專利名稱：產(chǎn)生酪蛋白水解物的方法
產(chǎn)生酪蛋白水解物的方法涉及序列表本申請(qǐng)含有計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，所述計(jì)算機(jī)可讀形式通過提述并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用微生物內(nèi)肽酶產(chǎn)生酪蛋白水解物的方法。
背景技術(shù)：
酪蛋白用于(例如，運(yùn)動(dòng)飲料中的)蛋白質(zhì)強(qiáng)化(protein fortification), 以及用于其他膳食飲料(dietary drink)、干混飲料(dry blended beaverage)、營(yíng)養(yǎng)條 (nutritional bar)、嬰兒配方(infant formula)等中。在一些情況下，發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解 物的過敏原性(allergenic)比乳清蛋白水解物低，這使得它們?cè)?，例如，嬰兒配方中可?更加有用?？墒褂玫鞍姿饷杆饫业鞍讈碇苽淅业鞍姿馕?。在酪蛋白水解物的工業(yè) 生產(chǎn)中，所述水解蛋白的高溶解度或可懸浮性無論從加工的角度，單純產(chǎn)量/經(jīng)濟(jì)(yield/ economical)的角度而言，還是口感和感覺特點(diǎn)(sensory attribute)而言都是重要的。因 此，對(duì)本發(fā)明人來說一個(gè)目的是鑒定對(duì)于制備具有高溶解度(如在低PH具有高溶解度和/ 或在低或中等水解度具有高溶解度)的酪蛋白水解物有用的蛋白水解酶。之前已經(jīng)描述了發(fā)現(xiàn)可適用于本發(fā)明的內(nèi)肽酶。例如，來源于擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)菌種NRRL 18262的內(nèi)肽酶公開于WO 88/03947 (其中，該菌株稱為擬諾 卡氏菌屬菌種菌株10R)以及WO 01/58276。其他相關(guān)的根據(jù)本發(fā)明有用的內(nèi)肽酶公開于 W088/03947、W004/111220、W004/111222、W004/111223、W005/123911 和 W004/072279。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人鑒定了下述內(nèi)肽酶，其被發(fā)現(xiàn)適用于制備具有高溶解度并得到均一懸浮 物的酪蛋白水解物。所述內(nèi)肽酶與本領(lǐng)域使用的其他內(nèi)肽酶相比，當(dāng)以等量的酶蛋白相比 時(shí)更加有效，這導(dǎo)致酪蛋白水解物生產(chǎn)者的產(chǎn)物更經(jīng)濟(jì)。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生酪蛋白水解 物的方法，包括a)將與SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的內(nèi)肽酶添加至包含酪蛋白的 組合物；和b)溫育以水解所述酪蛋白。發(fā)明詳述內(nèi)肽酶本文中所使用的術(shù)語內(nèi)肽酶是水解內(nèi)肽鍵(internal peptide bond)的酶(具有 內(nèi)肽酶活性)。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明使用的內(nèi)肽酶的來源并無限制。因此，術(shù)語內(nèi)肽酶不僅包括天然 或野生型的內(nèi)肽酶，還包括其顯示內(nèi)肽酶活性的任何突變體、變體、片段等，以及合成的內(nèi) 肽酶，如經(jīng)改組的內(nèi)肽酶?？扇绫绢I(lǐng)域所公知的制備經(jīng)遺傳工程改造的內(nèi)肽酶變體，例如， 通過定點(diǎn)誘變，通過PCR (使用包含所需突變的PCR片段作為所述PCR反應(yīng)中的引物之一)， 或通過隨機(jī)誘變。內(nèi)肽酶變體的實(shí)例，如用于本上下文中，是其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被缺 失、插入或以其他氨基酸取代的內(nèi)肽酶。
根據(jù)本發(fā)明使用的內(nèi)肽酶的實(shí)例是(i)來源于擬諾卡氏菌菌種NRRL 18262的內(nèi)肽酶，其公開于W001/58276，其序列 如本申請(qǐng)文件的SEQ ID NO 1所示；(ii)與⑴的內(nèi)肽酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%氨基酸 同一性的內(nèi)肽酶；(iii)⑴或(ii)的內(nèi)肽酶顯示內(nèi)肽酶活性的突變體、變體或片段。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列的比對(duì)可以通過使用EMBOSS程序包(http:// emboss, org)版本 2. 8. 0 的 Needle 程序來確定。Needle 程序執(zhí)行 Needleman，S. B.和 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48，443-453 中描述的全局比對(duì)算法(global alignment algorithm)。使用的取代矩陣是 BL0SUM62，缺口產(chǎn)生罰分(gap opening penalty)是 10， 并且缺口延伸罰分(gap extension penalty)是 0· 5。兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度這樣計(jì)算，用兩個(gè)序列的比對(duì)中的精確匹配的 數(shù)目除以兩個(gè)序列中最短序列的長(zhǎng)度。結(jié)果以百分比同一性表示。當(dāng)兩個(gè)序列在重疊的相同位置具有相同的氨基酸殘基時(shí)，出現(xiàn)精確匹配。序列的 長(zhǎng)度為序列中的氨基酸殘基的數(shù)目(例如SEQ ID NO :1的長(zhǎng)度是188)。作為可適用于本發(fā)明的細(xì)菌內(nèi)肽酶的實(shí)例，還可提及的是W088/03947中 公開的來自白擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alba)(先前為達(dá)松維爾擬諾卡氏菌 (Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的內(nèi)肽酶；來自達(dá)松維爾擬諾卡氏菌達(dá)松維 爾亞種(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)DSM 43235、白擬諾卡氏菌 DSM 15647、擬諾卡氏菌屬菌種DSM 164M的內(nèi)肽酶和合成的蛋白酶22，全部四種公開于 W004/111220 中；W004/111222 中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌(Nocardiopsis prasina) DSM 15648的內(nèi)肽酶；W004/111223中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌DSM 15649的內(nèi)肽酶； 來自蔥綠擬諾卡氏菌(先前為白擬諾卡氏菌)DSM 14010、嗜堿擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM44657 和盧森坦擬諾卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048 的 內(nèi)肽酶，全部三種公開于 W005/123911 中；來自 Brachysporiella gayana CGMCC 0865、綠 僵菌(Metarhizium anisopliae)、粘帚酶屬菌種(Gliocladium sp.)CBS 114001、黑團(tuán)孢 屬菌種(Periconia sp.)CBS 114002、黑團(tuán)孢屬菌種 CBS 114000 和新月彎孢(Curvularia lunata)CBS 114003的內(nèi)肽酶，全部六種公開于W004/072279中；以及這些顯示內(nèi)肽酶活性 的突變體、變體或片段。根據(jù)本發(fā)明使用的內(nèi)肽酶是微生物內(nèi)肽酶，優(yōu)選細(xì)菌內(nèi)肽酶，術(shù)語“細(xì)菌的 (bacterial) ”表明所述內(nèi)肽酶衍生自或起源于細(xì)菌，或是源自細(xì)菌的類似物、片段、變體、 突變體或合成內(nèi)肽酶。其可在原始野生型細(xì)菌菌株中、在另一微生物菌株中或在植物中產(chǎn) 生或表達(dá)；即所述術(shù)語涵蓋野生型、天然存在的內(nèi)肽酶的表達(dá)，以及重組內(nèi)肽酶、遺傳工程 內(nèi)肽酶或合成內(nèi)肽酶在任何宿主中的表達(dá)。在本發(fā)明的方法中，內(nèi)肽酶可以是純化的。術(shù)語“純化的”用于本文包括富集了 所述酶蛋白的酶蛋白制備物。上述富集可為，例如，去除了產(chǎn)生胞外酶蛋白的生物的細(xì)胞， 通過蛋白質(zhì)特異性沉淀去除非蛋白物質(zhì)，或使用色譜法，其中所述酶蛋白被選擇性吸附并 從色譜基質(zhì)中洗脫。所述內(nèi)肽酶可經(jīng)純化至這樣的程度使得僅僅存在少量的其他蛋白 質(zhì)。表述“其他蛋白質(zhì)”具體而言指其他酶。用于本發(fā)明方法的內(nèi)肽酶可為“基本上純的(essentially pure) ”，即，基本上不含來自產(chǎn)生它的生物的其他組分，所述生物可為天然 存在的微生物，或經(jīng)遺傳修飾的供重組產(chǎn)生所述內(nèi)肽酶的宿主微生物。然而，對(duì)于本發(fā)明的使用，內(nèi)肽酶不需要那么純。其可以例如包括其他酶，甚至其 他內(nèi)肽酶。在一個(gè)優(yōu)選方面，用于本發(fā)明方法的內(nèi)肽酶經(jīng)純化以含有總蛋白質(zhì)中至少20%、 優(yōu)選至少30%、至少40%或至少50% (w/w)的所述內(nèi)肽酶。內(nèi)肽酶的量可由制備物活性測(cè) 量值除以所述內(nèi)肽酶的比活性(活性/mg EP)來計(jì)算，或可通過SDS-PAGE或本領(lǐng)域已知的 任何其他方法來量化?？偟鞍踪|(zhì)的量可(例如)通過氨基酸分析來測(cè)定。本發(fā)明的內(nèi)肽酶的使用可以與其他酶(例如其他蛋白酶)的使用組合。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，將內(nèi)肽酶，例如源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262的內(nèi)肽酶，與外肽酶 組合，或與具有外肽酶活性的蛋白酶制備物組合，例如源自米曲霉(Aspergillus oryzae) 的蛋白Bl制備物，如 W094/25580 中所述,如 Flavourzyme (Novozymes A/S, Denmark)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)通過對(duì)酪蛋白的水解和后續(xù)的TCA可溶性肽與鄰苯二 醛(o-phthaldialdehyde)及2_巰基乙醇的反應(yīng)，然后測(cè)量所得復(fù)合物在340nm的吸光度 來進(jìn)行測(cè)定時(shí)，用于本發(fā)明的內(nèi)肽酶具有接近中性的PH-活性最優(yōu)值(最適pH)。術(shù)語pH活性最優(yōu)值接近中性可意為所述內(nèi)肽酶具有PH 5.5-11，優(yōu)選pH7_l 1，更 優(yōu)選PH 8-11，甚至更優(yōu)選pH 9.5-10.5的區(qū)間中，且最優(yōu)選在大約pH 10的最適pH。在另一具體實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的內(nèi)肽酶是熱穩(wěn)定的。術(shù)語熱穩(wěn)定可意為，當(dāng)如上所述通過酪蛋白水解確定時(shí)，在pH 9的最適溫度為至 少50°C或至少55°C，優(yōu)選至少60°C，更優(yōu)選至少65°C，且甚至更優(yōu)選至少67 V，如約70°C。酪蛋白水解物在本發(fā)明的上下文中，酪蛋白是奶中主要的蛋白質(zhì)組，其可構(gòu)成奶和奶酪中所 有蛋白質(zhì)的75-80%。酪蛋白的可溶性形式可由酸和/或由干胃膜(rennet)來凝結(jié) (coagulate)。 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酪蛋白來自牛奶。用于本發(fā)明方法的酪蛋白可為，例如，酪蛋白酸鈉、酪蛋白酸鉀或酪蛋白酸鈣的形 式。在本發(fā)明方法中，所述酪蛋白物質(zhì)通常在水中混合或分散以形成漿料，其包含按 重量計(jì)約1 %到約25%的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿料可包含按重量計(jì)約1 %到約 5%的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿料可包含按重量計(jì)約6%到約10%的蛋白質(zhì)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述漿料可包含按重量計(jì)約11%到約15%的蛋白質(zhì)。還在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述漿料可包含按重量計(jì)約16%到約20%的蛋白質(zhì)。還在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述漿料可包含按重量計(jì)約21%到約25%的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述漿料按 重量計(jì)可包含約5%到約25%的蛋白質(zhì)。在將所述蛋白質(zhì)物質(zhì)分散于水中后，可調(diào)整所述蛋白質(zhì)漿料的pH和/或溫度從而 優(yōu)化水解反應(yīng)，特別是保證用于所述水解反應(yīng)的內(nèi)肽酶的功能接近其最優(yōu)活性水平。所述 蛋白質(zhì)漿料的PH可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行調(diào)整并監(jiān)測(cè)。所述蛋白質(zhì)漿料的pH可調(diào)整 至約5到約10。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)漿料的pH可調(diào)整至約6到約9。在一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)漿料的PH可調(diào)整至約6. 5到約8。所述蛋白質(zhì)漿料的pH可在水解反應(yīng)過程中保持在上述水平，或可允許隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行而減少。在水解反應(yīng)過程中根 據(jù)本領(lǐng)域公知的方法將所述蛋白質(zhì)漿料的溫度優(yōu)選地調(diào)整并維持在約45°C到約70°C。在 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在水解反應(yīng)過程中可將所述蛋白質(zhì)漿料的溫度調(diào)整并維持在約63°C 到約70°C。一般而言，高于該范圍的溫度可能使所述內(nèi)肽酶失活，而低于或高于該范圍的溫 度會(huì)降低(slow)所述內(nèi)肽酶的活性。所述水解反應(yīng)通常通過將所述內(nèi)肽酶添加到蛋白質(zhì)物質(zhì)的漿料來起始。或者，所 述酶可分散于水中，并一邊攪拌一邊緩慢添加所述蛋白質(zhì)物質(zhì)。在制備濃縮的蛋白質(zhì)漿料 以避免粘度過高時(shí)，后一方法可為有利的。優(yōu)選地，用于本發(fā)明方法的內(nèi)肽酶量是每kg酪蛋白約0. 005到約100AU(定義如 下)，優(yōu)選每kg酪蛋白約0. 01到約50AU，更優(yōu)選每kg酪蛋白約0. 02到約30AU。一個(gè)Anson單位(AU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(S卩，25°C，pH7. 5和10分鐘反應(yīng)時(shí)間) 以下述初始速率消化血紅蛋白的酶量，所述速率使得每分鐘釋放的TCA可溶性產(chǎn)物的量與 一毫當(dāng)量的酪氨酸在與酚試劑作用時(shí)得到相同的顏色。當(dāng)確定AU活性時(shí)，血紅蛋白的濃度 可優(yōu)選為約1.3%。添加至蛋白質(zhì)物質(zhì)的內(nèi)肽酶的量能夠且會(huì)依賴于所述蛋白質(zhì)物質(zhì)的來源、所需的 水解程度和水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間而變化。內(nèi)肽酶的量的范圍可為每千克酪蛋白約Img酶蛋 白到約5000mg酶蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述量的范圍可為每千克酪蛋白Img酶蛋 白到約IOOOmg酶蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述量的范圍可為每千克酪蛋白約5mg 酶蛋白到約500mg酶蛋白。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，水解反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間能夠且會(huì)變化。一般而言，水解 反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間的范圍可為幾分鐘到許多小時(shí)，如約30分鐘到約48小時(shí)。優(yōu)選地，用內(nèi)肽酶處理具有約0. 1 %到約20 %，更優(yōu)選約0. 5 %到約10 %，或約 0. 5%到約8%，甚至更優(yōu)選約2%到約8%的水解度(DH)的酪蛋白水解物。水解度(DH)表示通過所述方法獲得的蛋白質(zhì)水解的程度。在本發(fā)明的上下文中， 水解度(DH)定義如下DH =(被切割的肽鍵的數(shù)目/肽鍵總數(shù))χ100%本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何測(cè)量DH。其可，例如，使用如Adler-Nissen，J.，1986， Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins，第 5 章，第 122-1M 頁所述的方法進(jìn)行。在完成步驟b)之后，可將所述內(nèi)肽酶失活。上述失活可通過本領(lǐng)域任何抑制方法 進(jìn)行，例如，通過加熱至至少75°C，如至少80°C或至少85°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法進(jìn)一步包含用一種或多種另外的具有蛋白酶活性 的酶處理所述酪蛋白組合物。上述另外的蛋白水解酶可為一種或多種內(nèi)肽酶和/或一種或 多種外肽酶。所述一種或多種外肽酶可為，例如，一種或多種氨肽酶和/或一種或多種羧肽 酶。用具有與SEQ ID NO=I至少50%的同一性的內(nèi)肽酶進(jìn)行溫育，和用一種或多種另 外的具有蛋白酶活性的酶進(jìn)行溫育可不同時(shí)進(jìn)行。即，如果所述蛋白水解酶并不在相同的 PH和/或相同的溫度下起作用，則可將所述酪蛋白組合物先與一種(或多種)蛋白水解酶 溫育，然后是任選地調(diào)整PH和/或溫度和隨后與其他蛋白水解酶溫育。當(dāng)使用一種或多種另外的具有蛋白酶活性的酶時(shí)，所得的酪蛋白水解物可具有高于上面所示的水解度(DH)。其可，例如，具有約5-25%的水解度。由本發(fā)明方法獲得的酪蛋白水解物可用于食品，例如，飲料。本發(fā)明的食品可為任 何意欲供人食用的產(chǎn)物。上述食品的非限制性實(shí)例包括營(yíng)養(yǎng)條、干混飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、能量 飲料(energy drink)和嬰兒配方。通過本發(fā)明方法獲得的酪蛋白水解物還可用于臨床營(yíng) 養(yǎng)(clinical nutrition)，例如，在醫(yī)院中。實(shí)施例用來自擬諾卡氏菌菌種NRRL18262具有SEQ ID NO 1所示的序列的內(nèi)肽酶和 Alcalase 2. 4L(Novozymes A/S, Denmark)水解酪蛋白酸鈉的比較。用蛋白酶水解蛋白質(zhì)制備來自 Arla Foods，Denmark 的酪蛋白酸鈉，Miprodan 30，88%蛋白質(zhì)15g+285g 水。將所述酪蛋白酸(鹽)產(chǎn)物用脫礦物質(zhì)水(demineralised water) (Milli Q)懸 浮為5%W/v懸液。將水加熱至60°C，并將所述蛋白質(zhì)添加至所述Milli Q水中同時(shí)在混 合器(blender)中攪拌1_2分鐘，或直至所述蛋白質(zhì)懸浮或溶解。pH 調(diào)整將pH用4N NaOH調(diào)整為8. 0，并在水解反應(yīng)過程中保持。酶劑量將所述擬諾卡氏菌屬蛋白酶和Alcalase 2. 4L以10、50和IOOmg酶蛋白(印)/kg 蛋白質(zhì)劑量添加。在操作時(shí)將酶儲(chǔ)存于冰上。酶處理溫度60°C+/_1°C時(shí)間120分鐘在磁攪拌器上在水浴中將酶添加至所述蛋白質(zhì)懸液。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的溫度達(dá)到 60°C時(shí)添加酶。熱失活/儲(chǔ)存在酶處理后，立刻將試樣在85°C在振蕩水浴中熱處理15分鐘。將試樣在冰上冷 卻，并冷藏于4°C過夜。在4°C溫育過夜后，評(píng)價(jià)溶解度和水解度。溶解度使用Leco FP 5 蛋白質(zhì)/氮分析儀在pH 4. 0和6. 5測(cè)量溶解度，其通過燃燒法 (combustion method)測(cè)定蛋白質(zhì)和氮含量。所述氮含量在可溶性級(jí)分中測(cè)定，且將溶解度 計(jì)算為總干物質(zhì)含量中氮含量的百分比。水解度如 Adler-Nissen, J. , 1986, Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,第 5 章， 第122-1 頁所述通過pH恒定法(pH stat)來測(cè)量所述懸液的水解度。結(jié)果水解度
溶解度 pH 6. 5
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生酪蛋白水解物的方法，包括a)向包含酪蛋白的組合物添加與SEQID NO :1具有至少50%同一性的內(nèi)肽酶；和b)溫育以水解所述酪蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)肽酶與SEQID NO 1具有至少60%的同一性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述內(nèi)肽酶與SEQID NO 1具有至少80%的同一性。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述內(nèi)肽酶的最適pH為pH9.5至？!1 10.5。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在pH9時(shí)所述內(nèi)肽酶的最適溫度為至少60°C。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述內(nèi)肽酶來自擬諾卡氏菌屬。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述內(nèi)肽酶以每kg酪蛋白1到IOOOmg酶蛋白的 濃度添加。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述內(nèi)肽酶以每kg酪蛋白0.01到50AU的活性添加。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述組合物包含約5%到約25%酪蛋白。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述酪蛋白水解物具有至少2%的水解度。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其進(jìn)一步包括用一種或多種另外的具有蛋白酶活性 的酶處理所述酪蛋白組合物。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其進(jìn)一步包括用一種或多種外肽酶處理所述酪蛋白 組合物。
13.由前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法產(chǎn)生的酪蛋白水解物。
14.由權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的酪蛋白水解物在食品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用微生物內(nèi)肽酶產(chǎn)生酪蛋白水解物的方法。
文檔編號(hào)A23J3/34GK102046782SQ200980119144
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日
發(fā)明者吉特·B·林格里夫, 珀·M·尼爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司