用于檢測和監(jiān)測蛋白質(zhì)基質(zhì)的蛋白水解的系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開大體上涉及用于電化學(xué)測試的分析儀器和方法。本公開具體涉及蛋白質(zhì)基 質(zhì)的蛋白水解的電化學(xué)檢測。更具體提供用于檢測蛋白質(zhì)基質(zhì)--包括纖維蛋白凝塊、細(xì) 胞外基質(zhì)和類似的膠原或相關(guān)蛋白質(zhì)基基質(zhì)(無論是內(nèi)源性的還是合成的）的蛋白水解的 新型裝置和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)基質(zhì)對(duì)組織功能、組織再生、創(chuàng)傷愈合和止血等方面是重要的。例如，許多 真核細(xì)胞被蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)包封，所述蛋白質(zhì)為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持、細(xì)胞和組織確定 以及自分泌、旁分泌和近分泌性質(zhì)，因此所述基質(zhì)是正常細(xì)胞功能所必需的。在創(chuàng)傷愈合 中，一連串分子和細(xì)胞事件最初導(dǎo)致止血--防止失血。纖維蛋白在止血和創(chuàng)傷愈合中發(fā) 揮關(guān)鍵作用，因?yàn)槠渫ㄟ^復(fù)雜的反應(yīng)級(jí)聯(lián)形成交聯(lián)蛋白質(zhì)基質(zhì)(凝塊)，最終步驟是通過凝 血酶轉(zhuǎn)化單體纖維蛋白原以形成交聯(lián)的纖維蛋白多聚體，其通常被稱作凝塊。
[0003] 除了其在止血中的作用外，纖維蛋白形成是許多病理學(xué)和炎癥狀況中常見的。例 如，纖維蛋白沉積(血栓形成）與動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑 狼瘡、心肌梗塞、肺栓塞、深靜脈血栓形成、自身免疫性神經(jīng)病、肉芽腫病、寄生蟲感染和同 種異體移植排斥相關(guān)聯(lián)。也有證據(jù)表明血栓形成在神經(jīng)退行性疾病中起到作用。類似地， 膠原酶在浸潤性癌中起到重要作用，在此它們破壞健康組織中的細(xì)胞外基質(zhì)以致原發(fā)性腫 瘤細(xì)胞能夠逃脫它們的原生環(huán)境并隨后侵襲遠(yuǎn)端組織而形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移酶。
[0004] 有趣地，蛋白質(zhì)基質(zhì)，如細(xì)胞外基質(zhì)和纖維蛋白凝塊通常是動(dòng)態(tài)的，即該基質(zhì)可作 為病理學(xué)過程或正常生理學(xué)過程的一部分形成和降解。實(shí)際上，止血可以被視為維持纖維 蛋白凝塊形成與這些凝塊被酶或凝血因子(包括纖溶酶）蛋白降解之間的平衡。
[0005] 檢測或監(jiān)測蛋白質(zhì)基質(zhì)形成，如血塊(血栓）的方法包括例如測定凝血的方法，例 如凝血酶原時(shí)間、凝血酶凝血時(shí)間或用于纖維蛋白原測試的Clauss方法，有商業(yè)裝置可以 以便攜的定點(diǎn)照護(hù)（point-of-care)的形式進(jìn)行這樣的凝血測試。但是，用于檢測或監(jiān)測 纖維蛋白溶解的試驗(yàn)通常限于在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中和對(duì)原生纖維蛋白凝塊的復(fù)雜方法，例如血 栓彈性測定法（thromboelastometry，TEM)，而不適用于定點(diǎn)照護(hù)或現(xiàn)場診斷。另一些方法 使用比色或熒光檢測法，也昂貴、復(fù)雜，且受樣品的顏色或濁度的負(fù)面影響，因此對(duì)纖維蛋 白溶解的及時(shí)性和靈敏性檢測和監(jiān)測無效。
[0006] 因此對(duì)用于檢測和/或監(jiān)測蛋白質(zhì)基質(zhì)的蛋白水解的新型和改進(jìn)的裝置和方法 存在需求。特別地，例如，檢測和監(jiān)測蛋白水解活性，如纖維蛋白溶解或膠原、細(xì)胞外基質(zhì)或 其它類似蛋白質(zhì)基質(zhì)的分解的電化學(xué)和相關(guān)分析技術(shù)可以為醫(yī)學(xué)健康提供有價(jià)值的診斷 和監(jiān)測工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 因此，本公開的一個(gè)目的是提供用于檢測和監(jiān)測內(nèi)源性或合成蛋白質(zhì)基質(zhì)的生理 學(xué)和病理學(xué)相關(guān)的蛋白水解活性的新型和改進(jìn)的系統(tǒng)和方法。本公開的另一目的是提供能 夠檢測和監(jiān)測蛋白水解活動(dòng)，如纖維蛋白溶解或膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的分解的新型和改進(jìn)的 系統(tǒng)和方法。
[0008] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供用于檢測或監(jiān)測蛋白質(zhì)基質(zhì)的蛋白水解的裝置，其包括： (i) 合成蛋白質(zhì)基質(zhì)，（ii)工作電極，和（iii)對(duì)電極，其中該合成蛋白質(zhì)基質(zhì)與各電極的 至少一部分接觸，其中與該合成蛋白質(zhì)基質(zhì)接觸中提供第一和第二電活性物類，其中在暴 露于樣品時(shí)，由第一電活性物類在工作電極處生成擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流，并由第二電活 性物類在對(duì)電極處生成反向電流，測量擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流，該測量指示合成蛋白質(zhì)基 質(zhì)的蛋白水解水平。
[0009] 在另一實(shí)施方案中，該合成蛋白質(zhì)基質(zhì)是纖維蛋白凝塊、血塊、富含血小板的血漿 凝塊、明膠、膠原基質(zhì)之一，并且在基質(zhì)在載體上、載體內(nèi)或載體周圍形成。在再一實(shí)施方案 中，工作電極大于對(duì)電極。在又一實(shí)施方案中，第一和第二電活性物類為相同分子的相反 氧化態(tài)。
[0010] 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一電活性物類是如本文中定義和公開的電動(dòng)元。在一 個(gè)實(shí)施方案中，該電動(dòng)元是聚乙二醇（PEGs)、聚乙烯醇（PVA)、多肽、聚胺及其衍生物之一。 在另一實(shí)施方案中，第二電活性物類是小分子電活性物類，且第二電活性物類的擴(kuò)散系數(shù) 不同于該電動(dòng)元的擴(kuò)散系數(shù)。在再一實(shí)施方案中，測定第一和第二電活性物類的相對(duì)濃度 以使工作電極處的基本所有電流由第一電活性物類而非由第二電活性物類生成。在又一實(shí) 施方案中，第一電活性物類是PEG-Fc (Fc-CO-NH- (CH2CH2O) η-ΝΗ-CO-Fc)，且第二電活性物 類是六胺釕（III) (Ru(NH3)63+)。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該樣品是血液、血漿、間質(zhì)液、其它體液和具有已知蛋白水解 活性的對(duì)照樣品之一。
[0012] 在另一實(shí)施方案中，該裝置進(jìn)一步包括適合使用預(yù)定公式或方法分析擴(kuò)散限制電 流的測量結(jié)果的數(shù)據(jù)處理單元，由此產(chǎn)生指示蛋白質(zhì)基質(zhì)的蛋白水解的結(jié)果。在再一實(shí)施 方案中，該裝置進(jìn)一步包括適合輸出擴(kuò)散限制電流的所述測量結(jié)果的輸出單元，該結(jié)果指 示蛋白水解。在又一實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)處理和輸出單元之一是移動(dòng)設(shè)備或移動(dòng)應(yīng)用程序之 〇
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)電極包括參考電極和輔助電極。
[0014] 根據(jù)另一實(shí)施方案，提供檢測或監(jiān)測樣品的蛋白水解活性的方法，包括：（i)提 供受蛋白水解活性影響的合成蛋白質(zhì)基質(zhì)，該合成蛋白質(zhì)基質(zhì)與工作電極和對(duì)電極接觸， (ii) 與該合成蛋白質(zhì)基質(zhì)接觸中提供第一和第二電活性物類，（iii)使合成蛋白質(zhì)基質(zhì)暴 露于樣品，由此由第一電活性物類在工作電極處生成擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流，并由第二電 活性物類在對(duì)電極處生成反向電流，（iv)測量擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流，該測量指示樣品中 的蛋白水解活性水平。
[0015] 根據(jù)另一實(shí)施方案，提供檢測或監(jiān)測樣品的纖維蛋白溶解活性的方法，包括：（i) 提供合成纖維蛋白條，已在該條上印刷工作電極和對(duì)電極，（ii)與該合成蛋白質(zhì)基質(zhì)接觸 中提供電動(dòng)元和小分子電活性物類，（iii)使纖維蛋白條暴露于樣品，由此由電動(dòng)元在工 作電極處生成擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流并由小分子電活性物類在對(duì)電極處生成反向電流， (iv)測量擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流，該測量指示樣品中的纖維蛋白溶解活性水平。
[0016] 根據(jù)另一實(shí)施方案，提供檢測或監(jiān)測樣品的膠原酶活性的方法，包括（i)提供明 膠條，已在該條上印刷工作電極和對(duì)電極，（ii)與該蛋白質(zhì)基質(zhì)接觸中提供電動(dòng)元和小分 子電活性物類，（iii)使所述明膠條暴露于樣品，由此由電動(dòng)元在工作電極處生成擴(kuò)散限制 的電化學(xué)電流并由小分子電活性物類在對(duì)電極處生成反向電流，（ iv)測量擴(kuò)散限制的電化 學(xué)電流，該測量指示樣品中的膠原酶活性水平。
[0017] 根據(jù)再一實(shí)施方案中，來自樣品的擴(kuò)散限制的電化學(xué)電流的測量結(jié)果代表基線， 該方法進(jìn)一步包括使第二合成蛋白質(zhì)基質(zhì)暴露于第二樣品并測量來自第二樣品的擴(kuò)散限 制的電化學(xué)電流?；€與第二樣品之間的差異指示根據(jù)這一實(shí)施方案的蛋白水解活性的變 化。
[0018] 在各種實(shí)施方案中，該測量基于計(jì)時(shí)電流分析法、電位階躍伏安法、線性掃描伏安 法、循環(huán)伏安法、方波伏安法、階梯伏安法、陽極或陰極溶出伏安法、吸附溶出伏安法、交流 電伏安法、旋轉(zhuǎn)電極伏安法、常規(guī)或差動(dòng)脈沖伏安法和計(jì)時(shí)庫侖分析法之一。
[0019] 在另一實(shí)施方案中，在交變電流或多直流脈沖上進(jìn)行該測量。在再一實(shí)施方案中， 該測量基于電化學(xué)阻抗譜，由