專利名稱：含有心肌細(xì)胞的裝置及其制造和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性(cardiotoxicity)的裝置。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造這種裝置的方法。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及使用這種裝置測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述裝置用于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和/或藥物開(kāi)發(fā)的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步涉及為由細(xì)胞的拉伸所導(dǎo)致或改變的疾病開(kāi)發(fā)疾病模型的方法，特別是心臟疾病模型。
背景技術(shù)：
許多藥物具有心臟毒性副作用，例如心律失?；?qū)π募∈湛s能力的負(fù)面影響。在過(guò)去的幾年中已明顯得知許多藥物的一個(gè)常見(jiàn)副作用是對(duì)心動(dòng)周期中QT間期的延長(zhǎng)影響，這是藥物誘發(fā)的危及生命的心律失常的重要原因。例如，在過(guò)去，數(shù)種藥物的研發(fā)由于對(duì)體表心電圖(ECG)的QT間期的不希望影響已經(jīng)中止于臨床前試驗(yàn)或臨床試驗(yàn)的后期，甚至上市后。該間期延長(zhǎng)至超過(guò)440至460毫秒可能會(huì)導(dǎo)致危及生命的心律失常的發(fā)生，例如尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速(torsade de pointes，TdP)，并且與多種藥物相關(guān)。1998年當(dāng)Food and Drug Administration (FDA)認(rèn)定QT間期的延長(zhǎng)為重大藥物安全問(wèn)題時(shí)，該現(xiàn)象得到公認(rèn)。因此，QT延長(zhǎng)和臨床尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速的確認(rèn)導(dǎo)致一些藥物從美國(guó)市場(chǎng)的清除，包括特非那定、阿司咪唑、硫利達(dá)嗪和格帕沙星，同時(shí)許多其它藥物被FDA要求攜帶警告潛在風(fēng)險(xiǎn)的附加安全標(biāo)簽。目前，延遲的心室復(fù)極化和QT間期延長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是被FDA和EMEA采用的用于所有研發(fā)中藥物的NCE標(biāo)準(zhǔn)非臨床評(píng)價(jià)的一部分。不幸的是，目前可得到的檢測(cè)心臟毒性的臨床前體外細(xì)胞基模型系統(tǒng)對(duì)于檢測(cè)這些副作用的大多數(shù)是不足的，同時(shí)預(yù)測(cè)性體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)非常昂貴，并且受到道德上的挑戰(zhàn)。 另外，從動(dòng)物研究獲得的心臟毒性結(jié)果不能容易地推及到人類。檢測(cè)過(guò)程由于以下事實(shí)被進(jìn)一步復(fù)雜化藥物的這些心臟毒性影響可能只在發(fā)生在體內(nèi)跳動(dòng)心臟中的實(shí)際心肌拉伸和收縮期間，特別是在(劇烈)體育運(yùn)動(dòng)期間；以及在心臟疾病中，例如與心臟超負(fù)荷相關(guān)的疾病，如心臟衰竭，和以炎癥為特征的疾病中，如在流感感染過(guò)程中，才變得明顯。目前沒(méi)有模擬，在生理狀態(tài)，即拉伸-收縮周期，或者與心臟衰竭相關(guān)的病理生理狀態(tài)，例如針對(duì)增加的壓力的過(guò)度拉伸/收縮，的正常跳動(dòng)心臟的檢測(cè)模型系統(tǒng)存在。此外，不同的藥物對(duì)心臟功能可能有不同的負(fù)面影響。一些基于人類細(xì)胞的模型系統(tǒng)可獲得而用于心臟毒性檢測(cè)。這些模型系統(tǒng)典型地可由在標(biāo)準(zhǔn)的多電極陣列(MEA)上的心肌細(xì)胞(動(dòng)物的或人的，原代心肌細(xì)胞(primary cardiomyocytes)或干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞)組成，在“Pluripotent stem cell lines”J. Yu和JA. Thomson, Genes Dev. 2008，22，p. 1987-1997中公開(kāi)。然而這些系統(tǒng)的有效性受到以下事實(shí)的限制這些是靜態(tài)模型系統(tǒng)，沒(méi)有考慮跳動(dòng)心臟的動(dòng)態(tài)特性。^ iAn Electro-Tensile Bioreactor for 3-D Culturing of Cardiomyocytes^,Zhonggang Feng^. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine, July/August 2005，第73-79頁(yè)中，公開(kāi)了一種生物反應(yīng)器，其允許布置在可拉伸硅酮板上的含有心肌細(xì)胞的凝膠層的面內(nèi)拉伸以模擬體內(nèi)心肌的機(jī)械和電響應(yīng)。這一裝置的一個(gè)缺點(diǎn)是其相當(dāng)復(fù)雜并且由于心肌細(xì)胞包埋在凝膠中的事實(shí)而不是特別適合心臟毒性檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明尋求提供一種改進(jìn)的用于測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的裝置。本發(fā)明進(jìn)一步尋求提供一種制造這種改進(jìn)的裝置的方法。本發(fā)明還進(jìn)一步尋求提供一種使用這種改進(jìn)的裝置測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的方法。本發(fā)明進(jìn)一步尋求提供一種使用這種改進(jìn)的裝置開(kāi)發(fā)(心臟)疾病模型的方法。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的裝置，包括承載有可變形疊層(stack)的基板(substrate)，所述疊層通過(guò)允許所述疊層的面外 (out-of-plane)變形的空腔(cavity)從基板部分分離，所述疊層包括第一可變形層，第二可變形層及夾在所述第一可變形層和第二可變形層間的多電極結(jié)構(gòu)，所述第二可變形層承載有粘附其上的心肌細(xì)胞(cardiomyocytes)圖案，以及安裝在基板上的用于使心肌細(xì)胞暴露于所述化學(xué)化合物的液體容器。所述空腔的存在確保第一可變形層例如彈性體層的至少中心區(qū)域不連接到基板， 從而該區(qū)域可以自由移動(dòng)，例如被心肌細(xì)胞的收縮引發(fā)。所述空腔的提供確保了可以以相對(duì)簡(jiǎn)單的方式方便心肌細(xì)胞收縮引起的移動(dòng)，從而與現(xiàn)有技術(shù)的裝置相比減少本發(fā)明裝置的成本。在一實(shí)施方式中，所述可變形疊層的一端從基板分離以方便心肌細(xì)胞收縮時(shí)的面外變形，例如卷曲。這具有的優(yōu)勢(shì)是心肌細(xì)胞收縮可以通過(guò)電極設(shè)置以電學(xué)方式監(jiān)控，以及可以通過(guò)卷曲量以光學(xué)方式監(jiān)控。另外，卷曲原理確保疊層對(duì)收縮心肌細(xì)胞的變形力的內(nèi)在抵抗性低，從而收縮沒(méi)被該抵抗性明顯阻礙。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述基板包含所述空腔，所述疊層在所述空腔上方延伸，其中疊層的相對(duì)端連接到基板上，從而方便由外部施加的力引起的疊層的面外變形。這具有的優(yōu)勢(shì)是該裝置也可以用于通過(guò)在可變形疊層的面外變形期間拉伸細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)未成熟的心肌細(xì)胞，從而活心肌細(xì)胞的分化和成熟過(guò)程被加速。另外，心肌細(xì)胞的收縮由于以下事實(shí)仍然是便利化的疊層的可拉伸(Stretchable)性質(zhì)允許面內(nèi)的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)的可變形層的拉伸，這樣分別在心臟舒張期和收縮期期間的心肌細(xì)胞拉伸和收縮都可以用該裝置在適當(dāng)?shù)睦?收縮周期頻率以定量方式模擬。這可進(jìn)一步促進(jìn)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的分化和成熟。所述裝置可包含用于用流體填充空腔的進(jìn)口。在一實(shí)施方式中，所述流體是氣體 (例如空氣)，從而疊層的面外變形可以通過(guò)控制空腔內(nèi)的氣體(例如空氣)壓力進(jìn)行控制，從而模擬心臟的跳動(dòng)。這具有的優(yōu)勢(shì)是不需要與疊層接觸而引起面外變形，從而減少污染或損壞心肌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，所述流體是液體，并且所述疊層包含所述進(jìn)口。疊層中進(jìn)口的提供進(jìn)一步方便了心肌細(xì)胞收縮周期期間疊層的拉伸，從而例如使得能夠使用線形電極陣列。在該實(shí)施方式中，任何置于容器中的流體都將包圍疊層的兩個(gè)表面，使得流體在疊層上的載荷將有效地為零。在這種情況下，疊層的面外變形可以是以機(jī)械方式產(chǎn)生的?？傻玫?00%或更大的疊層的面外變形。在一實(shí)施方式中，所述疊層是波紋狀的以使得其可變形。波紋進(jìn)一步降低了疊層對(duì)心肌細(xì)胞收縮力的內(nèi)在抵抗性，從而改善所述裝置的心肌細(xì)胞收縮行為。按照本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明裝置的制造方法。該方法包括生長(zhǎng)所述基板的氧化物層；在氧化物層上沉積第一可變形層；在第一可變形層上沉積并圖案化導(dǎo)電層 (conductive layer)，從而形成多電極結(jié)構(gòu)，在第一可變形層上沉積第二可變形層，圖案化第二可變形層以提供至多電極結(jié)構(gòu)的通路(to provide access to the multi-electrode structure)，在圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案，將心肌細(xì)胞粘附于所述粘性圖案， 將液體容器粘附到第二可變形層上并形成在第一可變形層下面的空腔。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于本發(fā)明的裝置可以以低成本形成，從而使該方法對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)目的具有吸引力。這種方法的步驟執(zhí)行的順序可以改變而不超出本發(fā)明的范圍。例如，在圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案和將心肌細(xì)胞粘附于所述粘性圖案的步驟可以在形成在第一變形層下面的空腔后進(jìn)行。這具有的優(yōu)勢(shì)在于心肌細(xì)胞可以在即將使用前施加到第二可變形層，從而確保在使用期間心肌細(xì)胞處于良好的狀況。在一實(shí)施方式中，形成所述空腔包括在沉積第一可變形層前在氧化物層上沉積犧牲層，所述犧牲層限定空腔容積并且在沉積第二可變形層后移除所述犧牲層。這具有的優(yōu)勢(shì)在于疊層可以在犧牲層上而不是在所述空腔上形成，從而由于不需要復(fù)雜步驟以在空洞上形成疊層而簡(jiǎn)化制造工藝。在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，形成所述空腔包括在基板背面上施加掩模；圖案化所述掩模以限定空腔區(qū)域；蝕刻基板的背面以暴露第一可變形層；和從基板背面移除圖案化的掩模。這具有的優(yōu)勢(shì)在于疊層可以在基板上而不是空腔上形成，從而如以上解釋的那樣簡(jiǎn)化制造工藝。有利地，所述方法進(jìn)一步包括在形成氧化物層前在基板中形成波紋狀圖案。這具有的優(yōu)勢(shì)在于變形能力可通過(guò)波紋(corrugations)的柔韌性(flexibility)實(shí)現(xiàn)，如前面解釋的那樣其有助于心肌細(xì)胞的收縮周期。在一實(shí)施方式中，所述波紋狀圖案通過(guò)軋壓(milling)形成。在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，形成所述波紋狀圖案(corrugated pattern)包括在基板上沉積氧化硅層；在氧化硅層上沉積氮化硅層；圖案化氧化硅和氮化硅層，從而暴露基板的選定部分；將所述選定部分暴露于一系列蝕刻步驟以形成所述波紋狀圖案；和移除氧化硅和氮化硅層。這具有以下優(yōu)勢(shì)波紋狀圖案可以使用容易得到的半導(dǎo)體加工技術(shù)形成，從而限制了裝置制造的復(fù)雜性和成本?？蛇x擇地，所述波紋狀圖案可以通過(guò)L0C0S氧化步驟、隨后進(jìn)行其中移除L0C0S氧化物的蝕刻步驟而形成。這同樣有以下優(yōu)勢(shì)波紋狀圖案可以使用容易得到的半導(dǎo)體加工技術(shù)形成，從而限制裝置制造的復(fù)雜性和成本。根據(jù)本發(fā)明的又另一方面，提供了測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的方法，包括提供根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的裝置；用含有化學(xué)化合物的介質(zhì)填充所述容器以使心肌細(xì)胞暴露于所述化合物；并且測(cè)量心肌細(xì)胞對(duì)所述暴露的反應(yīng)。
在這種方法中本發(fā)明裝置的使用提供了化學(xué)化合物例如試驗(yàn)藥物的心臟毒性測(cè)定的準(zhǔn)確性改進(jìn)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及為由細(xì)胞的拉伸導(dǎo)致或改變的疾病開(kāi)發(fā)疾病模型的方法，所述方法包括步驟將至少一個(gè)細(xì)胞附著至粘性表面圖案通過(guò)外部施加的力拉伸所述至少一個(gè)細(xì)胞以電學(xué)方式和/或光學(xué)方式測(cè)量所述至少一個(gè)細(xì)胞的動(dòng)作電位，隨時(shí)間監(jiān)控和/ 或解析所述動(dòng)作電位。所述方法特別適用于建立心臟疾病模型(除了其中細(xì)胞拉伸與測(cè)量離子通道活性(activity)和電勢(shì)(electric potential)相關(guān)的疾病模型之外)。心臟細(xì)胞毒性可以在模擬體育鍛煉期間增加的心臟負(fù)荷(壓力)的情況下或與增加的心臟輸出相關(guān)的其他情況下測(cè)量是一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)。心臟細(xì)胞毒性可以在心臟疾病，例如心力衰竭、心肌癥等情況下測(cè)定是一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)。在所述方法中可以考慮特定遺傳變量(genetic variable) 對(duì)心臟毒性(cardiotoxicity)的影響。在一個(gè)有利的方法中，所述至少一個(gè)細(xì)胞的拉伸可以相對(duì)于所述粘性表面圖案是面內(nèi)和/或面外的。面內(nèi)細(xì)胞拉伸百分比超過(guò)30 %并且拉伸時(shí)間是不同的。優(yōu)選地，在測(cè)量過(guò)程中添加化學(xué)或生物化合物。根據(jù)本發(fā)明的裝置的使用允許用于藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的精確心臟疾病模型的開(kāi)發(fā)， 以及在個(gè)體化的基礎(chǔ)上，考慮人類遺傳變量。


本發(fā)明的實(shí)施方式被更詳細(xì)地且通過(guò)參考附圖的非限制性實(shí)例進(jìn)行了描述，其中圖1 (a)-(g)示意性描繪了依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制造測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置的方法；圖2示意性描繪了通過(guò)圖1的方法得到的測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置的頂視圖；圖3(a)_(c)示意性描繪了依照本發(fā)明另一實(shí)施方式的測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置；圖4示意性描繪了用于本發(fā)明的測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置的一個(gè)示例電極設(shè)置；圖5示意性描繪了用于本發(fā)明的測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置的一個(gè)可選示例電極設(shè)置；圖6(a)_(j)示意性描繪了依照本發(fā)明的一個(gè)可選實(shí)施方式制造測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置的方法；圖7 (a)-(h)示意性描繪了依照本發(fā)明又一實(shí)施方式制造測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置的方法；以及圖8-10顯示了圖7方法的一部分的可選方式。
具體實(shí)施方式
應(yīng)該理解附圖僅僅是示意性的并且不是依照比例繪制的。還應(yīng)該理解貫穿附圖使用同樣的附圖標(biāo)記代表相同或相似的部件。本發(fā)明測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置是基于下述一般結(jié)構(gòu)原理。將基于彈性體的疊層設(shè)置在基板中的空腔之上。該空腔有效地將基于彈性體的疊層的一部分從基板分離，這樣該部分的彈性特性被便利化以移出基板的表面平面。設(shè)計(jì)了這種裝置的幾個(gè)實(shí)施方式，如下面將更詳細(xì)地描述的那樣。在圖1中，描繪了制造本發(fā)明裝置的第一實(shí)施方式的方法。在第一步驟(a)中，提供基板10例如硅片、玻璃基板或任何其它合適的基板材料以及在基板10表面上形成介電層12例如氧化硅層。基板10上的介電層12的形成是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且僅由于簡(jiǎn)潔原因而不再進(jìn)一步解釋。在下一步驟(b)中，犧牲材料14沉積在介電層12上并且隨后圖案化。圖案化的犧牲材料14限定了將形成的空腔?？墒褂萌魏芜m宜的犧牲材料，例如可溶的或可分解的聚合物。這種聚合物的適宜的非限制性例子是聚N-異丙基丙烯酰胺(PIPAAm)。在步驟(c)中，在圖案化的犧牲材料14和介電層12上形成基于彈性體的疊層。該疊層包含第一彈性體層16，在第一彈性體層16上形成的圖案化的金屬層18以及覆蓋圖案化的導(dǎo)電層18使得導(dǎo)電層被夾在第一彈性體層16和第二彈性體層20之間的第二彈性體層20?？梢允褂萌魏芜m宜的彈性體層。在一實(shí)施方式中，第一彈性體層16是聚二甲基硅氧烷(PDMS)層，其可通過(guò)旋涂施加?？梢栽谠搶由鲜┘尤魏芜m宜的導(dǎo)電材料，例如金屬。例如，TiN層或Ti/Au層疊層可沉積在PDMS層16上并且隨后圖案化。第二 PDMS層20可以旋涂在圖案化的導(dǎo)電層18上。該圖案化的導(dǎo)電層典型地包含電極、焊盤以及焊盤和電極之間的連接。后面將對(duì)此進(jìn)行更詳細(xì)地解釋。在步驟(d)中，以任何適宜的方式形成到圖案化的導(dǎo)電層18中的電極和焊盤 (bond pads)的接觸(contacts) 22，例如通過(guò)RIE蝕刻。在這之后，如步驟(e)中所示，將固定層對(duì)施加于圖案化的導(dǎo)電層18中的電極上的第二彈性體層20的區(qū)域，用于將活的心肌細(xì)胞固定至基于彈性體的疊層。所述活的心肌細(xì)胞可以是任何適宜類型的心肌細(xì)胞，例如人或動(dòng)物原代細(xì)胞(primary cells)，或人干細(xì)胞衍生的細(xì)胞。用于固定層M的適宜的材料的一個(gè)實(shí)例是纖連蛋白(fibronectin)，其可以通過(guò)壓印印刷(stamp-printing)、絲網(wǎng)印刷或噴墨印刷施加。所述心肌細(xì)胞可以隨后粘附到該層上。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，纖連蛋白是這種固定層的一個(gè)非限制性實(shí)例，并且也可以考慮其它適宜的粘附材料。限定電極陣列箔(foil)的基于彈性體的疊層的尺寸可以通過(guò)(激光)切割疊層和犧牲材料層確定，從而提供切口 25，其也充當(dāng)至犧牲材料14的通路。該步驟之后是步驟(f)，其中液體容器25以任何適宜的方式連接到所述裝置，例如通過(guò)膠合。最后，如步驟(f)中所示，犧牲材料被移除。例如，在犧牲材料是PIPMAAm的情況下，其可以通過(guò)在 Tyrode' s溶液中溶解該層而移除。其具有心肌細(xì)胞可以早已經(jīng)位于固定層M上的優(yōu)勢(shì)， 由于Tyrode' s溶液的等滲特性。在可熱分解的材料的情況下，移除可以通過(guò)將該裝置暴露到高于所述材料的分解溫度的溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)。在該實(shí)施方式中，需要注意選擇在足夠低的溫度分解的材料以避免損壞裝置的其它層。為此，可以在移除可熱分解的材料后將固定層24和心肌細(xì)胞兩者施加于基于彈性體的疊層。在一個(gè)實(shí)施方式中，基于彈性體的疊層或箔的厚度在3-10微米的范圍。在該范圍內(nèi)，基于彈性體的疊層或箔具有特別好的柔韌性。圖1 (g)展示了操作中的依照本發(fā)明這一實(shí)施方式的裝置。液體容器沈填充有包含準(zhǔn)備在心肌細(xì)胞28上檢測(cè)的化學(xué)化合物的溶液30。包埋心肌細(xì)胞的溶液30可以含有不同濃度的被測(cè)化學(xué)化合物以及模擬不同體內(nèi)(病理)生理狀況，例如由劇烈運(yùn)動(dòng)引起的狀態(tài)，所需的不同濃度的分子，例如電解質(zhì)，如鉀、鈉、鈣、葡萄糖、氧氣、C02。在承載心肌細(xì)胞28的基于彈性體的疊層下的空腔32允許該疊層的由心肌細(xì)胞 28的收縮觸發(fā)的面外卷曲。在心肌細(xì)胞觀的拉伸-收縮周期期間通過(guò)圖案化的金屬層 18中的電極紀(jì)錄的場(chǎng)電位可以用于測(cè)定化學(xué)化合物對(duì)心肌細(xì)胞觀的離子通道中的傳導(dǎo)性 (conductivity)的影響。在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)該理解短語(yǔ)“化學(xué)化合物”并不意在限于準(zhǔn)備用作藥物的化合物或只限于單一化合物。通常，任何物質(zhì)，例如含有一種或多種化合物的化合物混合物、乳液和溶液，都可以使用本發(fā)明的裝置檢測(cè)。移除犧牲層14前圖1(f)中顯示的裝置的電極陣列的頂視圖顯示于圖2中。圖案化的導(dǎo)電層18包含許多通過(guò)導(dǎo)電連接器(connectors) 112連接到相應(yīng)電極144的焊盤 110。成型液體容器沈從而其圍起所有電極114。也顯示了切口 25，如前面解釋的那樣，其限定了可以卷起的疊層部分。切口 25延伸至下面的犧牲層14。如前面解釋的那樣，這促進(jìn)了該層的移除。固定層對(duì)，例如蛋白纖連蛋白，優(yōu)選在疊層的長(zhǎng)度方向以條帶(未顯示) 的形式圖案化。這使得當(dāng)粘附在這些條帶上的心肌細(xì)胞觀收縮時(shí)引起的疊層卷曲最大化。在本發(fā)明的一個(gè)可選的實(shí)施方式中，空腔32在基板10中形成，可變形疊層覆蓋到空腔32的通路，從而基于彈性體的疊層上壓力的改變將允許疊層進(jìn)入或遠(yuǎn)離空腔32的變形。在第一實(shí)施方式中，可以使用基于彈性體的疊層，其操作原理在圖3中示出。如圖3(a) 中顯示，基板10包含延伸穿過(guò)基板的空腔32，其被基于彈性體的疊層34覆蓋。疊層34可以由第一彈性體層16、圖案化的導(dǎo)電層18和第二彈性體層20形成并且典型地承載由液體容器26圍起的心肌細(xì)胞觀的圖案，如前面解釋的那樣。僅僅由于清楚的原因，這些特征沒(méi)有明確地顯示在圖3(a)中。疊層或箔34典型地保持為非常薄以優(yōu)化其可拉伸性。如圖3(b)所示，所述裝置可進(jìn)一步包含具有入口 36的腔室32'。腔室32與空腔 32連通接觸，從而空腔32中的壓力可以被調(diào)節(jié)，例如通過(guò)經(jīng)由入口 36抽出或加入氣體例如空氣來(lái)降低或增加。這迫使疊層34在基板10面外的方向拉伸，例如當(dāng)降低空腔32中的壓力時(shí)向空腔32中拉伸或當(dāng)增加其中的壓力時(shí)遠(yuǎn)離空腔32。因此，粘附在疊層34上活的心肌細(xì)胞在該過(guò)程中也被拉伸。在圖3(c)中，心肌細(xì)胞的自主收縮引發(fā)疊層34的面內(nèi)變形， 其包括心肌細(xì)胞下的疊層34的增厚(收縮)和在心肌細(xì)胞所位于的區(qū)域外疊層32的變薄 (拉伸)。圖3(a)_(c)中所示的裝置具有可以拉伸的疊層34的事實(shí)具有兩個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。第一，重復(fù)的拉伸可以施用于未成熟的干細(xì)胞以將這些干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，從而產(chǎn)生包含完全分化的心肌細(xì)胞的用于測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置，這改善了用該裝置獲得的臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。第二，疊層34可以與心肌細(xì)胞的收縮節(jié)奏同步被拉伸以模仿跳動(dòng)的心臟。這例如允許附著的心肌細(xì)胞被動(dòng)拉伸以允許在模擬靜息(at rest)和在受控(病理)生理應(yīng)力下心臟的動(dòng)態(tài)心肌細(xì)胞模型體系中離子通道的測(cè)量。心肌細(xì)胞收縮節(jié)奏可以是自主的或電誘導(dǎo)的。疊層34中的電極設(shè)置可以采取任何適當(dāng)?shù)男螤?。在圖4顯示的一個(gè)實(shí)施方式中， 電極設(shè)置包含環(huán)形設(shè)置，被圓柱狀液體容器沈覆蓋，液體容器沈用于盛放包含營(yíng)養(yǎng)物和/ 或一種或多種化學(xué)化合物即藥物的液體。容器沈圍起粘性條帶M例如纖連蛋白條帶(心肌細(xì)胞固定，例如粘附，在其上)的放射狀圖案。條帶的放射狀圖案促進(jìn)放射狀圖案的心肌細(xì)胞的收縮，如前面解釋的那樣，導(dǎo)致疊層34中心部分的增厚。出于清楚的原因僅僅示出了四條條帶。疊層34可以承載任何適宜數(shù)目的條帶。電極114的圖案與這些條帶對(duì)齊。如先前所解釋的那樣，電極114經(jīng)由連接器112連接到焊盤110。焊盤110可以以任何適宜的圖案，例如矩形或方形圖案設(shè)置。關(guān)于這一點(diǎn)，要強(qiáng)調(diào)的是疊層34的可拉伸特性并不必須通過(guò)使用彈性材料實(shí)現(xiàn)。 可選擇地，疊層34可以是波紋狀的，這樣必需的可拉伸性通過(guò)波紋實(shí)現(xiàn)，如在下面將更詳細(xì)地說(shuō)明的那樣。對(duì)于這種實(shí)施方式，可以使用除了彈性體之外的材料。圖5顯示了這種波紋狀疊層的一個(gè)示例電極設(shè)置。從焊盤110到電極114的連接112是基本上線性性質(zhì)的并且沿垂直于疊層中波紋140的方向。心肌細(xì)胞條帶典型地也沿垂直于疊層中波紋140的方向。為便于圖5的疊層設(shè)置的拉伸，沿著疊層提供開(kāi)口 120。因此，含有營(yíng)養(yǎng)物和待測(cè)化學(xué)化合物例如藥物的液體將圍起疊層的兩面，即也填充空腔32，作為液體重量的結(jié)果而導(dǎo)致疊層上“零”加載。在這種情況下，疊層的面外拉伸可以以機(jī)械方式引發(fā)。應(yīng)該指出的是包含圖4的環(huán)狀電極設(shè)置的疊層也可以包含開(kāi)口 120以降低疊層上的“零”加載。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，在基于彈性體的疊層中的圖案化的導(dǎo)電層18包含Ti/ Au作為導(dǎo)電材料，因?yàn)橐扬@示薄的鈦和金層可以拉伸達(dá)100%，因此允許導(dǎo)電圖案無(wú)損壞地拉伸?？蛇x擇地，可考慮TiN或其它適當(dāng)?shù)目衫鞂?dǎo)體。圖6示意性地描繪了根據(jù)圖3的裝置的一種制造方法，其中疊層34是基于彈性體的。在步驟(a)中，提供厚度在大約300-400微米的硅基板10并且其背面提供有合適的硬-蝕刻掩模(hard-etch mask) 50，例如LPCVD生長(zhǎng)的氮化硅(Si3N4)。蝕刻掩模50被圖案化以限定將在基板10中形成的空腔。換句話說(shuō)，蝕刻掩模圖案限定了可拉伸區(qū)域的位置和大小。在下一步驟(b)中，在基板10的前側(cè)生長(zhǎng)介電層12，例如熱氧化物層，至1微米或更小，例如0. 5微米的厚度。在這之后是第一彈性體層16，例如第一 PDMS層的沉積和圖案化，如步驟(c)所示。該層可以以任何適宜的方式沉積，例如通過(guò)旋涂。PDMS是特別適宜的材料，因?yàn)槠涫巧锵嗳莸暮涂梢岳爝_(dá)100%。在步驟(d)中，在第一彈性體層16上形成圖案化的導(dǎo)電層18。這可以以任何適宜的方式實(shí)現(xiàn)。例如，Ti/Au疊層或TiN可以作為導(dǎo)電材料使用，并且可以濺射涂覆并圖案化以形成電極和互連圖案，例如圖4中顯示的圖案。注意，第一彈性體16已經(jīng)被圖案化，這樣焊盤下不存在彈性體以允許可靠的引線接合。在步驟(e)中完成基于彈性體的疊層，其中以任何適宜的方式沉積第二彈性體層 20，例如第二 PDMS層以密封互連圖案112并且被圖案化以暴露例如圖4中示出的電極114 和焊盤110。
接下來(lái)，如步驟(f)中所示通過(guò)用任意適宜的蝕刻劑濕-蝕刻暴露的基板10的背面，其中HF/HN03/乙酸(HNA)蝕刻劑是一個(gè)非限制性實(shí)例，形成基板10中的空腔(圖 6(f))。在步驟(g)中移除硬-蝕刻掩模之后，基板10，其典型地是承載多個(gè)傳感器裝置的晶片(wafer)，在步驟(h)中被切塊，從而分開(kāi)獨(dú)立的傳感器裝置。在介電層12還沒(méi)有被濕-蝕刻步驟完全移除的情況下，可以施加進(jìn)一步的濕蝕刻步驟以移除剩余的介電層材料。最后，在步驟(i)中將容器沈膠合到裝置的前側(cè)。用于將心肌細(xì)胞粘附至基于彈性體的疊層的粘性層圖案，例如纖連蛋白圖案，可以在容器26內(nèi)施加，例如通過(guò)壓印，之后心肌細(xì)胞被施加至該粘性圖案。這優(yōu)選在即將使用該裝置前進(jìn)行以保證心肌細(xì)胞當(dāng)使用時(shí)是 “新鮮的”。圖6(j)示出了導(dǎo)電層18的焊盤110和電極114間的互連112的一個(gè)實(shí)施方式。 所述互連112被設(shè)計(jì)成蜿蜒的形狀以進(jìn)一步方便基于彈性體的疊層的拉伸。圖7顯示了形成具有可以依靠包含波紋的疊層進(jìn)行變形的疊層的裝置的方法的第一實(shí)施方式，如前面在圖6的描述中討論的那樣。在步驟(a)中，提供厚度大約300-400 微米的硅基板10并且其背面提供有適宜的硬-蝕刻掩模50，例如LPCVD生長(zhǎng)的氮化硅 (Si3N4) 0蝕刻掩模50被圖案化以限定將在基板10中形成的空腔。該步驟基本上與圖6中步驟(a) —樣。接下來(lái)，如步驟(b)所示，以任意適宜的方式在基板10中形成波紋10'，例如通過(guò)軋壓或蝕刻。需要注意的是，雖然波紋顯示為具有三角形的形狀，但是這只作為非限制性實(shí)例。優(yōu)選地，波紋剖面具有更圓化(rounded)或波狀(wavy)的形狀。如何可以實(shí)現(xiàn)這種波狀的波紋圖案將在下面進(jìn)行更詳細(xì)地討論。在步驟(c)中，生長(zhǎng)熱氧化物蝕刻阻擋層，隨后在步驟(d)中沉積共形的第一層16。所述共形的材料可以是任意適宜的材料。一種優(yōu)選的候選材料是聚對(duì)二甲苯(parylene)，因?yàn)槠涫巧锵嗳菪圆牧?，具有可以在室溫CVD沉積的特別階躍式覆蓋 (exceptional st印-coverage)。在焊盤的位置，在層16中蝕刻開(kāi)口。在步驟(e)中，形成圖案化的導(dǎo)電層18，例如濺射涂覆并圖案化TiN層以形成電極和互連圖案。如步驟(f)中所示，沉積第二彈性體層20，例如第二聚對(duì)二甲苯層以密封互連 112并且圖案化以暴露電極114和焊盤110。在步驟(g)中，通過(guò)用HNA濕-蝕刻基板的暴露背面在可延伸區(qū)下面形成空腔32。 如果必要的話，可以施加額外的濕蝕刻步驟以移除任何殘余熱氧化物蝕刻阻擋層。在步驟 (h)中移除硬-蝕刻掩模50之后，通過(guò)在步驟⑴中將基板晶片切塊分離單獨(dú)的裝置，之后在步驟(j)中將容器26粘附到基板10的前側(cè)。用于將心肌細(xì)胞粘附至可拉伸區(qū)域的粘性層圖案，例如纖連蛋白圖案，可以在容器26內(nèi)施加，例如通過(guò)壓印，之后心肌細(xì)胞被施加至該粘性圖案。需要重申的是，優(yōu)選提供帶有具有圓化的或波狀形狀的波紋10'的基板10。這樣做的其中一個(gè)原因是將在波紋上形成的后續(xù)層，例如彈性體層16和20，由于這些層連續(xù)性的減小的中斷風(fēng)險(xiǎn)，可以更容易地形成，由于用這些隨后的層適當(dāng)?shù)罔傄r這些拐角的困難性，所述中斷可能在三角形波紋底部的銳角拐角中發(fā)生。圖8顯示形成圓化的波紋10'的方法的第一實(shí)施方式，其利用當(dāng)暴露至各向同性濕蝕刻步驟時(shí)硅的蝕刻行為。在步驟(a)中，提供帶有適合的圖案化的硬掩模50'的硅基板10，該圖案反映了希望的波紋10'的凹進(jìn)處的位置?？梢允褂眠m宜的硬-蝕刻掩模例如LPCVD生長(zhǎng)的Si3N4層。在步驟(b)中，基板10正面的暴露的部分暴露于各向同性濕蝕刻混合物，例如HNA 或HF/HN03/H20混合物。該各向同性蝕刻步驟導(dǎo)致向下蝕刻(under-etch)，其橫向擴(kuò)展至蝕刻深度的約0.7倍?？蛇x擇地，可使用干法蝕刻，例如CF4/02等離子體。最后，硬蝕刻-掩模50'在步驟(c)中移除。這產(chǎn)生波紋圖案，其中在基板10中的“谷” 10'是圓化的，而分隔相鄰“谷”的“峰”是平坦的。在第二實(shí)施方式中，這些“峰”也是圓化的，從而實(shí)現(xiàn)更加波浪狀的，即波狀波紋圖案。這顯示在圖9中。在步驟(a)中，在沉積硬-蝕刻掩模50'之前，在基板10上生長(zhǎng)氧化物層12'。氧化物層12'和硬-蝕刻掩模50'被圖案化以暴露基板10的在其中將蝕刻波紋“谷” 10'的區(qū)域。接下來(lái)，如步驟(b)中所示，硅基板10被各向同性蝕刻至小于最終所需深度的中間深度。該蝕刻不影響硬-蝕刻掩模50'，例如Si3N4掩模50'，并且僅輕微影響氧化物層 12'。在隨后的蝕刻步驟(c)中，硬-掩模層50'下面的氧化物12'被蝕刻，例如通過(guò)由 NH4F/HF的混合物組成的緩沖的氧化物蝕刻。注意將需要一定量的“過(guò)蝕刻”。接下來(lái)，在蝕刻步驟(d)中硅再次被各向同性蝕刻。由于各向同性蝕刻優(yōu)先攻擊尖銳的硅拐角，該步驟將導(dǎo)致波狀的硅圖案。在步驟(e)中移除硬掩模50'和殘存的氧化物層12'后，裝置制造可以如圖7及其詳細(xì)解釋中的描述繼續(xù)進(jìn)行。所述波狀圖案可以通過(guò)調(diào)節(jié)圖案間的間距(Pitch)和氧化物層12'的厚度進(jìn)行優(yōu)化。如圖10中所示，通過(guò)使用LOCOS可以得到具有更細(xì)間距的“波狀”波紋結(jié)構(gòu)。僅由于LOCOS技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，所以這將進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。在步驟(a)中，提供承載有適宜的由墊氧化物12 ‘和LPCVD沉積的Si3N4硬掩模層50 ‘組成的LOCOS疊層的硅基板10。該疊層被圖案化以暴露基板10的將形成波紋10'的區(qū)域。在步驟(b)中，硅基板的暴露區(qū)域被熱氧化以形成熱氧化物層52。Si3N4硬掩模層50'將不會(huì)被氧化；然而在Si3N4 硬掩模層50'的邊緣，熱氧化物層52將在氮化物下面延伸，即形成與LOCOS氧化相關(guān)的公知的鳥(niǎo)嘴(birds beaks)。所述鳥(niǎo)嘴的大小和形狀由墊氧化物(pad-oxide)層12'、Si3N4硬掩模層50'的厚度以及氧化條件決定。通過(guò)優(yōu)化這些條件和波間的間距，在步驟(c)中移除Si3N4硬掩模層50'以及在步驟(d)中移除氧化物后將得到波紋結(jié)構(gòu)?？蛇x擇地，波紋硅圖案可使用灰度光刻(gray-scale lithography)或使用抗蝕劑流動(dòng)(resist flow)得到。應(yīng)該提及的是，纖連蛋白或任何其它適合的粘合劑，可以通過(guò)壓印、結(jié)合光刻的噴涂施加。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，纖連蛋白通過(guò)噴墨印刷施加。粘性纖連蛋白圖案優(yōu)選地在可拉伸疊層上放置容器后施加，之后心肌細(xì)胞被施加于該粘性圖案。進(jìn)一步指出的是，除了電極之外電極陣列可以補(bǔ)充有許多傳感器。這種傳感器的非限制性實(shí)例包括可以測(cè)量由心肌細(xì)胞收縮導(dǎo)致的力的量的應(yīng)變計(jì)，和可以測(cè)量這些細(xì)胞產(chǎn)生的熱的量的微熱量計(jì)。最后應(yīng)該指出的是，雖然本發(fā)明裝置的實(shí)施方式被顯示為僅在圖案化的導(dǎo)電層18 中包含無(wú)源器件(passive device)，在其中形成的電極陣列作為選擇可以包含用于形成電路的有源器件(active device)，其例如可以執(zhí)行信號(hào)放大和信號(hào)整形功能。
應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的裝置使得能夠測(cè)量心肌細(xì)胞離子通道活性以檢測(cè)QT延長(zhǎng)，即代表心室去極化和隨后復(fù)極化持續(xù)時(shí)間的間期的延長(zhǎng)，從QRS復(fù)合波的開(kāi)始到心律T 波的結(jié)束測(cè)量，以及心臟細(xì)胞中的其它電生理異常。相比于在穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行的電生理測(cè)量，其中沒(méi)有考慮由于在心臟舒張期期間左心室填充引起的被動(dòng)心肌細(xì)胞拉伸的影響，本發(fā)明的裝置可以用于開(kāi)發(fā)能夠準(zhǔn)確模擬多種心律不齊的心臟細(xì)胞模型，例如由以下引起的心律不齊在體力消耗(physical exertion) 期間發(fā)生的長(zhǎng)QT綜合癥，或者與增加的心輸出量相關(guān)的病理生理狀況(像發(fā)燒、貧血)， (當(dāng)心率、舒張末期心室容積和填充壓力均增加引起所需的心輸出量增加時(shí))。心室壁心肌細(xì)胞的拉伸水平和心肌細(xì)胞收縮力之間的直接關(guān)系在 Frank-Marling定律中描述。隨著增加的拉伸，收縮力增加直到達(dá)到進(jìn)一步的拉伸引起心輸出量減少的點(diǎn)。這已被描述為機(jī)電反饋(electromechanical feedback)。心肌細(xì)胞的這種(病理)生理拉伸在離子通道活性和易發(fā)心律不齊中起作用。本發(fā)明的可拉伸裝置使得在心肌細(xì)胞拉伸和收縮的受控(病理)生理?xiàng)l件下測(cè)量離子通道活性成為可能。如上所述的離子通道活性的這種測(cè)量可以在特定的心臟病模型中執(zhí)行，例如用于肥厚型心肌病和心力衰竭的疾病模型。心臟心室壁中的心肌細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)度拉伸(與增加的心臟負(fù)荷相關(guān))導(dǎo)致肥大，潛在地導(dǎo)致心力衰竭。施加于粘附在本發(fā)明裝置可拉伸疊層上的心肌細(xì)胞的受控拉伸-收縮循環(huán)的較長(zhǎng)周期(施加了過(guò)度的被動(dòng)拉伸)，預(yù)期引起心肌細(xì)胞肥大并且模擬心力衰竭，并且離子通道活性和收縮力的連續(xù)紀(jì)錄可以顯示關(guān)于潛在的發(fā)病機(jī)制的信息。上述肥厚型心肌病的模型系統(tǒng)可以用于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)，即鑒定在疾病過(guò)程中起原因作用的特定藥物靶標(biāo)分子以及可用于治療所述疾病的化合物的發(fā)現(xiàn)，以及用于藥物研發(fā)。顯然，化學(xué)化合物的心臟毒性也可以在這種疾病狀態(tài)中檢測(cè)。上述疾病模型可以通過(guò)將活的心肌細(xì)胞暴露于以指示所模擬的疾病的濃度含有血液中存在的溶質(zhì)例如電解質(zhì)、02、CO2、葡萄糖等等的溶液來(lái)實(shí)施。因此，心肌細(xì)胞對(duì)這些溶質(zhì)的反應(yīng)可以用于獲得模擬的疾病對(duì)這些細(xì)胞的影響的更好的理解。為由細(xì)胞拉伸引起或改變的疾病開(kāi)發(fā)疾病模型的方法包括以下步驟-將至少一個(gè)細(xì)胞連接至粘性表面圖案04)-通過(guò)外部施加的力拉伸所述至少一個(gè)細(xì)胞-以電學(xué)方式和/或以光學(xué)方式測(cè)量所述至少一個(gè)細(xì)胞的動(dòng)作電位，隨時(shí)間監(jiān)控和/或解析所述動(dòng)作電位。為發(fā)展并構(gòu)建用于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和藥物研發(fā)和藥物毒性測(cè)量的疾病模型，執(zhí)行一些試驗(yàn)步驟1.根據(jù)已有方案，生產(chǎn)/培養(yǎng)代表患病組織的所需活細(xì)胞。它們可以直接從細(xì)胞系或從動(dòng)物或人類組織源獲得，并且準(zhǔn)備用于培養(yǎng)。它們也可以從已被誘導(dǎo)分化成所需的細(xì)胞類型的動(dòng)物或人類干細(xì)胞獲得。2.在上面描述的裝置的表面上，可以沉積或印刷纖連蛋白或其它細(xì)胞外基質(zhì)或其它粘性層，以使細(xì)胞連接至所述表面并保持存活。3.所需要數(shù)量的細(xì)胞(根據(jù)表面積和細(xì)胞種類)被安放在前面描述的基板上，并且在正確的培養(yǎng)基中維持在健康的存活條件，以測(cè)定某些細(xì)胞特異性變量，像離子通道活性或電動(dòng)作電位(electric action potential)。
4.有時(shí)可能需要額外的或重復(fù)的動(dòng)作/程序以進(jìn)一步發(fā)展所述疾病模型，有時(shí)這可能需要一次、連續(xù)或重復(fù)拉伸細(xì)胞至它們?cè)奸L(zhǎng)度的100-200%或更長(zhǎng)，在面內(nèi)或以(通常)拉伸到面外的方式，模仿所需的疾病狀況。有時(shí)更短或更長(zhǎng)的拉伸周期后接著規(guī)定的松弛期。在該過(guò)程中，測(cè)量細(xì)胞的動(dòng)作電位，并且關(guān)于涉及產(chǎn)生了生成電勢(shì)改變的離子流 (ion fluxes)的一個(gè)或多個(gè)膜離子通道的活性進(jìn)行解析。5. 一個(gè)或多個(gè)疾病-特異性變量被測(cè)量以證實(shí)疾病模型類似于實(shí)際疾病到其可以用于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、藥物研發(fā)和藥物毒性的程度。6.為了藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)、藥物研發(fā)或藥物毒性的目的，細(xì)胞將以與中的描述相同的方式被拉伸，以至拉伸發(fā)生在面內(nèi)或(大部分)在面外并且連續(xù)監(jiān)測(cè)并解析動(dòng)作電位。 在該過(guò)程中可以添加需要研究的化學(xué)或生物化學(xué)化合物。7.完成試驗(yàn)的拉伸部分后，可以在細(xì)胞上執(zhí)行一些其它的測(cè)量，像DNA/RNA/蛋白 /代謝物分析，以研究加入的化合物或其它細(xì)胞環(huán)境的改變，像PH或電解質(zhì)、葡萄糖、氧氣或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物或代謝物濃度改變，對(duì)細(xì)胞功能/活性/成活力的影響?？梢砸赃@樣的方式創(chuàng)建的疾病模型可根據(jù)以下被分為一些類型-所需的拉伸百分比，其或者通過(guò)體內(nèi)發(fā)生的生理拉伸決定，例如在心臟跳動(dòng)過(guò)程中，當(dāng)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞被拉伸至生理水平，取決于每次跳動(dòng)的心輸出量/血壓；或者通過(guò)病理生理拉伸決定，像例如發(fā)生在腫瘤或腦內(nèi)出血或硬膜下血腫中。-拉伸發(fā)生在面外的水平。例如對(duì)于模擬跳動(dòng)心臟的模型，心肌細(xì)胞層在拉伸過(guò)程中必須被推出面外，并且在心跳舒張期返回面內(nèi)。如果模型例如模擬心力衰竭，則心肌細(xì)胞將更加廣泛地拉伸出面外以模擬增加的血液對(duì)心室的填充，超過(guò)Frank-Marling曲線的頂點(diǎn)。對(duì)于生長(zhǎng)的腫瘤模型中的拉伸，拉伸將更加在面外。-隨時(shí)間施加拉伸的方式一次短的、連續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的或重復(fù)的。在心臟或內(nèi)皮模型中拉伸被重復(fù)施加。例如，在腫瘤模型中拉伸是連續(xù)并增加的。例如，在腦內(nèi)出血模型中， 拉伸是短的并且迅速增加到高/最大水平。-施用拉伸的時(shí)間周期例如具有在不同情況下心跳頻率的間歇(拉伸-收縮周期)；或者在腦中硬膜下血腫模型的情況下，在幾個(gè)小時(shí)期間拉伸緩慢增加；在腦內(nèi)出血模型的情況下，幾小時(shí)內(nèi)拉伸快速增加，在腦腫瘤模型的情況下非常緩慢。-個(gè)體細(xì)胞之間粘附的類型。拉伸降低細(xì)胞間粘附的程度取決于粘附分子連接的強(qiáng)度和調(diào)節(jié)這些連接的細(xì)胞過(guò)程。例如在癌模型的情況下，模擬癌細(xì)胞中特定致病改變需要的拉伸水平將被調(diào)節(jié)到細(xì)胞間粘附的強(qiáng)度，其對(duì)于不同的腫瘤可能是特異性的，這樣細(xì)胞層上的電阻被降低。上面描述的開(kāi)發(fā)疾病模型的方法非常適合于那些由細(xì)胞拉伸引發(fā)或改變的疾病， 導(dǎo)致異常的動(dòng)作電位或離子通道功能。實(shí)例是內(nèi)皮疾病(endothelial diseases)如動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓和偏頭痛；神經(jīng)系統(tǒng)疾病(neurological diseases)如揮鞭傷、震蕩、腦腫瘤、腦內(nèi)出血和硬膜下血腫；肌肉疾病如Ducherme，和胃腸疾病如腸易激綜合癥。需要注意的是，上面提及的實(shí)施方式說(shuō)明而不限制本發(fā)明，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)許多可選的實(shí)施方式而不偏離附加的權(quán)利要求的范圍。在權(quán)利要求中，任何置于括號(hào)中的附圖標(biāo)記將不解釋為限制權(quán)利要求。詞語(yǔ)“包含”不排除列于權(quán)利要求中的那些之外的要素或步驟的存在。在要素前的詞語(yǔ)“a”或“an”不排除存在多個(gè)這種要素。某些措施在相互不同的從屬權(quán)利要求中被描述的簡(jiǎn)單事實(shí)并不表示不能有利地使用這些措施的組合。
權(quán)利要求
1.用于測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的裝置，包含-承載有可變形疊層(34)的基板(10)，所述疊層通過(guò)空腔(3 從所述基板部分地分離以允許所述疊層的面外變形，所述疊層包含第一可變形層(16)、第二可變形層00)和夾在所述第一和第二可變形層間的多電極結(jié)構(gòu)(18)，所述第二可變形層承載有粘附到其上的心肌細(xì)胞08)的圖案；以及-安裝在所述基板上的液體容器(26)，用于使所述心肌細(xì)胞暴露于所述化學(xué)化合物。
2.權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述可變形疊層(34)的一端從所述基板(10)分離以方便當(dāng)所述心肌細(xì)胞(28)收縮時(shí)所述疊層的面外變形。
3.權(quán)利要求1所述的裝置，其中 -在所述基板(10)中形成所述空腔(32)； -所述疊層(34)在所述空腔上方延伸，并且-所述疊層的相對(duì)端連接到所述基板(10)，從而方便所述疊層(34)的由外部施加的力導(dǎo)致的面外變形。
4.權(quán)利要求3所述的裝置，進(jìn)一步包含用于用流體填充所述空腔(32)的進(jìn)口(36， 120)。
5.權(quán)利要求4所述的裝置，其中所述疊層(34)包含進(jìn)口(120)。
6.權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述心肌細(xì)胞08)的圖案是放射狀圖案。
7.權(quán)利要求3所述的裝置，其中所述疊層(34)是波紋狀的。
8.根據(jù)上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的裝置，其中所述疊層(34)的面外變形大于30%。
9.制造根據(jù)權(quán)利要求1的裝置的方法，包括在所述基板(10)上生長(zhǎng)氧化物層(12)； -在所述氧化物層上沉積所述第一可變形層(16)；-在所述第一可變形層上沉積并圖案化導(dǎo)電層(18)，從而形成所述多電極結(jié)構(gòu)；-在所述第一可變形層上沉積第二可變形層00)；-圖案化所述第二可變形層以提供到所述多電極結(jié)構(gòu)的通路；-在圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案04)；-將心肌細(xì)胞08)粘附至所述粘性圖案；-將所述液體容器06)粘附至所述第二可變形層；以及-在所述第一可變形層下面形成所述空腔(32)。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中在所述圖案化的第二可變形層上沉積粘性圖案04) 和將心肌細(xì)胞08)粘附至所述粘性圖案的步驟在所述空腔(3 在所述第一可變形層下面形成之后進(jìn)行。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中形成所述空腔(32)包括-在所述第一可變形層(16)的沉積前，在所述氧化物層(1 上沉積犧牲層(14)，所述犧牲層限定空腔體積；以及-在所述第二可變形層OO)的沉積后除去所述犧牲層。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中形成所述空腔(32)包括 -在所述基板(10)的背面上生長(zhǎng)掩模(50)；-圖案化所述掩模以限定空腔區(qū)域；-蝕刻所述基板的背面以暴露所述第一可變形層(14)；以及-從所述基板的背面移除所述圖案化的掩模。
13.權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括在形成所述氧化物層(1 前在所述基板 (10)中形成波紋狀圖案(10')。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中形成所述波紋狀圖案包括 -在所述基板(10)上沉積氧化硅層(12')；-在所述氧化硅層上沉積氮化硅層(50')； -圖案化所述氧化硅層和氮化硅層，從而暴露所述基板的選定部分； -將所述選定的部分暴露至一系列蝕刻步驟以形成所述波紋狀圖案；以及 -移除所述氧化硅層和氮化硅層。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述波紋狀圖案通過(guò)以下方式形成L0C0S氧化步驟，隨后是其中移除LOCOS氧化物的蝕刻步驟。
16.測(cè)定化學(xué)化合物的心臟毒性的方法，包括 -提供權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的裝置；-用含有所述化學(xué)化合物的介質(zhì)填充所述容器06)以使所述心肌細(xì)胞08)暴露于所述化合物；以及-測(cè)量所述心肌細(xì)胞對(duì)所述暴露的反應(yīng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述裝置用于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和/或藥物開(kāi)發(fā)的用途。
18.為由細(xì)胞拉伸導(dǎo)致或改變的疾病開(kāi)發(fā)疾病模型的方法，所述方法包括以下步驟 -將至少一個(gè)細(xì)胞附著至粘性表面圖案04)-通過(guò)外部施加的力拉伸所述至少一個(gè)細(xì)胞-以電學(xué)方式和/或光學(xué)方式測(cè)量所述至少一個(gè)細(xì)胞的動(dòng)作電位，隨時(shí)間監(jiān)測(cè)和/或解析所述動(dòng)作電位。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞的所述拉伸相對(duì)于所述粘性表面圖案是在面內(nèi)和/或面外。
20.根據(jù)權(quán)利要求18-19的方法，其中面內(nèi)細(xì)胞拉伸百分比大于30%并且拉伸時(shí)間是變化的。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20的方法，其中在測(cè)量期間添加化學(xué)或生物化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-21任一項(xiàng)的方法，其中所述疾病模型是心臟疾病模型。
全文摘要
公開(kāi)的是用于測(cè)定化學(xué)化合物心臟毒性的裝置，包含承載有可變形疊層(34)的基板(10)，所述疊層通過(guò)空腔(32)從所述基板部分分離以允許所述疊層的面外變形，所述疊層包含第一可變形層(16)、第二可變形層(20)和夾在所述第一和第二可變形層間的多電極結(jié)構(gòu)(18)，所述第二可變形層承載有粘附其上的心肌細(xì)胞(28)的圖案；以及安裝在所述基板上的液體容器(26)，用于使所述心肌細(xì)胞暴露于所述化學(xué)化合物。還公開(kāi)了制造這樣的裝置的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述裝置用于藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和/或藥物開(kāi)發(fā)的用途以及為由細(xì)胞的拉伸導(dǎo)致或改變的疾病開(kāi)發(fā)疾病模型的方法，特別是心臟疾病模型。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102333856SQ201080007261
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月9日
發(fā)明者德 斯托爾佩 A·范, R·德克 申請(qǐng)人:皇家飛利浦電子股份有限公司