清或其成分(例如作為乳清蛋白的乳白蛋白和乳球蛋白)的食品和/或化妝品。在一些情況下，職業(yè)醫(yī)生會(huì)建議某些消費(fèi)者不要使用含乳或乳清蛋白的產(chǎn)品。因此，目前需要降低乳蛋白(milk proteins)和乳清蛋白的潛在免疫原性。


發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一些方面提供了組合物和利用包含水解的乳蛋白和/或乳清蛋白的組合物的方法，所述乳蛋白和/或乳清蛋白被一種或多種蛋白水解酶水解從而降低易于對(duì)所述蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答(特別是不良免疫應(yīng)答)的人發(fā)生此類免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。

一方面，本發(fā)明提供了水解產(chǎn)物，其包含利用至少一種蛋白水解酶水解的至少一種乳蛋白，所述蛋白水解酶優(yōu)選在谷氨酸或天門冬氨酸殘基的位置進(jìn)行切割。所述水解產(chǎn)物在易于對(duì)所述蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白水解酶為內(nèi)肽酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶在谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶來自鏈霉菌(Streptomyces)、葡萄球菌(Staphylococcus)或桿菌(Bacillus)。

在所述方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生水解產(chǎn)物的蛋白為乳清蛋白，或所述蛋白包含至少一種乳白蛋白或乳球蛋白，例如α-乳白蛋白或β-乳球蛋白。

與未水解的蛋白相比，所述水解產(chǎn)物優(yōu)選富含以谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基為末端的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種ELEE(SEQID NO5)、VATEE(SEQ ID NO6)、PFTE(SEQ ID NO7)、NSAEPE(SEQ IDNO8)、VFGKE(SEQ ID NO9)、ASQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)、IQPTPE(SEQ ID NO10)、LKPTPE(SEQ ID NO11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO15)；和/或以下肽中的一種或多種DQAME(SEQ ID NO16)、GIHAQQKE(SEQID NO17)、VLNE(SEQ ID NO18)、VFGKE(SEQ ID NO19)、RLHSMKE(SEQ ID NO20)、DIKQME(SEQ ID NO21)、KHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO22)、RPKHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO23)、PMIGVNQE(SEQ ID NO24)、GIHAQQKEPMEGVNQE(SEQ ID NO25)、RYLGYLE(SEQ ID NO26)、LAYFYPE(SEQ ID NO27)、FVAPFPE(SEQ ID NO28)、KTTMPLW(SEQID NO29)、LFRQFYQLD(SEQ ID NO30)、FFVAPFPE(SEQ ID NO31)、NLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO32)或ENLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO33)。

本發(fā)明還提供了含乳清蛋白的水解產(chǎn)物，其富含以下肽中的一種或多種ELEE(SEQ ID NO5)、VATEE(SEQ ID NO6)、PFTE(SEQ ID NO7)、NSAEPE(SEQ ID NO8)、VFGKE(SEQ ID NO9)、ASQSAPLRVYVE(SEQID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)、IQPTPE(SEQ ID NO1 0)、LKPTPE(SEQ ID NO11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO15)。所述乳清蛋白水解產(chǎn)物在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的個(gè)體體內(nèi)具有降低的免疫原性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述含乳清蛋白的水解產(chǎn)物優(yōu)選富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。該實(shí)施方案中的水解產(chǎn)物是通過使用內(nèi)肽酶而產(chǎn)生的，所述內(nèi)肽酶優(yōu)選在谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶的活性不需要金屬離子。

本發(fā)明還提供了包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的食品成分，其中所述乳清蛋白水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。所提供的食品成分在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。

本發(fā)明還提供了包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的加工食品，其中所述乳清蛋白水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。所述加工食品在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。

本發(fā)明所提供的此類加工食品的實(shí)例為嬰兒配方食品、運(yùn)動(dòng)飲品、含干酪的產(chǎn)品、蛋白補(bǔ)充劑、營養(yǎng)補(bǔ)充劑或膳食替代品。

本發(fā)明還提供了包含本文所述任何水解產(chǎn)物的非食物產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，所述非食物產(chǎn)品為用于人類皮膚的化妝品、洗劑或清潔劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非食物產(chǎn)品包含乳清蛋白水解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ IDNO4)；并且所述非食物產(chǎn)品在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。

本發(fā)明還提供了包含至少兩種本文所述水解產(chǎn)物的組合物，其中所述每種水解產(chǎn)物均由特異性不同的至少一種不同的酶產(chǎn)生，或者每種水解產(chǎn)物為來自于不同蛋白或蛋白混合物的相同酶產(chǎn)生的水解產(chǎn)物。

上述發(fā)明內(nèi)容以及下文的詳細(xì)描述和實(shí)施例是為了對(duì)本發(fā)明各實(shí)施方案進(jìn)行舉例說明。




附圖旨在進(jìn)一步解釋或舉例說明本發(fā)明所述組合物或方法的各個(gè)方面，下文將對(duì)所述組合物或方法進(jìn)行更全面的闡述和例證。

圖1顯示在用S-Glu或L-Glu處理20hr的過程中，乳清蛋白水解的時(shí)間進(jìn)程的SDS-PAGE分析。泳道(從左至右)1、2、3S-Glu分別處理2hr、4hr和20hr；泳道4乳清對(duì)照；泳道5、6、7L-Endo分別處理20hr、4hr和2hr；泳道8乳清對(duì)照；泳道9-10MW標(biāo)志物(MW marker，標(biāo)準(zhǔn)蛋白)。

圖2經(jīng)內(nèi)肽酶消化的乳清蛋白的典型質(zhì)譜分析結(jié)果。在用L-Glu消化樣本20hr時(shí)取樣。A部分表示樣本中各種MW蛋白的檢測(cè)結(jié)果。B部分表示降解產(chǎn)物的相對(duì)豐度。

圖3經(jīng)內(nèi)肽酶消化的乳清蛋白的典型質(zhì)譜分析結(jié)果。在用S-Glu消化樣本20hr時(shí)取樣。A部分表示樣本中各種MW蛋白的檢測(cè)結(jié)果。B部分表示降解產(chǎn)物的相對(duì)豐度。

圖4經(jīng)Endo Glu-肽酶水解的脫脂乳-I(Skim Milk-I)的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道(從左至右)1、2、3S-Endo分別消化2hr、4hr和20hr；泳道5脫脂乳I對(duì)照；泳道7、8、9L-Endo分別消化2hr、4hr和20hr；泳道10MW標(biāo)志物。

圖5經(jīng)Endo Glu-肽酶水解的脫脂乳-II(Skim Milk-II)的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道(從左至右)1、2、3S-Endo分別消化2hr、4hr和20hr；泳道5脫脂乳II對(duì)照；泳道7、8、9L-Endo分別消化2hr、4hr和20hr；泳道10MW標(biāo)志物。

圖6經(jīng)Endo Glu水解的酪蛋白(Casein)的SDS-PAGE分析結(jié)果。泳道(從左至右)1MW標(biāo)志物；泳道2、3、4S-Endo分別消化2hr、4hr和20hr；泳道5標(biāo)志物；泳道6、7、8L-Endo分別消化2hr、4hr和20hr；泳道10Sigma酪蛋白C-5890。

具體實(shí)施例方式 縮寫&簡稱
cP厘泊；動(dòng)力粘度單位；
DFP 二異丙基氟磷酸酯；
EDTA 乙二胺四乙酸；
Endo-Glu 切割多肽中與GLU殘基相鄰的殘基的內(nèi)肽酶，優(yōu)選切割GLU殘基的羧基端；在本發(fā)明中有時(shí)也表示為EndoGluC，該酶的切割位點(diǎn)確定位于GLU殘基的羧基端；
GMP(s)良好作業(yè)規(guī)范；
HPLC 高效液相色譜；
hr(s) 小時(shí)；
IU國際單位；
LC/MS液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用；
LC/MS/MS 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析
L-Endo 來自地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenformis)的Glu-C內(nèi)肽酶；在本發(fā)明中有時(shí)也表示為“L-Glu”或“L-MPR”；
MS 質(zhì)譜，有時(shí)用于概括性地涵蓋LC/MS聯(lián)用和LC/MS/MS分析；
MW 分子量；
PMSF 苯甲基磺酰氟；
S-Endo 來自枯草桿菌(Bacillus subtilis)的Glu-C內(nèi)肽酶；在本發(fā)明中有時(shí)也表示為“S-Glu”或“S-MPR”。

SDS PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳；
Succ-AAPEpNA 琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Glu-對(duì)硝基苯胺；
t時(shí)間；
TFA 三氟乙酸；
TP 總蛋白，例如，上清液中的總可溶蛋白；
w/w 質(zhì)量與質(zhì)量的比例，通常描述確定百分比的基礎(chǔ)；用于表示例如，所加組分的濃度；
w/v 質(zhì)量與體積的比例，用于確定百分比的另一個(gè)基礎(chǔ)；用于表示，例如所加組分的濃度。
定義
本文使用的“蛋白水解產(chǎn)物”是指用蛋白水解酶處理蛋白后得到的產(chǎn)物。根據(jù)例如處理?xiàng)l件(例如處理的時(shí)長、溫度、蛋白濃度以及蛋白水解酶的純度、濃度和活性)，所述蛋白的蛋白水解切割程度可以在最小程度(例如，切割單個(gè)蛋白的單個(gè)肽鍵)和廣泛程度(例如，切割樣本中存在的符合所用蛋白水解酶特異性要求的所有肽鍵)之間變化。

本文使用的“乳蛋白”涵蓋產(chǎn)后雌性哺乳動(dòng)物乳腺的正常分泌物中所有天然存在的蛋白，或其衍生產(chǎn)物(例如由其制得的部分(fraction)、組分或其部分、組分)。所述乳可以來自任何哺乳動(dòng)物種類，包括但不限于奶牛、山羊、綿羊、水牛、牦牛、駱駝、美洲駝、羊駝和人。乳蛋白優(yōu)選來自其乳得到商用或在各養(yǎng)殖地和各地區(qū)得到廣泛使用的哺乳動(dòng)物。需要注意，本文使用的“乳蛋白”涵蓋了“蛋白”的單數(shù)形式和復(fù)數(shù)形式，因此，除非另有說明，否則術(shù)語“乳蛋白”可以指單個(gè)蛋白或一種或多種蛋白的混合物。

“乳清蛋白”涵蓋了在“乳清”(干酪制作中從凝乳分離的液體副產(chǎn)物)中發(fā)現(xiàn)的任何量的任何蛋白。許多干酪生產(chǎn)中產(chǎn)生的乳清中膠束乳蛋白(例如酪蛋白)的含量都格外低，但可溶蛋白(例如α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的含量相對(duì)較高。與上述“乳蛋白”相同，本文所用術(shù)語“乳清蛋白”涵蓋了“蛋白”的單數(shù)形式和復(fù)數(shù)形式，因此，除非另有說明，否則術(shù)語“乳清蛋白”也可以指單個(gè)乳清蛋白或一種或多種乳清蛋白的任何混合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，乳清蛋白實(shí)際上是乳蛋白的亞類，因此，除非另有說明，否則術(shù)語“乳蛋白”可以包含一種或多種乳清蛋白。乳清組合物可以包含，例如乳、奶油和干酪乳清?？梢允褂脕碓从谌魏胃衫业娜榍濉Ｈ榍宓鞍卓梢杂扇魏畏椒ǐ@得，例如過濾、滲析、蒸發(fā)和干酪乳清的反滲透，或者通過可以得到通常被稱為“乳清蛋白”的蛋白的其它方法。

本文使用的“敏感型”個(gè)體為易于對(duì)未經(jīng)水解的所述蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答或反應(yīng)的個(gè)體。作為直接或間接食用或接觸例如一種或多種乳蛋白和/或乳清蛋白的結(jié)果，此類免疫應(yīng)答或反應(yīng)可用于測(cè)量這些蛋白的免疫原性。此類蛋白在不易對(duì)所述蛋白產(chǎn)生此類免疫應(yīng)答的個(gè)體(例如本文有時(shí)將其稱為對(duì)一種或多種乳和/或乳消蛋白“非敏感型”或“不敏感型”的個(gè)體)中顯示極小的免疫原性乃至沒有免疫原性。優(yōu)選地，此類個(gè)體在接觸或食用所述蛋白后，不產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)(免疫應(yīng)答)。

本文使用的“免疫原性降低”指可測(cè)量的免疫應(yīng)答的任何降低、減少或改善。此類應(yīng)答的測(cè)量可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，可以直接或間接測(cè)量來自個(gè)體的生物樣本(包括組織、細(xì)胞或體液等或其任意組合)的所述應(yīng)答，或者，可以直接或間接在個(gè)體內(nèi)評(píng)價(jià)所述應(yīng)答。然而在本文提供的多個(gè)實(shí)施方案中，不論在體外還是體內(nèi)測(cè)量，此類應(yīng)答在數(shù)字上的任何降低(或減少)都是足夠的，優(yōu)選降低是一個(gè)較實(shí)質(zhì)的降低。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，生物學(xué)數(shù)據(jù)(例如免疫應(yīng)答的測(cè)量值)在個(gè)體內(nèi)以及個(gè)體間可能具有大的差異。例如，當(dāng)所述應(yīng)答發(fā)生于“敏感型”個(gè)體時(shí)，優(yōu)選免疫應(yīng)答發(fā)生實(shí)質(zhì)性地降低(例如降低至少約50％、60％或70％，或甚至約80％或更多)。更優(yōu)選地，與對(duì)一種或多種未經(jīng)處理的乳蛋白或乳清蛋白不敏感的個(gè)體的免疫應(yīng)答的測(cè)量相比，在使用本文所述蛋白水解產(chǎn)物的此類敏感型個(gè)體中僅觀察到小的或最小的差異。當(dāng)免疫應(yīng)答被認(rèn)為是不利情況(例如過敏性應(yīng)答)時(shí)是有利的。在此種情況下，敏感型個(gè)體免疫應(yīng)答(或其測(cè)量值)可以降低至少約85％-約90％，更優(yōu)選約90％-約95％，或者甚至更多。在一些情況下，敏感型個(gè)體對(duì)本文所述蛋白水解產(chǎn)物的應(yīng)答與非敏感型個(gè)體的應(yīng)答在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有顯著差異。然而在其它情況下，在“敏感型”個(gè)體中與未經(jīng)水解的蛋白相比免疫應(yīng)答降低了數(shù)倍。例如，應(yīng)答可以降低約10倍-100倍或者甚至1000倍。更優(yōu)選地，與個(gè)體對(duì)未經(jīng)修飾的蛋白的應(yīng)答相比，該個(gè)體食用或接觸本文所述的蛋白水解產(chǎn)物組合物后所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的測(cè)量值降低約1000倍-10,000倍或者甚至100,000倍或更多。
蛋白水解產(chǎn)物
第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了蛋白水解產(chǎn)物，其包含利用至少一種蛋白水解酶水解的至少一種乳蛋白，所述蛋白水解酶優(yōu)選在谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基的位置進(jìn)行切割。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水解產(chǎn)物在易于對(duì)未經(jīng)水解的所述蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的個(gè)體中的免疫原性降低了。

在某些實(shí)施方案中，包含至少一種乳蛋白的所述水解產(chǎn)物是被內(nèi)肽酶水解的。優(yōu)選所述內(nèi)肽酶的特異性是有限制的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，對(duì)于在食品中的應(yīng)用，對(duì)蛋白質(zhì)的大量非特異性水解可以產(chǎn)生不期望的特性，例如異味和/或功能喪失。因此，優(yōu)選用于本發(fā)明的內(nèi)肽酶僅以有限的程度進(jìn)行切割，例如僅對(duì)一種或多種特定氨基酸具有特異性，或者對(duì)某些類型的氨基酸具有特異性，其切割位點(diǎn)在羧基端和氨基端中的一端或者兩端。

在某些目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶對(duì)親水性氨基酸殘基(尤其是谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基)的羧基端具有特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶特異性地在谷氨酸殘基和/或天門冬氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶僅在或幾乎僅在谷氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。

在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶屬于絲氨酸蛋白酶家族。該內(nèi)肽酶至少部分地(如果不是完全)被苯甲基磺酰氟或二異丙基氟磷酸酯抑制。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶來自鏈霉菌、葡萄球菌或桿菌。另外，所述內(nèi)肽酶還可以來自適合食品或飼料生產(chǎn)的任何來源。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶來自枯草桿菌(bacillus subtillis)或地衣芽孢桿菌。在某些實(shí)施方案中，所述內(nèi)肽酶為來自地衣芽孢桿菌的23.6kDa蛋白，其氨基酸序列在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)數(shù)據(jù)庫中以EMBL P80057的登錄號(hào)提供。或者，所述內(nèi)肽酶是來自枯草桿菌的23.9kDa蛋白，其氨基酸序列在EMBL數(shù)據(jù)庫中以EMBL P39790的登錄號(hào)提供。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶為滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的任何內(nèi)肽酶，前提是其不是美國專利第5,866,357號(hào)中公開的內(nèi)肽酶。

所述蛋白的乳源并不被限定在任何特定的哺乳動(dòng)物種類，因此，本發(fā)明可以使用的乳源包括但不限于奶牛、山羊、綿羊、水牛、牦牛、駱駝、美洲駝、羊駝和人。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述乳蛋白來源的物種不同于接觸或食用所述乳蛋白的個(gè)體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，個(gè)體對(duì)來自于其本身的乳蛋白敏感。因此，所述乳蛋白可以來自于個(gè)體相同的物種。在此類實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的蛋白降低了所述乳蛋白在該個(gè)體中的免疫原性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述個(gè)體(在本文中有時(shí)被稱為“受試者”)為人，所述乳來自其乳經(jīng)常被人類食用的非人動(dòng)物物種，例如奶牛、山羊、綿羊或水牛。

在某些實(shí)施方案中，所述至少一種乳蛋白是可溶的非膠束蛋白(non-micellar protein)。因此，在此類實(shí)施方案中，優(yōu)選所述乳蛋白不是酪蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述乳蛋白為可溶蛋白，例如通常在干酪生產(chǎn)中得到的乳清中的一種或多種蛋白。

在特定的實(shí)施方案中，所述蛋白包含至少一種乳白蛋白或乳球蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，現(xiàn)已在多種哺乳動(dòng)物的乳中鑒定出多種此類蛋白。其中，常見的乳清蛋白為α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，兩種均適合用于本發(fā)明?？梢岳斫猓谟糜诒景l(fā)明前通常不將某種乳清蛋白與其它乳清蛋白分離。盡管如此，此類經(jīng)分離或甚至經(jīng)純化的乳蛋白的應(yīng)用也包含在本發(fā)明中。

如上所述，由于此類乳蛋白的潛在免疫原性，期望內(nèi)肽酶對(duì)作為刺激、激發(fā)、誘導(dǎo)或增強(qiáng)個(gè)體免疫應(yīng)答的免疫決定簇(例如抗原決定簇)的肽進(jìn)行切割。此類免疫應(yīng)答包括但不限于主要受T淋巴細(xì)胞控制的免疫應(yīng)答以及常與免疫系統(tǒng)的B淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)的免疫應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答還包括產(chǎn)生任意類型的抗體的免疫應(yīng)答。本技術(shù)人員可以理解，在多種可測(cè)的應(yīng)答中，在應(yīng)答性個(gè)體對(duì)此類蛋白的應(yīng)答中通常產(chǎn)生Ig-E抗體。

出于本發(fā)明的目的，免疫原性的“降低”表示無論體內(nèi)還是體外免疫應(yīng)答測(cè)量，至少是數(shù)字的減小。優(yōu)選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的降低，此時(shí)該分析才是可能且恰當(dāng)?shù)?。統(tǒng)計(jì)分析領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以理解，可以利用例如學(xué)生T檢驗(yàn)或適合于數(shù)據(jù)采集方法學(xué)特性和設(shè)計(jì)的其它任何分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)差異的確定。

因此，為了使所述乳蛋白(例如乳清蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的潛在免疫原性最小化，優(yōu)選內(nèi)肽酶切割存在于所述蛋白中的一個(gè)或多個(gè)免疫決定簇，例如β-乳球蛋白第55位-98位氨基酸之間的區(qū)域。相對(duì)于未經(jīng)水解的蛋白，此切割產(chǎn)生的水解產(chǎn)物富含一種或多種特定肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ IDNO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。

在某些實(shí)施方案中，與未經(jīng)水解的蛋白相比，所述水解產(chǎn)物通常富含以谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基為末端的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述乳蛋白包含乳清蛋白時(shí)，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種ELEE(SEQID NO5)、VATEE(SEQ ID NO6)、PFTE(SEQ ID NO7)、NSAEPE(SEQ IDNO8)、VFGKE(SEQ ID NO9)、ASQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQID NO4)、IQPTPE(SEQ ID NO10)、LKPTPE(SEQ ID NO11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO13)、TKIPAVFKID(SEQ IDNO14)和TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO15)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述乳蛋白包含酪蛋白時(shí)，所述水解產(chǎn)物可以富含以下肽中的一種或多種DQAME(SEQ ID NO16)、GIHAQQKE(SEQ IDNO17)、VLNE(SEQ ID NO18)、VFGKE(SEQ ID NO19)、RLHSMKE(SEQID NO20)、DIKQME(SEQ ID NO21)、KHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO22)、RPKHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO23)、PMIGVNQE(SEQ ID NO24)、GIHAQQKEPMEGVNQE(SEQ ID NO25)、RYLGYLE(SEQ ID NO26)、LAYFYPE(SEQ ID NO27)、FVAPFPE(SEQ ID NO28)、KTTMPLW(SEQ IDNO29)、LFRQFYQLD(SEQ ID NO30)、FFVAPFPE(SEQ ID NO31)、NLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO32)和ENLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO33)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該注意到，本發(fā)明不排除將酪蛋白和乳清蛋白一起用作所述水解產(chǎn)物的來源的情況，在這種情況下，所述水解產(chǎn)物可以富含上述肽(SEQ ID NOs1-32)中的任意一種或全部的上述肽，或其任意組合。
含乳清蛋白的水解產(chǎn)物
本發(fā)明還提供了含乳清蛋白的水解產(chǎn)物。所述含乳清蛋白的水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種ELEE(SEQ ID NO5)、VATEE(SEQ ID NO6)、PFTE(SEQ ID NO7)、NSAEPE(SEQ ID NO8)、VFGKE(SEQ ID NO9)、ASQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、 ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)、IQPTPE(SEQ ID NO10)、LKPTPE(SEQ ID NO11)、LKPTPEGD(SEQ IDNO12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO14)，和TKIPAVFKIDALNE (SEQ ID NO15)；并且所述水解產(chǎn)物在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者中的免疫原性降低了。

如以上討論，所述免疫反應(yīng)可以涵蓋個(gè)體對(duì)外源蛋白的任何反應(yīng)。對(duì)此類反應(yīng)的測(cè)量可以涵蓋所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)(體外、體內(nèi)、臨床或其它技術(shù))。如上所述，“降低”至少表示是數(shù)字的減少。優(yōu)選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的降低，此時(shí)該分析才是可能且恰當(dāng)?shù)?。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者為對(duì)來自牛乳的乳清蛋白過敏的人。與未經(jīng)水解的乳清蛋白相比，所述水解產(chǎn)物的免疫原性的測(cè)量值降低了至少約50％。在其它實(shí)施方案中，免疫原性的測(cè)量值降低約70％、80％或90％或更多。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性降低了約10倍-100倍、100倍-1000倍、1000倍-10,000倍或者甚至更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)水解的蛋白組合物在敏感型受試者體內(nèi)的免疫原性降低，從而使經(jīng)水解的蛋白在敏感型受試者中的免疫應(yīng)答與其在非敏感型受試者中的免疫應(yīng)答之間幾乎沒有可測(cè)得的差異。優(yōu)選在接觸或食用含乳清蛋白的水解產(chǎn)物后，敏感型個(gè)體和非敏感型個(gè)體之間的免疫應(yīng)答沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)未經(jīng)處理的乳清蛋白樣本，所述含乳清蛋白的水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ IDNO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。

可以通過使用優(yōu)選在谷氨酸殘基和/或天門冬氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割的一種或多種內(nèi)肽酶來產(chǎn)生所述含乳清蛋白的水解產(chǎn)物。在具體實(shí)施方案中，通過使用其活性的產(chǎn)生不需要金屬(即不是嚴(yán)格金屬蛋白酶)的內(nèi)肽酶產(chǎn)生所述含乳清蛋白的水解產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，使用諸如EDTA的金屬螯合劑可以幫助確定酶(例如蛋白酶或肽酶)是否需要金屬。
蛋白水解產(chǎn)物的應(yīng)用
在另一方面，本發(fā)明提供了包含如上所述的含乳清蛋白的水解產(chǎn)物或乳蛋白水解產(chǎn)物的食品添加劑、補(bǔ)充劑和成分。

相對(duì)于未經(jīng)水解的蛋白，在此類應(yīng)用中優(yōu)選富含一種或多種以下肽的水解產(chǎn)物(優(yōu)選乳清水解產(chǎn)物)AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。

所述添加劑在易于對(duì)一種或多種乳蛋白或乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者中的免疫原性發(fā)生降低。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述的乳蛋白水解產(chǎn)物或乳清蛋白水解產(chǎn)物的加工食品。優(yōu)選地，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)；并且所述水解產(chǎn)物在易于對(duì)一種或多種乳/乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)的免疫原性出現(xiàn)降低。

在某些實(shí)施方案中，所述加工食品為嬰兒配方食品、運(yùn)動(dòng)飲品、含干酪的產(chǎn)品、蛋白補(bǔ)充劑、營養(yǎng)補(bǔ)充劑或膳食替代品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述水解產(chǎn)物為乳清蛋白水解產(chǎn)物，且所述受試者對(duì)未經(jīng)水解的乳清蛋白和/或乳白蛋白產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)。

本發(fā)明提供的組合物的應(yīng)用也可以與干酪制備結(jié)合，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所述組合物特別適合用于各種硬干酪和軟干酪的生產(chǎn)。本發(fā)明提供的組合物可以用于降低此類產(chǎn)品的免疫原性?？梢酝耆帽景l(fā)明提供的經(jīng)水解的乳來制備干酪，或者在凝結(jié)前，可以向用于干酪生產(chǎn)的乳中加入乳蛋白水解產(chǎn)物或乳清蛋白水解產(chǎn)物組合物。此類應(yīng)用將產(chǎn)生在營養(yǎng)含量和功能特性方面具有優(yōu)異品質(zhì)的干酪產(chǎn)品。

類似地，本發(fā)明所提供的乳水解產(chǎn)物和乳清水解產(chǎn)物組合物可用于生產(chǎn)其它奶制品，其包括但不限于酸奶、村舍式干酪或酸奶油的生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，所述水解產(chǎn)物適合用于噴霧干燥、濃縮或其它深加工步驟。噴霧干燥的水解產(chǎn)物特別適合用于目前需要使用乳清固體的應(yīng)用中。當(dāng)需要降低免疫原性時(shí)，也可將其用作乳固體替代物。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所提供的乳水解產(chǎn)物和乳清水解產(chǎn)物組合物可用于其它食品中，所述食品中通常含有一種或多種在標(biāo)簽上沒有標(biāo)明的乳產(chǎn)品或乳的副產(chǎn)品，或者該產(chǎn)品在提供給消費(fèi)者時(shí)可能沒有標(biāo)簽。在一些情況下，即使在標(biāo)簽上列出所述成分，沒有系統(tǒng)接受營養(yǎng)方面教育的消費(fèi)者也不能理解所列出的某些成分實(shí)際上為含乳蛋白的成分或含乳清蛋白的成分。此類產(chǎn)品對(duì)敏感型個(gè)體具有實(shí)質(zhì)性的風(fēng)險(xiǎn)，例如可能產(chǎn)生嚴(yán)重過敏反應(yīng)的個(gè)體，并且實(shí)際上此類產(chǎn)品可能危及這些個(gè)體的生命。本發(fā)明提供的組合物易于適合此類應(yīng)用，并可以用于例如飲料(例如咖啡、茶或其改進(jìn)品和衍生品、運(yùn)動(dòng)飲品等)以及布丁、餡料和點(diǎn)心。人們?cè)诤芏嗥渌a(chǎn)品中添加少量的乳或乳清成分，從而為加工或消費(fèi)者接受度提供已知有益的功能性。本發(fā)明闡述的水解產(chǎn)物可以容易地取代作為其來源的所述成分。該水解產(chǎn)物優(yōu)選保留作為其來源的所述成分的功能特性，例如結(jié)構(gòu)、香味、口感、分散度和溶解度等。相對(duì)于其它可選物(例如被特異性較低的酶更完全地水解的乳清蛋白)，該水解產(chǎn)物還提供改良的風(fēng)味(例如苦味降低)和優(yōu)選的發(fā)泡特性。在一些實(shí)施方案中，與未經(jīng)水解的蛋白相比，所述經(jīng)水解的蛋白具有改良的膠凝性、持水性或水結(jié)合能力。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的經(jīng)水解的乳清蛋白或乳蛋白用于制造外用產(chǎn)品，例如洗劑、霜?jiǎng)④浉?、擦?rub)或清潔劑等。因此，本發(fā)明也涉及含本文所述的經(jīng)水解的蛋白組合物的此類產(chǎn)品。此類產(chǎn)品可用于例如治療目的，例如緩解皮膚干燥、發(fā)癢和不適等。除了所述經(jīng)水解的蛋白組分外，這些產(chǎn)品優(yōu)選包含作為基質(zhì)的脂質(zhì)、蠟、油、油包水乳液或水包油乳液等。通常，所述產(chǎn)品還可以包含一種或多種矯味劑成分以及其它成分，例如表面活性劑或乳化劑。本發(fā)明還提供了包含本文所述乳蛋白水解產(chǎn)物或乳清蛋白水解產(chǎn)物的化妝品和其它外觀輔助品或美容輔助品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化妝品用于人的面部、面頰、唇部或眼部。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述產(chǎn)品用于任何身體部位以幫助改善皮膚的化妝效果，例如減少皺紋、痣、雀斑、疤痕和瑕疵等的出現(xiàn)。
制備方法
可以通過向含乳蛋白或乳清蛋白的液體或半固體中加入一種或多種蛋白水解酶來制備上述水解的乳蛋白和/或乳清蛋白組合物。

所述酶處理可以通過以下方式進(jìn)行將蛋白酶或適當(dāng)?shù)牡鞍酌附M合(例如一種或多種內(nèi)切蛋白酶或內(nèi)肽酶)引入或分散到乳組合物或乳清組合物中，或者引入或分散到本文所述的含乳蛋白和/或乳清蛋白的組合物中，從而使所述酶與所述蛋白底物接觸。將所述酶引入到所述蛋白組合物之后，通過將所述混合物保持在適合的條件下(例如適當(dāng)?shù)某掷m(xù)時(shí)間、在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H，并且存在在任何所需輔助因子的條件下)，從而發(fā)生所述酶反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的規(guī)則，在適合所選酶(一種或多種酶)的選定條件下，利用上述酶(一種或多種酶)進(jìn)行乳蛋白組合物或乳清蛋白組合物的處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，當(dāng)期望的終產(chǎn)品用于人類食用的情況下，所述條件可能需要在所使用的含蛋白物質(zhì)的保存和處理過程中采用恰當(dāng)?shù)男l(wèi)生措施和良好操作規(guī)范(GMPs)。類似地，其它非食用產(chǎn)品(例如外用的洗劑或化妝品)可以具有與其制造相關(guān)的管理要求。

盡管上文有所闡述，酶處理可以在任何合適的pH(例如pH 2-10、pH 4-9或者pH 5-7)下進(jìn)行，但是對(duì)于本文所闡述的一些酶，可優(yōu)選使用約pH 7-8。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，每種酶在pH范圍內(nèi)具有特定的性能，并且可能并非總是有必要或者甚至是期望在酶活性最高的pH下使用該酶。以類似的方式，技術(shù)人員可以容易地選擇合適的溫度或者酶處理步驟的溫度。影響溫度選擇的因子包括但不限于所使用一種或多種酶的熱穩(wěn)定性，所要水解的蛋白以及含所述蛋白的組合物的熱穩(wěn)定性，以及所述酶的相對(duì)活性隨溫度的變化。

任選地，酶處理進(jìn)行合適的時(shí)間后，例如，已發(fā)生一定量的蛋白水解(例如，基于諸如功能性特性和免疫原性特性考慮的預(yù)定期望量的蛋白水解)后，可以除去酶或降低其活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的用于除去食品或飼料加工中使用的酶或使其失活的方法，使所述酶部分失活或完全失活。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)鞍姿獾某潭茸阋蕴峁┍疚乃龅拿庖咴越档偷奶匦詴r(shí)，所述酶被熱失活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用快速測(cè)量法(例如總可溶蛋白％、粘度)對(duì)蛋白水解的程度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)所述快速測(cè)量值得到預(yù)定的期望讀數(shù)時(shí)，使酶失活。優(yōu)選所述酶的活性被熱失活，更優(yōu)選將熱失活與諸如需要加熱的過程、巴氏滅菌或均化處理步驟組合使用。

合適的酶劑量通常在約0.01-0.1％(w/w)的范圍內(nèi)。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述乳蛋白和/或乳清蛋白以例如約1-60％、5-50％、20-40％、10-45％或約10-15％的乳蛋白和乳清蛋白含量存在。因此，酶的劑量可包括以下量，例如，0.1-1.0％、尤其為0.2％(w/w)，其對(duì)應(yīng)于2000IU/100g乳蛋白或乳清蛋白。

將在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘產(chǎn)生1毫摩蛋白水解產(chǎn)物需要的酶量定義為一個(gè)IU(國際單位)。用于測(cè)定IU的“標(biāo)準(zhǔn)條件”是使用含10-15％乳清蛋白固體的水或脫脂乳、pH7、溫度為40℃。如在實(shí)施例中的舉例說明，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶的劑量基于所處理組合物的蛋白含量(w/w)。

或者，可以通過其它方式確定所述酶的劑量，例如通過使用本文所述的其它試驗(yàn)。此類試驗(yàn)都可以提供有關(guān)蛋白水解程度(或度)的指示，并包括測(cè)定水解百分率、粘度測(cè)量、凝膠電泳和質(zhì)譜。換而言之，也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)計(jì)算或根據(jù)其它數(shù)據(jù)計(jì)算在給定的溫育時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生期望或預(yù)定結(jié)果所需要的酶量。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以選擇酶量以提供特定的粘度降；在另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇酶量以產(chǎn)生通過凝膠電泳或質(zhì)譜(MS)分析測(cè)定的某些消化片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過蛋白樣本的水解度反向計(jì)算酶的劑量?！八舛取庇傻鞍姿饷盖懈畹碾逆I的數(shù)量計(jì)算值。在這種情況下，在切割所述乳清蛋白分子中基本所有的谷氨酸和可能的天門冬氨酸殘基的情況下獲得最大水解度?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定水解度，例如通過使用J.Adler-Nissen，J.Agric.Food Chem.271256(1979)中闡述的TNBS(三硝基苯磺酸)試驗(yàn)。

已經(jīng)使用了測(cè)定酶量的其它方法或酶活性試驗(yàn)，例如通過可測(cè)底物例如比色底物或人工底物，如Suc-AAPEpNA(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Glu-p-硝基苯胺)?？梢酝ㄟ^獲取準(zhǔn)確的比活性率計(jì)算值并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線或預(yù)定的轉(zhuǎn)化因子將活性/單位體積的單位轉(zhuǎn)化成酶量，從而進(jìn)行向活性EndoGluC蛋白酶濃度的轉(zhuǎn)化。例如，對(duì)于本文所使用的某些試驗(yàn)，L-MPR的轉(zhuǎn)化因子為0.348U/mg酶，S-MPR的轉(zhuǎn)化因子為0.549U/mg。根據(jù)以上闡述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解如何確定所需的劑量或活性。

所述酶處理可以分批進(jìn)行，例如在帶有攪拌的容器中。所述處理還可以是連續(xù)的，例如在一系列帶攪拌的釜式反應(yīng)器中進(jìn)行。所述處理還可以包括固定酶和各種經(jīng)修飾的酶的使用，前提是所述固定酶或經(jīng)修飾的酶的活性保留水解的適當(dāng)特異性。
實(shí)施例 實(shí)施例1 利用特異性受限的內(nèi)肽酶消化乳蛋白
酶地衣芽孢桿菌“Endo-Glu”肽酶(“L-Glu”)來自地衣芽孢桿菌的所述酶(“L-MPR”或“Endo-GluC”)在枯草桿菌中表達(dá)并從2-14L發(fā)酵物中純化、收集和濃縮。經(jīng)純化的酶(純度＞90％)的濃度為25.1mg/mL。該23.6kDA蛋白的序列與灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)V8蛋白酶以及其它Glu/ASP特異性蛋白酶(例如對(duì)Glu-Xaa、ASP-Xaa切割位點(diǎn)具有特異性的蛋白酶)的序列相似。該酶是被EDTA部分抑制的絲氨酸內(nèi)肽酶，然而卻不是金屬蛋白酶。該酶的最佳pH為7.5-8左右。離子強(qiáng)度越高，其活性越低。所述酶的序列是已知的并可見于公共數(shù)據(jù)庫。例如，登陸互聯(lián)網(wǎng)，可在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB/Swiss-Prot原始登錄號(hào)P80057獲得所述酶的序列。參見，″Purification，characterization，cloning，and expression of aglutamic acid-specific protease from Bacillus licheniformis ATCC 14580″J.Biol.Chem.26723782-23788(1992)。

枯草桿菌“Endo-Glu”肽酶(“S-Glu”)來自枯草桿菌的所述酶(“S-MPR”或“Endo-GluC”)在枯草桿菌中表達(dá)，并從2-14L發(fā)酵物中純化、收集和濃縮。經(jīng)純化的酶(純度＞85％)的濃度為3.5mg/mL。該23.9kDa絲氨酸蛋白酶的蛋白序列與地衣芽孢桿菌Endo-Glu肽酶“L-Glu”的序列相似。所述S-Glu蛋白酶在較寬的pH范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。其特異性不如地衣芽孢桿菌的L-Glu酶。所述酶的序列是已知的并可見于公共數(shù)據(jù)庫。例如，登陸互聯(lián)網(wǎng)，可在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB/Swiss-Prot原始登錄號(hào)P39790獲得所述酶的序列。參見，″Gene encoding a glu-specificextracellular endopeptidase in Bacillus subtilis.″；J.Bacteriol.1721024-1029(1990)，以及“Purification and characterization of a glutamic acid-specificendopeptidase from Bacillus subtilis ATCC 6051application to the recovery ofbioactive peptides from fusion proteins by sequence-specific digestion.”Appl.Microbiol.Biotech.4827-33(1997)。
方法
為了評(píng)定蛋白水解消化的時(shí)間進(jìn)程，將12％乳清蛋白(含13.3g乳清粉(Lacprodan DI-9224(Arla Foods))的100ml水)溶解在試劑級(jí)水中。將每份15g的該溶液置于4個(gè)50ml試管中并在振蕩培養(yǎng)箱中溫育至40℃(例如溫育15分鐘)。向3個(gè)上述50ml試管分別加入上述經(jīng)純化的酶。使用500μl濃度為1.5mg/ml的S-MPR或者濃度為4.2mg/ml的L-MPR內(nèi)肽酶。以Succ-AAPEpNA為底物進(jìn)行活性測(cè)定。通過SDS-PAGE，所述酶的均質(zhì)性大于約98％。不添加酶的第4個(gè)試管作為對(duì)照試管。將上述4個(gè)試管在振蕩搖床中于40℃、175rpm溫育指定時(shí)間。在其溫育時(shí)間終點(diǎn)(分別為2hr、4hr和20hr)移出試管并以3600rpm(約2800xg)離心10分鐘以分離沉淀和上清液。

檢測(cè)上清液以測(cè)定在上清中剩余的總可溶蛋白(TP)(g/l)，干固體％和粘度測(cè)量值。還利用SDS-PAGE通過電泳對(duì)上清進(jìn)行分析，以對(duì)水解進(jìn)行監(jiān)測(cè)。進(jìn)行質(zhì)譜(MS)分析，以確定各蛋白水解切割產(chǎn)物的存在。
質(zhì)譜分析
樣本制備按照上文的描述制備經(jīng)水解的蛋白樣本。通過高效液相色譜與LCQ離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC/MS)對(duì)經(jīng)消化的蛋白樣本(每個(gè)約20μl)進(jìn)行分析。

LC/MS/MS分析利用與LCQ高等離子阱MS(LGQ Advantage Ion TrapMS，ThermoFinnigan，San Jose，CA)偶聯(lián)的Surveyor HPLC系統(tǒng)獲得所有MS和MS/MS數(shù)據(jù)。對(duì)所有經(jīng)蛋白水解消化的樣本均使用Vydac反相C18柱(2.1X 150mm)，并使用從0％至70％的溶劑B、流速200μl/分鐘進(jìn)行HPLC梯度洗脫65分鐘。溶劑A含0.1％TFA的水溶液，溶劑B含0.08％TFA的乙腈溶液。利用TurboSEQUEST和Xcalibur程序(ThermoFinnigan)對(duì)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

然后將MS分析的結(jié)果用于Mascot程序，該程序可以將肽消化片段用作唯一數(shù)據(jù)，通過利用公共數(shù)據(jù)庫(例如國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)維護(hù)的公共數(shù)據(jù)庫)鑒定源蛋白及其原始序列。關(guān)于Mascot及其前身Mowse的更多信息可見于互聯(lián)網(wǎng)，例如由MatrixScience Inc.(Boston，MA)維護(hù)的網(wǎng)址(www.matrixscience.com)。
結(jié)果
利用終酶蛋白濃度為0.188％的內(nèi)肽酶S-Glu處理濃度為12％的乳清蛋白蛋白，其結(jié)果是2小時(shí)內(nèi)總蛋白(TP)減少5.5％。在接下來的4-20小時(shí)內(nèi)，TP進(jìn)一步減少，最大減少量約為20％。

所沉淀凝乳的滯留水體積(即，凝乳保留水量的測(cè)量值)約等于進(jìn)入凝乳內(nèi)的水重。

在用S-Glu酶溫育20小時(shí)后，上清的粘度從3.05cP提高到5.99cP。

利用終濃度相同的L-Glu酶可以觀察到相似的結(jié)果。在2小時(shí)內(nèi)，觀察到TP減少6.9％，在4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)時(shí)提高到10％。在20小時(shí)溫育結(jié)束時(shí)所述減少達(dá)到14％。

所沉淀凝乳的滯留水體積約為蛋白重量的70重量％。

在用L-Glu內(nèi)肽酶溫育的20小時(shí)過程中，上清的粘度保持基本相同。

通過SDS-PAGE顯示的S-Glu和L-Glu兩種酶處理的時(shí)間進(jìn)程結(jié)果示于圖1。對(duì)于所述乳清樣本的20 hr消化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果，L-Glu的結(jié)果示于圖2，S-Glu的結(jié)果示于圖3。

乳清蛋白內(nèi)肽酶水解產(chǎn)物樣本中富含特定肽，利用上文詳述的LC/MS/MS對(duì)所述特定肽的種類和含量進(jìn)行確定。以下表1(a)和(b)以及表2(a)和(b)顯示由分別用L-Glu和S-Glu消化乳清樣本20 hr時(shí)，由肽數(shù)據(jù)的Mascot分析得到的數(shù)據(jù)。

表1(a)、(b)用L-Glu消化20 hr時(shí)乳清蛋白樣本的MS數(shù)據(jù)的Mascot分析結(jié)果。
(a)β-乳球蛋白 ＞gi|125910|sp|P02754|LACB_牛β-乳球蛋白前體(β-LG) gi|1070647|pir||LGBO β-乳球蛋白前體-牛 gi|669061(Z48305)β-乳球蛋白變體B前體(歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝19883] MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQRWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE KFDKALKALP MHIRLSFNPT QLEEQCHI ＞單同位素質(zhì)量＝19852 位置 序列(NCBI BLAST鏈接) 125-130NSAEPE ？？？ IQPTPE 62- 71LKPTPEGDLE 72- 78ILLQKWE 91- 101 KTKIPAVFKID 91- 105 KTKIPAVFKIDALNE 蛋白覆蓋率38/178＝21.3％(通過氨基酸計(jì)算)；4285/19852＝21.6％(通過質(zhì)譜) (b)κ-酪蛋白 ＞gi|2119400|pir||I45875 κ-酪蛋白前體-牛gi|162811(M36641)κ-酪蛋白前體(歐洲牛，Bostaurus)[MASS＝21225] MMKSFFLVVT ILALTLPFLG AQEQNQEQPI RCEKDERFFS DKIAKYIPIQ YVLSRYPSYG LNYYQQKPVA LINNQFLPYP YYAKPAAVRS PAQILQWQVL SNTVPAKSCQ AQPTTMARHP HPHLSFMAIP PKKNQDKTEI PTINTIASGE PTSTPTIEAV ESTVATLEAS PEVTESPPEI NTVQVTSTAV ＞單同位素質(zhì)量＝21193 位置 序列(NCBI BLAST鏈接) 127-139 MAIPPKKNQDKTE 162-168 STVATLE 180-190 INTVQVTSTAV 140-158 IPTINTIASGEPTSTPTIE 蛋白覆蓋率50/190＝26.3％(通過氨基酸計(jì)算)；5218/21193＝24.6％(通過質(zhì)譜)
表2(a)、(b)用S-Glu消化20hr時(shí)乳清蛋白樣本的MS數(shù)據(jù)的Mascot分析結(jié)果。
(a)β-酪蛋白 ＞gi|2136722|pir||I44963 β-酪蛋白A3-牛gi|1459292|bbs|140624(S67277)β-酪蛋白A3[牛，乳腺，肽，224aa](歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝21225] MKVLILACLV ALALARELEE LNVPGEIVES LSSSEESITR INKKIEKFQS EEQQQTEDEL QDKIHPFAQT QSLVYPFPGP IPNSLPQNIP PLTQTPVVVP PFLQPEVMGV SKVKEAMAPK QKEMPFPKYP VEPFTESQSL TLTDVENLHL PLPLLQSWMH QPHQPLPPTV MFPPQSVLSL SQSKVLPVPQ KAVPYPQRDM PIQAFLLYQE PVLGPVRGPF PIIV ＞單同位素質(zhì)量＝25064 位置 序列(NCBI BLAST鏈接) 116- 120 AMAPK 37- 46SITRINKKIE 137- 146 SQSLTLTDVE 58- 72DELQDKIHPFAQTQS 58- 71DELQDKIHPFAQTQ 21- 29LNVPGEIVE 147- 156 NLHLPLPLLQ 蛋白覆蓋率59/224＝26.3％(通過氨基酸計(jì)算)；6581/25064＝26.3％(通過質(zhì)譜) (b)β-乳球蛋白 ＞gi|125910|sp|P02754|LACB_牛β-乳球蛋白前體(β-LG) gi|107064|pir||LGBO β-乳球蛋白前體-牛 gi|669061(Z48305)β-乳球蛋白變體B前體(歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝19883] MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQKWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE KFDKALKALP MHIRLSFNPT QLEEQCHI ＞單同位素質(zhì)量＝19852 位置序列(NCBI BLAST鏈接) 125- 130 NSAEPE ？？？ IQPTPE 50- 60AQSAPLRVYVE 72- 78ILLQKWE 91- 105 KTKIPAVFKIDALNE 92- 105 TKIPAVFKIDALNE 蛋白覆蓋率39/178＝21.9％(通過氨基酸計(jì)算)；4419/19852＝22.3％(通過質(zhì)譜) 實(shí)施例2 利用內(nèi)肽酶S-Glu和L-Glu消化乳蛋白
方法將10g脫脂乳(兩個(gè)來源Berkeley Farms和Sunnyside)分別放置到8個(gè)15ml的試管中。在振蕩培養(yǎng)箱中將試管加熱到40℃，持續(xù)15分鐘。向試管(每種酶3支試管)中加入酶(S-Glu或L-Glu，500μl 3.8mg/ml的儲(chǔ)備溶液)。對(duì)每種脫脂乳各取一個(gè)試管作為對(duì)照試管，不加入任何酶。在上述條件下持續(xù)溫育指定長的時(shí)間。對(duì)于每種酶，分別在2hr、4hr、20hr移走一支處理試管。然后將試管進(jìn)行離心以分離沉淀物和上清。檢測(cè)上清液以測(cè)定TP(總蛋白)(g/l)、干固體％和粘度測(cè)量值。利用SDS-PAGE分析監(jiān)測(cè)內(nèi)肽酶的切割。根據(jù)上述詳述進(jìn)行質(zhì)譜分析，以確定所產(chǎn)生的切割產(chǎn)物的量和種類。還還使用所收集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)生成的肽進(jìn)行Mascot分析。

結(jié)果經(jīng)終濃度為0.19mg/g的S-Glu處理的兩個(gè)脫脂乳樣本在處理的2hr內(nèi)產(chǎn)生重粗凝乳。在酶處理2hr內(nèi)約有43％-57％的脫脂乳總蛋白發(fā)生沉淀。兩個(gè)來源的脫脂乳在4hr或20hr后均沒有觀察到上清總蛋白的進(jìn)一步明顯下降，因此沉淀基本完成。

與S-Glu不同，用L-Glu處理的樣本顯示脫脂乳蛋白的沉淀隨時(shí)間而提高。對(duì)于脫脂乳樣本I，L-Glu內(nèi)肽酶處理引起蛋白濃度在t＝2hr降低32％，4hr降低42％，20hr降低62％。在用L-Glu處理的脫脂乳樣本II中，TP濃度在t＝2hr降低11.5％，4hr降低41％，20hr降低51.7％。

從SDS-PAGE結(jié)果(圖3和4分別為脫脂乳I和脫脂乳II的結(jié)果)可以看出，內(nèi)肽酶L-Glu和S-Glu都能在2hr內(nèi)引起脫脂乳酪蛋白沉淀，并是酪蛋白水解以及乳球蛋白和乳白蛋白發(fā)生明顯的水解。

所述經(jīng)內(nèi)肽酶水解的脫脂乳樣本富含特異的肽，利用上文詳述的LC/MS/MS對(duì)肽種類和量進(jìn)行確定。以下表3(a)、(b)和(c)顯示由用L-Glu消化脫脂乳樣本I 20hr后，由肽數(shù)據(jù)的Mascot分析得到的數(shù)據(jù)。

表3(a)、(b)和(c)用L-Glu消化脫脂乳樣本I 20 hr后的MS數(shù)據(jù)進(jìn)行的Mascot分析結(jié)果。
(a)α-酪蛋白 ＞gi|115646|sp|P02662|CAS1_牛α-S1酪蛋白前體[MASS＝24529] MKLLILTCLV AVALARPKHP IKHQGLPQEV LNENLLRFFV APFPEVFGKE KVNELSKDIG SESTEDQAME DIKQMKAESI SSSEEIVPNS VEQKHIQKED VPSERYLGYL EQLLRLKKYK VPQLEIVPNS AEERLHSMKE GINAQQKEPM IGVNQELAYF YPELFRQFYQ LDAYPSGAWY YVPLGTQYTD APSFSDIPNP IGSENSEKTT MPLW ＞單同位素質(zhì)量＝24495 位置 序列(NCBI BLAST鏈接) 66- 70 DQAME 94- 99 KHIQKE 93- 99 QKHIQKE 141- 148 GIHAQQKE 30- 33 VLNE 46- 50 VFGKE 134- 140 RLHSMKE 71- 76 DIKQME 121- 125 VPQLE 149- 156 PMIGVNQE 141- 156 GIHAQQKEPMIGVNQE 40- 45 VAPFPE 116- 125 LKKYKVPQLE 105- 111 RYLGYLE 88- 91 PNSV 157- 163 LAYFYPE 39- 45 FVAPFPE 208- 214 KTTMPLW 164- 172 LFRQFYQLD 38- 45 FFVAPFPE 34- 39 NLLRFF 34- 45 NLLRFFVAPFPE 33- 45 ENLLRFFVAPFPE 蛋白覆蓋率106/214＝49.5％(通過氨基酸計(jì)算)；12767/24495＝52.1％(通過質(zhì)譜) (b)β-酪蛋白 ＞gi|2136722|pir|I4963 β-酪蛋白A3-牛 gi|459292|bbs|140624(S67277)β-酪蛋白A3[牛，乳腺，肽，224aa](歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝21225] MKVLILACLV ALALARELEE LNVPGEIVES LSSSEESITR INKKIEKFQS EEQQQTEDEL QBKIHPFAQT QSLVYPFPGP IPNSLPQNIP PLTQTPVVVP PFLQPEVMGV SKVKEAMAPK QKEMPFPKYP VIPFTRSQSL TLTDVENLHL PLPLLQSWMH QPHQPLPPTV MFPPQSVLSL SQSKVLPVPQ KAVPYPQRDM PIQAFLLYQE PVLGPVRGPF PIIV ＞單同位素質(zhì)量＝25064 位置序列(NCBI BLAST鏈接) 47- 52 KFQSEE 133- 136 PFTE 107- 115 VMGVSKVKE 21- 26 LNVPGE 37- 46 SITRINKKIE 20- 26 ELNVPGE 60- 72 LQDKIHPFAQTQS 63- 73 KIHPFAQTQSL 60- 73 LQDKIHPFAQTQSL 124- 132 MPFPKYPVE 123- 132 EMPFPKYPVE 126- 136 FPKYPVEPFTE 124- 136 MPFPKYPVEPFTE 123- 136 EMPFPKYPVEPFTE 蛋白覆蓋率60/224＝26.8％(通過氨基酸計(jì)算)；6925/25064＝27.6％(通過質(zhì)譜) 表3(c)β-乳球蛋白 ＞gi|125910|sp|P02754|LACB_牛β-乳球蛋白前體(β-LG) gi|107064|pir||LGB0 β-乳球蛋白前體-牛 gi|1669061(Z48305)β-乳球蛋白變體B前體(歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝19883] MKCLLLALAL TCGAQALIVT QTMKGLDIQK VAGTWYSLAM AASDISLLDA QSAPLRVYVE ELKPTPEGDL EILLQKWENG ECAQKKIIAE KTKIPAVFKI DALNENKVLV LDTDYKKYLL FCMENSAEPE QSLACQCLVR TPEVDDEALE KFDKALKALP MMIRLSFNPT QLEEQCHI ＞單同位素質(zhì)量＝19852 位置 序列 (NCBI BLAST鏈接) 125- 130 NSAEPE 72- 78 ILLQKWE 151- 164 KFDKALKALPMHIR 165- 173 LSFNPTQLE 91- 105 KTKIPAVFKIDALNE 161- 173 MHIRLSFNPTQLE 159- 173 LPMHIRLSFNPTQLE 158- 173 ALPMHIRLSFNPTQLE 蛋白覆蓋率51/178＝28.7％(通過氨基酸計(jì)算)；5884/19852＝29.6％(通過質(zhì)譜)
類似地，以下表4分別顯示用S-Glu(表4(a))、L-Glu(表4(b)和4(c))消化脫脂乳樣本II 20hr后的肽數(shù)據(jù)的Mascot分析數(shù)據(jù)。

表4(a)、(b)和(c)用內(nèi)肽酶消化脫脂乳樣本II 20hr后的MS數(shù)據(jù)的Mascot分析。
(a)S-Glu 消化α-酪蛋白 ＞gi|115646|sp|P02662|CAS1_牛α-S1酪蛋白前體[MASS＝24529] MKLLILTCLV AVALARPKHP IKKQGLPQEV LNENLLRFFV APFPEVFGKE KVNELSKDIG SESTEDQAME DIKQMEAESI SSSEEIVPNS VEQKHIQKED VPSERYLGYL EQLLRLKKYK VPQLEIVPNS AEERLNSMKE GIHAQQKEPM IGVNOELAYF YPELFRQFYQ LDAYPSGAWY YVPLGTQYTD APSFSDIPNP IGSENSEKTT MPLW ＞單同位素質(zhì)量＝24495 位置序列(NCBI BLAST鏈接) 66- 70DQAME 66- 71DQAMED 65- 71EDQAMED 3D- 33VLNE 135- 140 LHSMKE 77- 90AESISSSEEIVPNS 46- 50VFGKE 71- 76DIKQME 93- 104 QKHIQKEDVPSE 92- 104 EQKHIQKEDVPSE 46- 54VFGKEKVNE 18- 29KHPIKHQGLPQE 141- 156 GIHAQQKEPMIGVNQE 66- 76DQAMEDIKQME 158- 163 AYFYPE 106- 111 YLGYLE 157- 163 LAYFYPE 39- 45FVAPFPE 209- 214 TTMPLW 38- 45FFVAPFPE 35- 45LLRFFVAPFPE 34- 45NLLRFFVAPFPE 33- 45ENLLRFFVAPFPE 蛋白覆蓋率117/214＝54.7％(通過氨基酸計(jì)算)；13570/24495＝55.4％(通過質(zhì)譜) 表4(b)L-Glu消化β-酪蛋白 ＞gi|2136722|pir|I4963β-酪蛋白A3-牛 gi|459292|bbs|140624(S67277)β-酪蛋白A3[牛，乳腺，肽，224aa](歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝21225] MKVLILACLV ALALARELEE LNVPGEIVES LSSSEESITR INKKIEKFQS EEQQQTEDEL QDKINPFAQT QSLVYPFPGP IPNSLPQNIP PLTQTPVVVP PFLQPEVMGV SKVKEAMAPK QKEMPEPKYP VEPFTESQSL TLTDVENLML PLPLLQSWMH QPHQPLPPTV MFPPQSVLSL SQSKVLPVPQ KAVPYPQRDM PIQAFLLYQE PVLGPVRGPF PIIV ＞單同位素質(zhì)量＝25064 位置 序列 (NCBI BLAST鏈接) 17-20ELEE 37-46SITRINKKIE 37-47SITRINKKIEK 58-71DELQDKIHPFAQTQ 139- 146 SLTLTDVE 21-29LNVPGEIVE 58-67DELQDKIHPF 123- 136 EMPFPKYPVEPFTE 147- 156 NLHLPLPLLQ 蛋白覆蓋率70/224＝31.3％(通過氨基酸計(jì)算)；8101/25064＝32.3％(通過質(zhì)譜) 表4(c)L-Glu消化 ＞gi|115646|sp|P02663|CAS2_牛α-S2酪蛋白前體gi|476486|pir||KABOS2α-S2酪蛋白前體-牛gi|162929(M1664)α-S2樣酪蛋白前體(歐洲牛，Bos taurus)[MASS＝26019] MKFFIFTCLL AVALAKNTME HVSSSEESII SQETYKQEKN MAINPSKENL CSTFCKEVVR NANEEEYSIG SSSEESAEVA TEEVKITVDD KHYQKALNEI NQFYQKFPQY LQYLYQGPIV LNPWDQVKRN AVPITPTLNR EQLSTSEENS RRTVDMESTE VFTKRTKLTE KEKNRLNPLK KISQRYQKFA LPQYLKTVYQ HQKAMKPWIQ PKTKVIPYVR YL ＞單同位素質(zhì)量＝25984 位置 序列(NCBI BLAST鏈接) 34- 38TYKQE 79- 83VATEE 58- 65VVRNANEE 161- 171 VFTKKTKLTEE 161- 172 VFTKKTKLTEEE 84- 99VKITVDDKHYQKALNE 130- 141 NAVPITPTLNRE 蛋白覆蓋率58/222＝26.1％(通過氨基酸計(jì)算)；6711/25984＝25.8％(通過質(zhì)譜) 實(shí)施例3 利用內(nèi)肽酶活性消化酪蛋白
方法將10g酪蛋白粉(Sigma，Catalog#C-5890)混合到50ml 1M磷酸緩沖液(pH 6.5)和200ml溫水中。將內(nèi)容物加熱至酪蛋白溶解至緩沖液中。將所述酪蛋白溶液在該溫度下保持5分鐘。然后將酪蛋白溶液冷卻至室溫，并調(diào)整至500ml的終體積。將該酪蛋白溶液分別放置到8個(gè)15ml試管中(每個(gè)試管10ml溶液)，并在振蕩培養(yǎng)箱中溫?zé)嶂?0℃，保持15分鐘。每3個(gè)試管為一組，分別加入內(nèi)肽酶S-Glu或L-Glu(500μl 3.8mg/ml儲(chǔ)備液)。每組分別有一個(gè)不加酶的試管作為對(duì)照。在t＝2hr、4hr和20hr取出樣本管，冷卻并離心，以分離沉淀物和上清。檢測(cè)上清以測(cè)定TP(總蛋白，g/l)，干固體％和粘度測(cè)量值。還利用SDS-PAGE通過電泳分析上清，從而監(jiān)測(cè)水解。進(jìn)行質(zhì)譜(MS)分析，以確定各蛋白水解切割產(chǎn)物的存在。然后，將MS分析結(jié)果用于Mascot程序，該程序可以將肽消化片段用作唯一數(shù)據(jù)，通過利用公共數(shù)據(jù)庫(例如國家生物技術(shù)信息中心維護(hù)的公共數(shù)據(jù)庫)來鑒定源蛋白及其原始序列。關(guān)于Mascot及其前身Mowse的更多信息見于互聯(lián)網(wǎng)，例如由Matrix Science Inc.(Boston，MA)維護(hù)的網(wǎng)址(www.matrixscience.com)。
結(jié)果
用濃度為0.19mg酶/g酪蛋白溶液的內(nèi)肽酶處理被緩沖的酪蛋白溶液(16.85g/l)，用S-Glu在2hr內(nèi)沉淀58％的酪蛋白。然而，由于隨時(shí)間而發(fā)生進(jìn)一步的水解，有些沉淀的酪蛋白復(fù)溶。因此，4hr和20hr后沉淀蛋白的濃度分別為53％和49％。用L-Glu處理產(chǎn)生的沉淀酪蛋白隨檢測(cè)時(shí)間而增加。在2hr，32.5％的總蛋白(TP)從酪蛋白溶液中分離。該數(shù)值在4hr增加至34％，在20hr，分離出的總蛋白為54.2％。圖6顯示酪蛋白消化的SDS-PAGE分析結(jié)果。

分別使用L-Glu和S-Glu消化20hr后，酪蛋白消化物的Mascot分析結(jié)果分別示于下表5和6中。
表5用L-Glu內(nèi)肽酶消化α-酪蛋白20hr ＞gi|115646|sp|P02662|CAS1_牛α-S1酪蛋白前體[MASS＝24529] MKLLILTCLV AVALARPKHP IKHQGLPQEV LNENLLRFFV APFPEVFGKE KVNELSKDIG SESTEDQAME DIEQMEAESI SSSEEIVPNS VEQKHIQKED VPSERYLGYL EQLLRLHKYK VPQLEIVPNS AEERLHSMKE GIRAQQKEPM IGVNQELAYF YPELFRQFYQ LDAYPSGAWY YVPLGTQYTD APSFSDIPNP IGSENSEKTT MDLW ＞單同位素質(zhì)量＝24495 位置 序列(NCBI BLAST鏈接) 66- 70 DQAME 141- 148 GIHAQQKE 30- 33 VLNE 46- 50 VFGKE 134- 140 RLHSMKE 71- 76 DIKQME 18- 29 KHPIKHQGLPQE 16- 29 RPKHPIKHQGLPQE 149- 156 PMIGVNQE 141- 156 GIHAQQKEPMIGVNQE 105- 111 RYLGYLE 157- 163 LAYFYPE 39- 45 FVAPFPE 208- 214 KTTMPLW 164- 172 LFRQFYQLD 38- 45 FFVAPFPE 34- 45 NLLRFFVAPFPE 33- 45 ENLLRFFVAPFPE 蛋白覆蓋率99/214＝46.3％(通過氨基酸計(jì)算)；11898/24495＝48.68％(通過質(zhì)譜) 表6用S-Glu內(nèi)肽酶消化α-酪蛋白20hr ＞gi|115646|sp|P02662|CAS1_牛α-S1酪蛋白前體[MASS＝24529] MKLLILTCLV AVALARPKHP IKHQGLPQEV LNENLLRFFV APEPEVFGKE KVNELSKDIG SESTEDQAME DIKQMEAESI SSSEEIVPNS VEQKHIQKED VPSERYLGYL EQLLRLKKYK VPQLEIVPNS AEERLMSMKE GIMAQQMEPM IGVNQELAYF YPELFRQFYQ LDAYPSGAWY YVPLGTQYTD APSFSDIPNP IGSENSEKTT MPLW ＞單同位素質(zhì)量＝24495 位置序列(NCBI BLAST鏈接) 66- 70DQAME 66- 71DQAMED 30- 33VLNE 126- 133 IVPNSAEE 46- 50VFGKE 71- 76DIKQME 133- 140 ERLHSMKE 46- 54VFGKEKVNE 18- 29KHPIKHQGLPQE 141- 156 GIHAQQKEPMIGVNQE 66- 76DQAMEDIKQME 158- 163 AYFYPE 134- 163 RLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPE 106- 111 YLGYLE 106- 112 YLGYLEQ 157- 163 LAYFYPE 39- 45FVAPFPE 209- 214 TTMPLW 38- 45FFVAPFPE 35- 45LLRFFVAPFPE 34- 45NLLRFFVAPFPE 33- 45ENLLRFFVAPFPE 28- 56QEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELS 蛋白覆蓋率101/214＝47.2％(通過氨基酸計(jì)算)；11787/24495＝48.1％(通過質(zhì)譜)
本說明書通篇引用了多種出版物，包括專利、公開的專利申請(qǐng)、技術(shù)文章和學(xué)術(shù)文章。出于各種目的，這些引用的出版物均通過引用方式全文并入本文。
權(quán)利要求
1.水解產(chǎn)物，其包含由至少一種蛋白水解酶水解的至少一種乳蛋白，所述蛋白水解酶優(yōu)選在谷氨酸或天門冬氨酸殘基位置進(jìn)行切割，所述水解產(chǎn)物在易于對(duì)所述蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。
2.如權(quán)利要求1所述的水解產(chǎn)物，其中所述至少一種蛋白水解酶為內(nèi)肽酶。
3.如權(quán)利要求2所述的水解產(chǎn)物，其中所述內(nèi)肽酶優(yōu)選在谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。
4.如權(quán)利要求3所述的水解產(chǎn)物，其中所述內(nèi)肽酶為UniProtKB/Swiss-Prot原始登錄號(hào)P39790或P80057。
5.如權(quán)利要求4所述的水解產(chǎn)物，其中所述內(nèi)肽酶在谷氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。
6.如權(quán)利要求5所述的水解產(chǎn)物，其中所述內(nèi)肽酶受苯甲基磺酰氟或二異丙基氟磷酸酯抑制。
7.如權(quán)利要求4所述的水解產(chǎn)物，其中所述內(nèi)肽酶來自鏈霉菌、葡萄球菌或桿菌。
8.如權(quán)利要求1所述的水解產(chǎn)物，其中所述蛋白為可溶的非膠束蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述的水解產(chǎn)物，其中所述蛋白為乳清蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的水解產(chǎn)物，其中所述蛋白包含乳白蛋白或乳球蛋白中的至少一種。
11.如權(quán)利要求10所述的水解產(chǎn)物，其中所述蛋白為α-乳白蛋白或β-乳球蛋白中的至少一種。
12.如權(quán)利要求11所述的水解產(chǎn)物，其中所述蛋白包含β-乳球蛋白，所述水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。
13.如權(quán)利要求1所述的水解產(chǎn)物，與未水解的所述蛋白相比，所述水解產(chǎn)物富含以谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基為末端的肽。
14.如權(quán)利要求10所述的水解產(chǎn)物，其富含以下肽中的一種或多種ELEE(SEQ ID NO5)、VATEE(SEQ ID NO6)、PFTE(SEQ ID NO7)、NSAEPE(SEQ ID NO8)、VFGKE(SEQ ID NO9)、ASQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)、IQPTPE(SEQ ID NO10)、LKPTPE(SEQ ID NO11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO15)。
15.如權(quán)利要求13所述的水解產(chǎn)物，其富含以下肽中的一種或多種DQAME(SEQ ID NO16)、GIHAQQKE(SEQ ID NO17)、VLNE(SEQ IDNO18)、VFGKE(SEQ ID NO19)、RLHSMKE(SEQ ID NO20)、DIKQME(SEQ ID NO21)、KHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO22)、RPKHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO23)、PMIGVNQE(SEQ ID NO24)、GIHAQQKEPMEGVNQE(SEQ ID NO25)、RYLGYLE(SEQ ID NO26)、LAYFYPE(SEQ ID NO27)、FVAPFPE(SEQ ID NO28)、KTTMPLW(SEQID NO29)、LFRQFYQLD(SEQ ID NO30)、FFVAPFPE(SEQ ID NO31)、NLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO32)或ENLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO33)。
16.包含乳清蛋白的水解產(chǎn)物，其富含以下肽中的一種或多種ELEE(SEQ ID NO5)、VATEE(SEQ ID NO6)、PFTE(SEQ ID NO7)、NSAEPE(SEQ ID NO8)、VFGKE(SEQ ID NO9)、ASQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)、IQPTPE(SEQ ID NO10)、LKPTPE(SEQ ID NO11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO12)、LKPTPEGDLE(SEQ IDNO13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO15)；且所述水解產(chǎn)物在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。
17.如權(quán)利要求16所述的含乳清蛋白的水解產(chǎn)物，其富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)。
18.如權(quán)利要求16所述的含乳清蛋白的水解產(chǎn)物，其通過使用內(nèi)肽酶而獲得，所述內(nèi)肽酶優(yōu)選在谷氨酸殘基或天門冬氨酸殘基的羧基端進(jìn)行切割。
19.如權(quán)利要求18所述的含乳清蛋白的水解產(chǎn)物，其中所述內(nèi)肽酶的活性不需要金屬離子。
20.包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的食品成分，其中所述乳清蛋白水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)；所述食品成分在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。
21.包含乳清蛋白水解產(chǎn)物的加工食品，其中所述乳清蛋白水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)、或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)；所述加工食品在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。
22.如權(quán)利要求19的加工食品，其是嬰兒配方食品、運(yùn)動(dòng)飲品、含干酪的產(chǎn)品、蛋白補(bǔ)充劑、營養(yǎng)補(bǔ)充劑或膳食替代品。
23.包含權(quán)利要求1所述水解產(chǎn)物的非食物產(chǎn)品，其中所述非食物產(chǎn)品為人類皮膚用的化妝品、洗劑或清潔劑。
24.如權(quán)利要求23所述的非食物產(chǎn)品，其中，該產(chǎn)品包含的所述乳清蛋白水解產(chǎn)物富含以下肽中的一種或多種AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO1)、ILLQKWE(SEQ ID NO2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO4)；且所述非食物產(chǎn)品在易于對(duì)一種或多種乳清蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)具有降低的免疫原性。
25.包含至少兩種權(quán)利要求1所述的水解產(chǎn)物的組合物，其中所述每種水解產(chǎn)物均由特異性不同的至少一種不同的酶產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明提供了水解產(chǎn)物組合物，其包含被至少一種蛋白水解酶水解的至少一種乳蛋白或乳清蛋白。所述水解產(chǎn)物降低了乳蛋白或乳清蛋白在易于對(duì)所述蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)的受試者體內(nèi)的免疫原性。本發(fā)明還提供了所述組合物的制備方法，以及包含所述組合物的食品和非食品。
文檔編號(hào)A23C21/02GK101594785SQ200780047281
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2007年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月20日
發(fā)明者馬諾耶·庫馬爾, 大衛(wèi)·王 申請(qǐng)人:丹尼斯科有限公司