專利名稱：用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器的制作方法
用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器本發(fā)明涉及生物反應(yīng)器以及使用這些生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中重要的是維持溶解氧、培養(yǎng)pH、溫度和剪切敏感性方面的物理化學(xué)環(huán)境。營養(yǎng)環(huán)境的維持也是重要的。培養(yǎng)條件的維持限制了進(jìn)行大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的可能性。特別是濃度梯度能夠抑制在大規(guī)模生物反應(yīng)器中哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞生長。本發(fā)明的目的之一是提供允許大規(guī)模體積培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器和方法。此外，本發(fā)明的目的是提供生物反應(yīng)器和方法，即使大規(guī)模體積生長，其也允許在最佳條件下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并由此允許與生物反應(yīng)器的尺寸無關(guān)的工藝性能和產(chǎn)量。本發(fā)明的目的是提供大規(guī)模生物反應(yīng)器，其允許在諸如pH、溶氧張力(DOT)和溫度之類的工藝參數(shù)方面的均相環(huán)境下培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在所述生物反應(yīng)器中保持良好的細(xì)胞懸浮和使?fàn)I養(yǎng)補(bǔ)料(feed)混合。此外，本發(fā)明的目的是提供設(shè)備和方法，所述設(shè)備和方法允許以大規(guī)模的方式生產(chǎn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物，尤其是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成的蛋白、肽、抗體或氨基酸。通過提供如權(quán)利要求書中所述的用于培養(yǎng)真核細(xì)胞、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器、生物反應(yīng)器系統(tǒng)和方法，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)問題。尤其是通過提供用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器，本發(fā)明解決構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述生物反應(yīng)器特征在于其具有至少兩個(gè)葉輪。此外，通過提供用于培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述方法特征在于在具有至少兩個(gè)葉輪的生物反應(yīng)器中，在合適的條件下和合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。此外，通過提供用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)特征在于具有至少500升體積的a)第一生物反應(yīng)器與體積大于所述第一生物反應(yīng)器并具有至少2000升體積的b)第二生物反應(yīng)器連接，并且其中所述具有至少2000升體積的第二生物反應(yīng)器與體積大于所述第二生物反應(yīng)器體積并具有至少兩個(gè)葉輪和至少10000升體積的c)第三生物反應(yīng)器連接。此外，通過提供培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，本發(fā)明解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題，所述方法特征在于a)在具有至少500升體積的第一生物反應(yīng)器中，在合適的條件下和合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，b)將通過增殖至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的含細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入具有至少2000升體積的第二生物反應(yīng)器，c)在所述具有至少2000升體積的第二生物反應(yīng)器中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，d)將在步驟c)中獲得的含細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入具有至少10000升體積的第三生物反應(yīng)器以及e)在所述具有至少10000升體積的第三生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以為例如人類細(xì)胞系、小鼠骨髓瘤(NOS)細(xì)胞系，中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系或雜交瘤細(xì)胞系。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選用于生產(chǎn)抗體，更優(yōu)選單克隆抗體，和/或重組蛋白，更優(yōu)選用于治療應(yīng)用的重組蛋白。所述細(xì)胞當(dāng)然可以生產(chǎn)肽、氨基酸、脂肪酸或其它有用的生化中間體或代謝產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，通過培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白的目標(biāo)濃度為大于0.5g/l，優(yōu)選大于 2.0g/l，最優(yōu)選大于10.0g/l。能夠以分批或補(bǔ)料分批的方式使用本發(fā)明的方法。雖然在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選為無蛋白培養(yǎng)基，但該設(shè)計(jì)不排除使用含蛋白流體 (stream)0根據(jù)本發(fā)明，生物反應(yīng)器為具有附加設(shè)備的生物相容性罐或容器，所述附加設(shè)備例如葉輪、擋板、分布器(sparger)和/或孔(port)，其尤其允許用于培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選所述罐或容器為管道的形式，在管道的兩末端(其優(yōu)選構(gòu)建罐的頂和底)具有平板。這些平板被稱為頂板和基板。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選實(shí)施方案中，基板為American Society of Mechanical Engineers Flanged and Dished (ASME F&D，美國機(jī)械工程師協(xié)會(huì) F&D)設(shè)計(jì)的基板。所述頂板設(shè)計(jì)優(yōu)選符合人孔或優(yōu)選裝凸緣的頂板以允許安裝/拆卸葉輪?？偣薷邽閺墓薜牡撞康墓迌?nèi)側(cè)至罐的頂部的罐內(nèi)側(cè)的切線。將自由空間(freeboard，凈空)高度定義為當(dāng)將生物反應(yīng)器填充至其操作體積時(shí)，在液體頂部之上直線側(cè)的長度。最小自由空間高度必需考慮在操作過程中形成泡沫的程度、在允許的最大攪拌和通氣下氣體容納以及液體測(cè)量誤差。本發(fā)明的生物反應(yīng)器具有的體積為優(yōu)選至少500升，更優(yōu)選至少1000升，更優(yōu)選至少4000升，甚至更優(yōu)選至少10000升，甚至更優(yōu)選至少20000升。最優(yōu)選地，本發(fā)明的生物反應(yīng)器具有的體積為1000升、1307升、4000升、5398升、20000升或27934升。優(yōu)選，生物反應(yīng)器具有最大體積100000升，更優(yōu)選，生物反應(yīng)器具有最大體積 50000升，最優(yōu)選生物反應(yīng)器具有最大體積30000升。本發(fā)明的生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)保證在所述生物反應(yīng)器中諸如pH、溶氧張力(DOT)和溫度之類的工藝參數(shù)方面的均相環(huán)境，保持良好混合細(xì)胞懸浮和使?fàn)I養(yǎng)補(bǔ)料混合。這為最佳的細(xì)胞生長、產(chǎn)物積累和產(chǎn)物質(zhì)量提供了必要的物理化學(xué)環(huán)境。本發(fā)明的生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)進(jìn)一步保證了維持幾何相似性。這允許在12升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和500升中試規(guī)模開發(fā)按比例縮小的模型。本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器具有至少兩個(gè)葉輪。更優(yōu)選，所述生物反應(yīng)器具有兩個(gè)葉輪，甚至更優(yōu)選頂部葉輪(top impeller)和底部葉輪(bottom impeller)。本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)頂部葉輪和至少一個(gè)底部葉輪，其中頂部葉輪優(yōu)選水翼式葉輪(hydrofoil impeller)。本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)頂部葉輪和至少一個(gè)底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。本發(fā)明的用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少1000升的體積以及至少一個(gè)頂部葉輪和至少一個(gè)底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。本發(fā)明用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少4000升的體積以及至少一個(gè)頂部葉輪和至少一個(gè)底部葉輪，其中頂部葉輪優(yōu)選水翼式葉輪。本發(fā)明用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少4000升的體積以及至少一個(gè)頂部葉輪和至少一個(gè)底部葉輪，其中頂部葉輪為水翼式葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，頂部葉輪為水翼式葉輪。優(yōu)選可使用頂部葉輪以提供強(qiáng)的主體混合。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，底部葉輪為水翼式葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，頂部葉輪和底部葉輪為水翼式葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少頂部葉輪為水翼式葉輪。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所有葉輪都為水翼式葉輪。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案，底部葉輪為大稠度斜葉式葉輪(high-solidity pitch-blade impeller)或大稠度水翼式葉輪。優(yōu)選可使用底部葉輪以分散分布的 (sparged)氣體。優(yōu)選地，水翼式葉輪提供大得多的液體運(yùn)動(dòng)，對(duì)于給定量的功率輸入導(dǎo)致更大的主體混合。這也可依賴于流量數(shù)(flow number, Nq)。優(yōu)選地，非水翼式葉輪能夠提供液體運(yùn)動(dòng)，但是在更大的功率輸入下提供。這對(duì)于剪切敏感性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的健康具有重要性。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，水翼式葉輪為向下流動(dòng)葉輪或向上流動(dòng)葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，頂部葉輪為向下流動(dòng)葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，頂部葉輪為向下流動(dòng)軸向水翼式葉輪。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用頂部葉輪下推特性來混合充分充氣的液體表面和液體主體。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，水翼式葉輪為高效水翼式葉輪。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，水翼式葉輪為Chemineer-SC-3型葉輪、LIGHTNIN-A310或A510型葉輪、 I^romix-PHF 型系列葉輪或 Cleaveland Eastern Mixers 葉輪。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，頂部葉輪為高效水翼式葉輪。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，頂部葉輪為Chemineer-SC-3型葉輪、LIGHTNIN-A310或A510型葉輪、 I^romix-PHF 型系列葉輪或 Cleaveland Eastern Mixers 葉輪。頂部葉輪優(yōu)選三葉水翼式設(shè)計(jì)的葉輪，例如來自LIGHTNIN的A310型葉輪。底部葉輪優(yōu)選四斜葉大稠度葉輪，例如來自LIGHTNIN的A315型葉輪。頂部葉輪(Dw/T)和/ 或底部葉輪(DlilZt)的葉輪與罐直徑之比優(yōu)選0.35以上至0.55以下，更優(yōu)選0.40以上至 0. 48以下，最優(yōu)選0. 44以上至0. 46以下。大于0. 5的直徑導(dǎo)致破壞軸向流動(dòng)，由此導(dǎo)致差的攪拌和充氣。頂部葉輪功率數(shù)(power number, Np)優(yōu)選0. 1以上至0. 9以下，更優(yōu)選0. 25以上至0. 35以下，最優(yōu)選0. 3。頂部葉輪流量數(shù)(N,)優(yōu)選0. 4以上至0. 9以下，更優(yōu)選0. 50以上至0. 60以下，最優(yōu)選0. 56。底部葉輪功率數(shù)(Np)優(yōu)選0.5以上至0.9以下，更優(yōu)選0. 70 以上至0.80以下，最優(yōu)選0.75。底部葉輪流量數(shù)(N,)優(yōu)選0.50以上至0. 85以下，更優(yōu)選 0. 70以上至0. 80以下，最優(yōu)選0. 73。葉輪功率數(shù)(Np)為將旋轉(zhuǎn)葉輪葉片的動(dòng)能傳遞至流體的葉輪效率的度量。量化氣體分散是重要的。葉輪流量數(shù)(N,)為葉輪泵送能力的度量標(biāo)準(zhǔn)且在量化流體主體運(yùn)動(dòng)方面是重要的。所述至少兩個(gè)葉輪的攪拌速率由規(guī)模決定。然而，在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)葉輪的攪拌速率為200轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)以下，更優(yōu)選165rpm以下。葉輪間距(Ds)為所述至少兩個(gè)葉輪間的距離。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，其為IX底部葉輪的直徑(D底)以上至2XD底以下，更優(yōu)選其為1.2^XD底或2XD底。 這將允許兩葉輪在最小接種后體積下均保持浸沒。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，上葉輪(upper impeller)以上的液體高度(D0)為0.3X頂部葉輪的直徑(D頂)以上至2.5XD頂以下。更優(yōu)選其為0. 5XD頂以上至 2. 0XDw。底部間隙(D。)為罐底部與底部葉輪中心線間的間隙。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，其為0. 35XD底以上，更優(yōu)選其為0. 4XD底或0. 75XD底。在本發(fā)明的生物反應(yīng)器中，葉輪的設(shè)計(jì)在主體混合、氣體分散和低剪切力方面提供了最佳的流體動(dòng)力學(xué)特性。通過經(jīng)由本發(fā)明的葉輪系統(tǒng)的攪拌，將哺乳動(dòng)物細(xì)胞保持在勻相懸浮液中。在本發(fā)明的生物反應(yīng)器中，葉輪的設(shè)計(jì)提供了快速混合、保持勻相、保持哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮和氣泡分散。在本發(fā)明的生物反應(yīng)器中，葉輪的設(shè)計(jì)使由剪切力造成的細(xì)胞損傷最小化，所述剪切力源自葉輪幾何結(jié)構(gòu)以及在葉輪葉片后面產(chǎn)生的漩渦或渦流。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少兩個(gè)葉輪為頂部驅(qū)動(dòng)攪拌系統(tǒng)。優(yōu)選通過至少一個(gè)分布器釋放來供應(yīng)空氣，尤其是壓縮空氣，或特定氣體，優(yōu)選氧氣、氮?dú)夂?或C02。本發(fā)明的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)分布器，更優(yōu)選所述生物反應(yīng)器具有一個(gè)分布器或兩個(gè)分布器。本發(fā)明的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有兩個(gè)分布器。優(yōu)選所述生物反應(yīng)器具有至少一個(gè)管幾何結(jié)構(gòu)分布器。優(yōu)選至少一個(gè)分布器為槽式(flute-type)或?yàn)闊Y(jié)的分布器。優(yōu)選至少一個(gè)分布器為槽式。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用了新月形管道。 新月形的曲率優(yōu)選為0.8XD&為了有助于從生物反應(yīng)器的側(cè)孔安裝和移出，所述新月形圓周優(yōu)選0.8XD底圈的完整圓周的。至少一個(gè)分布器提供充分的氧傳質(zhì)(通過體積傳質(zhì)系數(shù)(Kp)來表征)以滿足培養(yǎng)物的氧需求。所述至少一個(gè)分布器提供I^a高達(dá)2( -1,用于培養(yǎng)具有每小時(shí)5mmol/l氧攝取速率的多達(dá)每毫升20X IO6個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)物。用作雙分布器系統(tǒng)的兩個(gè)分布器允許去除溶解的CO2和控制溶氧張力(DOT)。槽式分布器提供了容易就地清洗(CIP)和就地消毒 (SIP)、幫助d(X)2去除并由于其多種用途而減少操作成本的益處。燒結(jié)分布器提供較高的 K^值。槽式分布器設(shè)計(jì)的較低固有I^a值能夠通過使用富氧空氣得到補(bǔ)償。氣體流動(dòng)速度在恒定表觀氣速的基礎(chǔ)上按比例增加。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)中，重要的是保持在溶解氧、培養(yǎng)pH和溫度、以及溶解CO2、營養(yǎng)物和代謝物濃度梯度方面的均相物理化學(xué)環(huán)境。在通過使用適當(dāng)攪拌和充氣而確保物理化學(xué)環(huán)境為均相的同時(shí)，重要的是確保所選的攪拌和充氣操作條件不產(chǎn)生不利的剪切環(huán)境。本發(fā)明涉及在確保均相環(huán)境和同時(shí)使剪切環(huán)境的不利影響最小化之間的適當(dāng)平衡，所述均相環(huán)境將促進(jìn)良好的細(xì)胞生長和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的產(chǎn)率。這將通過限定以下來實(shí)現(xiàn)特定生物反應(yīng)器幾何結(jié)構(gòu)、葉輪設(shè)計(jì)和定位、分布器設(shè)計(jì)和定位以及特定的用于攪拌和充氣速率的操作限制。在攪動(dòng)和分布的生物反應(yīng)器中對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要損害來自界面剪切。當(dāng)分布?xì)馀莺喜⒑推屏褧r(shí)發(fā)生界面剪切[參考文獻(xiàn)Ma N,Koelling Kff,Chalmers JJ. Biotechnol Bioeng. 2002 Nov 20 ；80 (4) :428-37.勘誤于Biotechnol Bioeng. 2003 Feb 5 ；81 (3) 379]。因此，期望使分布?xì)怏w的流動(dòng)和泡沫的過度產(chǎn)生最小化。界面剪切能夠通過合并以下方法而最小化首先，通過借助液體表面和液體主體的良好混合來促進(jìn)表面充氣，其次， 通過借助優(yōu)選兩個(gè)分布器來分開進(jìn)行培養(yǎng)物的充氧。水翼式葉輪的指定位置，尤其是上葉輪以上的液體高度( )，優(yōu)選為液體表面下約0. 5XDW，這能夠幫助強(qiáng)且連續(xù)的液體表面和液體主體的交換，從而使充分充氧的液體表面和不充分充氧的液體主體混合。規(guī)定的葉輪間距優(yōu)選為Ds= 1乂0/!|至2乂0；!|，這能夠允許由上葉輪產(chǎn)生的液體的向下流動(dòng)去補(bǔ)充流入下葉輪(lower impeller)的液體，由此保證整個(gè)流動(dòng)主體良好混合且不產(chǎn)生單獨(dú)的混合區(qū)域。規(guī)定的葉輪底部間隙優(yōu)選為D。= 0. 35XD至0. 75XD，這能確保主體流動(dòng)能夠偏離彎曲的ASME F&D基底并沿著生物反應(yīng)器的壁上升。流經(jīng)控制分布器的“按需”充氧分布?xì)怏w從流經(jīng)鎮(zhèn)流分布器(ballast sparger)的非充氧分布?xì)怏w(如CO2、空氣和氮?dú)怄?zhèn)流(ballast))的分離，能夠允許在流體中的高度充氧的分布?xì)馀菰趶牧黧w主體中分離并進(jìn)入頂部空間之前更長的駐留時(shí)間和路徑長度。對(duì)于給定容積的傳質(zhì)系數(shù)ky這能夠允許提供更大的氧傳輸速率。分布?xì)馀莸鸟v留時(shí)間和路徑長度還可以通過限定向下流動(dòng)軸向水翼式葉輪來進(jìn)一步延長，所述向下流動(dòng)軸向水翼式葉輪連續(xù)向下推動(dòng)液體表面和液體主體。本發(fā)明的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)擋板，更優(yōu)選具有至少兩個(gè)擋板。本發(fā)明的生物反應(yīng)器最優(yōu)選具有四個(gè)擋板。擋板為垂直輻射狀設(shè)置的板。擋板用于防止形成漏斗或形成渦旋。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)擋板的長度為1. IX生物反應(yīng)器的總直線高度。擋板寬度(W)優(yōu)選為0. IX罐內(nèi)部直徑(T)。擋板間隙(Wc)優(yōu)選為0. OlX 罐內(nèi)部直徑(T)。所述至少一個(gè)擋板的高度(Heft)優(yōu)選為1. IX總直線高度(H)-生物反應(yīng)器頂部高度(Hh)。因此，Heft優(yōu)選根據(jù)式Heft= 1. IXH-Hh來計(jì)算。不限定所述至少一個(gè)擋板的厚度，但該厚度應(yīng)確保對(duì)流體流的徑向分量的剛性。 需要額外的厚度以確保在SIP期間擋板不被變形從而影響擋板至罐壁的間隙。本發(fā)明的生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少兩個(gè)用于添加堿的孔。更優(yōu)選，所述生物反應(yīng)器具有兩個(gè)用于添加堿的孔。最優(yōu)選，生物反應(yīng)器具有兩個(gè)用于添加堿的孔，其中第一個(gè)孔位于底部葉輪的中線，第二個(gè)孔位于頂部葉輪的中線。優(yōu)選，PH探頭(probe)與堿添加孔在直徑方向相對(duì)地位于生物反應(yīng)器中。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有1000升的體積。1000升的生物反應(yīng)器的頂部體積(Vh)優(yōu)選45升以上至65升以下，更優(yōu)選頂部體積為55升。1000升的生物反應(yīng)器的基部體積(Vb)優(yōu)選45升以上至65升以下，更優(yōu)選基部體積為55升。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的罐內(nèi)部直徑(T)優(yōu)選850mm以上至900mm以下，更優(yōu)選罐內(nèi)部直徑為864mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的罐橫截面面積(A)優(yōu)選0. 55m2以上至0. 65m2以下，更優(yōu)選罐橫截面面積為0. 586m2。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的頂部高度(Hh)(其為頂板的高度)，和/或基部高度(Hb)(其為基板的高度)優(yōu)選為120mm以上至180mm以下， 更優(yōu)選頂部高度和/或基部高度為151mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的總罐高度優(yōu)選
82000mm以上至^OOmm以下，更優(yōu)選總罐高度為2347mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的頂部葉輪直徑(Dw)和/或底部葉輪直徑(D底)優(yōu)選350mm以上至400mm以下，更優(yōu)選頂部葉輪直徑和/或底部葉輪直徑為381mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的罐底部與底部葉輪中線的間隙(D。)優(yōu)選120mm以上至180mm以下，更優(yōu)選該間隙為152mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的所述至少兩個(gè)葉輪間的距離(也稱為葉輪間距(Ds)優(yōu)選730mm以上至790mm以下，更優(yōu)選該葉輪間距為762mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的葉輪軸直徑優(yōu)選為102mm 以上至152mm以下。如果本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器具有擋板，則擋板的長度優(yōu)選2000mm 以上至MOOmm以下，更優(yōu)選該長度為2250mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的擋板寬度優(yōu)選70mm以上至IOOmm以下，更優(yōu)選該寬度為86mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的擋板間隙優(yōu)選7mm以上至Ilmm以下，更優(yōu)選該擋板間隙為9mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的擋板高度(Heft)優(yōu)選2000mm以上至2200mm以下，更優(yōu)選該擋板高度為2099mm。本發(fā)明的 1000升生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)分布器，更優(yōu)選其具有一個(gè)分布器。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的至少一個(gè)分布器優(yōu)選具有1. 5mm以上至2. 5mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優(yōu)選該噴嘴徑或孔徑為2mm。噴嘴數(shù)或孔數(shù)優(yōu)選為20以上至40以下，更優(yōu)選該噴嘴數(shù)或孔數(shù)為 30。分布器長度(SL)優(yōu)選為150mm以上至550mm以下，更優(yōu)選該分布器長度為305mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的分布器至罐底的間隙(Sc)優(yōu)選50mm以上至75mm以下，更優(yōu)選分布器至罐底的間隙為64mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的分布器至底部葉輪的間隙 (Dc-Sc)優(yōu)選75mm以上至IOOmm以下，更優(yōu)選分布器至底部葉輪的間隙為88mm。
在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有體積4000升。4000升的生物反應(yīng)器的頂部體積(Vh)優(yōu)選340升以上至370升以下，更優(yōu)選頂部體積為359升。4000升的生物反應(yīng)器的基部體積(Vb)優(yōu)選340升以上至370升以下，更優(yōu)選基部體積為359升。 本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的罐內(nèi)部直徑(T)優(yōu)選1600mm以上至1650mm以下，更優(yōu)選罐內(nèi)部直徑為16沈讓。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的罐橫截面面積(A)優(yōu)選1. 90m2以上至2. 30m2以下，更優(yōu)選罐橫截面面積為2. 076m2。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的頂部高度 (Hh)和/或基部高度(Hb)優(yōu)選260mm以上至300mm以下，更優(yōu)選該頂部高度和/或基部高度為觀2讓。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的總罐高度優(yōu)選2300mm以上至3100mm以下，更優(yōu)選總罐高度為觀17讓。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的頂部葉輪直徑(Dw)和/或底部葉輪直徑(Dlil)優(yōu)選680mm以上至740mm以下，更優(yōu)選頂部葉輪直徑和/或底部葉輪直徑為710mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的罐底部與底部葉輪中線的間隙(D。)優(yōu)選500mm 以上至560mm以下，更優(yōu)選該間隙為531mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的所述至少兩個(gè)葉輪間的距離(也稱為葉輪間距(Ds)優(yōu)選840mm以上至900mm以下，更優(yōu)選該葉輪間距為 872mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的葉輪軸直徑優(yōu)選為51mm以上至64mm以下。如果本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器具有擋板，則該擋板的長度優(yōu)選為2200mm以上至^OOmm以下， 更優(yōu)選該長度為M77mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的擋板寬度優(yōu)選150mm以上至180mm 以下，更優(yōu)選該寬度為163mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的擋板間隙優(yōu)選12mm以上至 20mm以下，更優(yōu)選該擋板間隙為16mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的擋板高度(Heft)優(yōu)選2100mm以上至2300mm以下，更優(yōu)選該擋板高度為2195mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)分布器，更優(yōu)選其具有一個(gè)分布器。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的至少一個(gè)分布器優(yōu)選具有1. 5mm以上至2. 5mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優(yōu)選該噴嘴徑或孔徑為2mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的噴嘴數(shù)或孔數(shù)優(yōu)選為80以上至120以下，更優(yōu)選該噴嘴數(shù)或孔數(shù)為100。分布器長度(SL)優(yōu)選為250mm以上至800mm以下，更優(yōu)選該分布器長度為568mm。本發(fā)明的4000升生物反應(yīng)器的分布器至罐底部的間隙(Sc)優(yōu)選315mm以上至360mm以下，更優(yōu)選分布器至罐底部的間隙為337mm。本發(fā)明的1000升生物反應(yīng)器的分布器至底部葉輪的間隙(D。-S。)優(yōu)選180mm以上至205mm以下，更優(yōu)選分布器至底部葉輪的間隙為194mm。 在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器具有20000升的體積。20000升的生物反應(yīng)器的頂部體積(Vh)優(yōu)選1600升以上至2000升以下，更優(yōu)選頂部體積為1803升。 20000升的生物反應(yīng)器的基部體積(Vb)優(yōu)選1600升以上至2000升以下，更優(yōu)選基部體積為1803升。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的罐內(nèi)部直徑(T)優(yōu)選2500mm以上至3000mm 以下，更優(yōu)選罐內(nèi)部直徑為2794mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的罐橫截面面積(A)優(yōu)選5. Sm2以上至6. 5m2以下，更優(yōu)選罐橫截面面積為6. 131m2。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的頂部高度(Hh)和/或基部高度(Hb)優(yōu)選460mm以上至500mm以下，更優(yōu)選該頂部高度和/或基部高度為485mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的總罐高度優(yōu)選4800mm以上至 5100mm以下，更優(yōu)選總罐高度為4933mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的頂部葉輪直徑(D 頂)禾P /或底部葉輪直徑(D底)優(yōu)選IlOOmm以上至1300mm以下，更優(yōu)選頂部葉輪直徑和/ 或底部葉輪直徑為1219mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的罐底部與底部葉輪中線的間隙 (Dc)優(yōu)選890mm以上至945mm以下，更優(yōu)選該間隙為913mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的所述至少兩個(gè)葉輪間的距離(也稱為葉輪間距(Ds)優(yōu)選1200mm以上至1700mm以下，更優(yōu)選該葉輪間距為1498mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的葉輪軸直徑優(yōu)選為51mm以上至64mm以下。如果本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器具有擋板，則擋板的長度優(yōu)選4000mm以上至4600mm以下，更優(yōu)選該長度為4365mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的擋板寬度優(yōu)選 260mm以上至^Omm以下，更優(yōu)選該寬度為279mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的擋板間隙優(yōu)選20mm以上至35mm以下，更優(yōu)選該擋板間隙為觀讓。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的擋板高度(Heft)優(yōu)選3600mm以上至4050mm以下，更優(yōu)選該擋板高度為3882mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)分布器，更優(yōu)選其具有兩個(gè)分布器。如果本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器具有兩個(gè)分布器，則一個(gè)優(yōu)選為控制分布器，一個(gè)優(yōu)選為鎮(zhèn)流分布器。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的控制分布器優(yōu)選具有3mm以上至5mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優(yōu)選該噴嘴徑或孔徑為4mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的鎮(zhèn)流分布器優(yōu)選具有 5mm以上至7mm以下的噴嘴徑或孔徑，更優(yōu)選該噴嘴徑或孔徑為6mm。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的控制分布器的噴嘴數(shù)/孔數(shù)優(yōu)選為230以上至270以下，更優(yōu)選該噴嘴數(shù)或孔數(shù)為250。本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的鎮(zhèn)流分布器的噴嘴數(shù)或孔數(shù)優(yōu)選為85以上至 115以下，更優(yōu)選該噴嘴數(shù)或孔數(shù)為100。用于控制和/分布器或鎮(zhèn)流分布器的分布器長度 (Sl)優(yōu)選500mm以上至2000mm以下，更優(yōu)選該分布器長度為1077mm。對(duì)于控制分布器和/ 或鎮(zhèn)流分布器，本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的分布器至罐底的間隙(S。)優(yōu)選560mm以上至620mm以下，更優(yōu)選分布器至罐底的間隙為593mm。對(duì)于控制分布器和/或鎮(zhèn)流分布器， 本發(fā)明的20000升生物反應(yīng)器的分布器至底部葉輪的間隙(D。-S。)優(yōu)選300mm以上至:340mm 以下，更優(yōu)選分布器至底部葉輪的間隙為320mm。從分離的分布器添加鎮(zhèn)流(鎮(zhèn)流分布器) 的要求，防止用鎮(zhèn)流氣體稀釋氧或富氧DOT需求氣體。為確保最好的氧傳輸速率(OTR)，從分布器形成的氣泡的氧濃度梯度是最大的。其次，使用鎮(zhèn)流分布器允許將分布器安置在不同的位置以避免為了 PC02控制而傳遞需要的鎮(zhèn)流時(shí)影響DOT控制。鎮(zhèn)流分布器能夠獨(dú)立于控制分布器而設(shè)計(jì)。用本發(fā)明的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)，能夠完成不同的傳代培養(yǎng)比。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，完成的傳代培養(yǎng)比為1比5(20% V/V)以上至1比9(11%V/V)以下，更優(yōu)選1 比5(20% V/V)或1比9(11% V/V)的傳代培養(yǎng)比。本發(fā)明還包括培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，特征在于，在本發(fā)明的生物反應(yīng)器中在合適的培養(yǎng)基中在合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的生物反應(yīng)器包括具有至少兩個(gè)葉輪并顯示上述至少一個(gè)特征或不同特征的組合的所有生物反應(yīng)器。在本發(fā)明的方法中，生物反應(yīng)器的至少兩個(gè)葉輪的攪拌速率優(yōu)選55W/m3以上至 85ff/m3以下。優(yōu)選地，以至少5X 10_5m/S的速度，更優(yōu)選以至少IOX 10_5m/S的速度，將空氣分布入培養(yǎng)基中。在本發(fā)明一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過優(yōu)選在空間上彼此分離的兩個(gè)添加孔加入堿，以分散堿。如果在罐中發(fā)生長再循環(huán)時(shí)間，這確保堿的快速混合。優(yōu)選通過控制分布器來添加CO2。優(yōu)選使用堿和/或(X)2來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。優(yōu)選控制探頭和備用探頭位于距罐底部913mm的下孔圈。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法發(fā)生于體積為1000升的生物反應(yīng)器中。在使用1000升生物反應(yīng)器的方法中，使用的培養(yǎng)基體積優(yōu)選在接種前期間為50 升至250升。在接種后期間，培養(yǎng)基的體積優(yōu)選300升以上至960升以下。在轉(zhuǎn)移前/收獲期，在1000升生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基體積優(yōu)選300升以上至960升以下。在本發(fā)明的具有1000升體積的生物反應(yīng)器中，最小操作體積(V·、)優(yōu)選在80升至120升之間，更優(yōu)選該最小操作體積為100升，最大操作體積(V)優(yōu)選900升以上至1100升以下，該最大操作體積更優(yōu)選為1000升。最小攪拌體積優(yōu)選為230升以上至255升以下，更優(yōu)選最小攪拌體積為245升。在具有1000升體積的生物反應(yīng)器中，在最小操作體積時(shí)的液體高度(H·、)優(yōu)選210mm以上至240mm以下，更優(yōu)選在最小操作體積時(shí)該液體高度為2觀讓。在具有1000 升體積的生物反應(yīng)器中，在最大操作體積時(shí)的液體高度( )優(yōu)選1500mm以上至1900mm以下，更優(yōu)選在最大操作體積時(shí)該液體高度為1764mm。最小高寬比(Η·、/Τ)優(yōu)選0. 15以上至0. 19以下，更優(yōu)選該最小高寬比為0. 17。在本發(fā)明的方法中使用的具有1000升體積的生物反應(yīng)器的最大高寬比Ot-T)優(yōu)選1. 8以上至2. 1以下，更優(yōu)選該最大高寬比為1. 96。 自由空間體積優(yōu)選270升以上至310升以下，更優(yōu)選該自由空間體積為293升。自由空間高度優(yōu)選450mm以上至550mm以下，更優(yōu)選該自由空間高度為500mm?？傊本€高度(H)優(yōu)選 1900mm以上至2200mm以下，更優(yōu)選總直線高度為2045mm。上探頭圈(probe-ring)或樣品圈(sample-ring)的高度優(yōu)選900mm以上至1200mm以下，更優(yōu)選上探頭圈或樣品圈的高度為1093mm。下探頭圈或樣品圈的高度優(yōu)選152mm以上至觀6讓以下。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法發(fā)生在體積為4000升的生物反應(yīng)器中。在使用4000升生物反應(yīng)器的方法中，使用的培養(yǎng)基體積優(yōu)選在接種前期間為1914 升至3077升。在接種后期間，培養(yǎng)基的體積優(yōu)選2153升以上至3846升以下。在轉(zhuǎn)移前/
11收獲期，在4000升生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基體積優(yōu)選2153升以上至3846升以下。在本發(fā)明的具有4000升體積的生物反應(yīng)器中，最小操作體積(V·、)優(yōu)選在1500升至2200升之間， 更優(yōu)選該最小操作體積為1900升，最大操作體積(V)優(yōu)選3800升以上至4200升以下，該最大操作體積更優(yōu)選為4000升。最小攪拌體積優(yōu)選1500升以上至1800升以下，更優(yōu)選最小攪拌體積為16M升。在具有4000升體積的生物反應(yīng)器中，在最小操作體積下的液體高度 (ΗΛ/>)優(yōu)選800mm以上至1200mm以下，更優(yōu)選在最小操作體積下的液體高度為1024mm。在具有4000升體積的生物反應(yīng)器中，在最大操作體積時(shí)的液體高度( )優(yōu)選1800mm以上至 2200mm以下，更優(yōu)選在最大操作體積時(shí)該液體高度為2034mm。最小高寬比(H^、/T)優(yōu)選 0. 55以上至0.75以下，更優(yōu)選該最小高寬比為0.63。在本發(fā)明的方法中使用的具有4000 升體積的生物反應(yīng)器的最大高寬比Ot-T)優(yōu)選1. 1以上至1. 4以下，更優(yōu)選該最大高寬比為1.25。自由空間體積優(yōu)選850升以上至1250升以下，更優(yōu)選該自由空間體積為1039升。 自由空間高度優(yōu)選450mm以上至550mm以下，更優(yōu)選該自由空間高度為500mm?？傊本€高度 (H)優(yōu)選2000mm以上至MOOmm以下，更優(yōu)選總直線高度為2252mm。上探頭圈或樣品圈的高度優(yōu)選1200mm以上至1600mm以下，更優(yōu)選上探頭圈或樣品圈的高度為1403mm。下探頭圈或樣品圈的高度優(yōu)選500mm以上至550mm以下，更優(yōu)選下探頭圈或樣品圈的高度為531mm。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法發(fā)生在體積為20000升的生物反應(yīng)器中。在使用20000升生物反應(yīng)器的方法中，使用的培養(yǎng)基體積優(yōu)選在接種前期間為 13913升至17096升。在接種后期間培養(yǎng)基的體積優(yōu)選17391升以上至19231升以下。在轉(zhuǎn)移前/收獲期，在20000升生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基體積優(yōu)選20000升以上至21739升以下。在本發(fā)明的具有20000升體積的生物反應(yīng)器中，最小操作體積(V^、)優(yōu)選在9000升至16000升之間，更優(yōu)選該最小操作體積為13000升，最大操作體積(V)優(yōu)選19000升以上至25000升以下，該最大操作體積更優(yōu)選為22000升。最小攪拌體積優(yōu)選為8100升以上至 8500升以下，更優(yōu)選最小攪拌體積為8379升。在具有20000升體積的生物反應(yīng)器中，在最小操作體積時(shí)的液體高度(H·、)優(yōu)選2100mm以上至2500mm以下，更優(yōu)選在最小操作體積時(shí)該液體高度為2309mm。在具有20000升體積的生物反應(yīng)器中，在最大操作體積時(shí)的液體高度( )優(yōu)選3550mm以上至3950mm以下，更優(yōu)選在最大操作體積時(shí)該液體高度為3777mm。 最小高寬比(Η·、/Τ)優(yōu)選0. 70以上至0. 99以下，更優(yōu)選該最小高寬比為0. 83。在本發(fā)明的方法中使用的具有20000升體積的生物反應(yīng)器的最大高寬比Ot-T)優(yōu)選1. 2以上至1. 5 以下，更優(yōu)選該最大高寬比為1.35。自由空間體積優(yōu)選5750升以上至6500升以下，更優(yōu)選該自由空間體積為6131升。自由空間高度優(yōu)選900mm以上至IlOOmm以下，更優(yōu)選該自由空間高度為1000mm?？傊本€高度(H)優(yōu)選3700mm以上至4100mm以下，更優(yōu)選總直線高度為3968mm。上探頭圈或樣品圈的高度優(yōu)選2200mm以上至沈50讓以下，更優(yōu)選上探頭圈或樣品圈的高度為Ml 1mm。下探頭圈或樣品圈的高度優(yōu)選880mm以上至940mm以下，更優(yōu)選下探頭圈或樣品圈的高度為913mm。對(duì)于具有20000升體積的生物反應(yīng)器，優(yōu)選使用的接種比為11 % ν/ν (1比9稀釋) 或20% ν/ν(1比5稀釋)，優(yōu)選的補(bǔ)料應(yīng)用為接種后體積的4% ν/ν至25% ν/ν。優(yōu)選調(diào)整20000升生物反應(yīng)器中接種后的體積，使補(bǔ)料應(yīng)用達(dá)15%，以便在添加所有補(bǔ)料后到收獲時(shí)最終體積為20000升。然而，對(duì)于大于15% ν/ν的補(bǔ)料應(yīng)用，優(yōu)選為了 15% ν/ν補(bǔ)料而調(diào)整接種后體積，但在補(bǔ)料應(yīng)用后，最終收獲前體積將為最小20000升至最大22000升。期望20000升生物反應(yīng)器在批次結(jié)束時(shí)容納總共20000升至22000升。具有20000升體積的生物反應(yīng)器優(yōu)選以10至15天的分批或分批補(bǔ)料模式來操作。本發(fā)明還包括用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，所述生物反應(yīng)器系統(tǒng)特征在于具有至少500升、優(yōu)選至少1000升體積的a)第一生物反應(yīng)器與體積大于第一生物反應(yīng)器體積并具有至少2000升、優(yōu)選至少4000升體積的b)第二生物反應(yīng)器連接，并且其中所述具有至少2000升、優(yōu)選至少4000升體積的第二生物反應(yīng)器與本發(fā)明的體積大于第二生物反應(yīng)器體積并具有至少10000升、優(yōu)選至少20000升體積的c)第三生物反應(yīng)器連接。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器系統(tǒng)特征在于生物反應(yīng)器中至少一種為本發(fā)明的生物反應(yīng)器。更優(yōu)選，生物反應(yīng)器系統(tǒng)的所有生物反應(yīng)器均為本發(fā)明的生物反應(yīng)器。在本文中，本發(fā)明的生物反應(yīng)器為在說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書中描述的所有生物反應(yīng)器。本發(fā)明的生物反應(yīng)器也稱為生物反應(yīng)器列(train)或設(shè)備。生物反應(yīng)器列優(yōu)選包括不同的生物反應(yīng)器，其也稱為階段。具有至少500升、優(yōu)選至少1000升體積的生物反應(yīng)器對(duì)應(yīng)于階段N-3和/或N-2。具有至少2000升、優(yōu)選至少 4000升體積的生物反應(yīng)器對(duì)應(yīng)于階段N-I。具有至少10000升、優(yōu)選至少20000升體積的生物反應(yīng)器對(duì)應(yīng)于階段N。根據(jù)需要設(shè)計(jì)生物反應(yīng)器列，以確保諸如pH、溶氧張力(DOT)和溫度之類的工藝參數(shù)方面的均相環(huán)境，在所述生物反應(yīng)器中保持良好混合的細(xì)胞懸浮和使?fàn)I養(yǎng)補(bǔ)料混合。 生物反應(yīng)器列的生物反應(yīng)器優(yōu)選顯示幾何相似性。這允許在例如12升實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；?00 升中試規(guī)模開發(fā)按比例縮小模型。將階段N-3、N-2和N-I的生物反應(yīng)器用作種子生物反應(yīng)器。將階段N的生物反應(yīng)器用作生產(chǎn)生物反應(yīng)器。優(yōu)選基于相同的原理設(shè)計(jì)種子生物反應(yīng)器和生產(chǎn)生物反應(yīng)器。然而，可以要求一些偏差以適應(yīng)工藝中的靈活性。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，高寬比Η/Γ為0. 17以上至1. 96以下。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在另一生物反應(yīng)器，尤其是對(duì)應(yīng)于階段N-4 的50升生物反應(yīng)器。在本發(fā)明一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，N-4生物反應(yīng)器是S-200Seed wave生物反應(yīng)器或100升攪拌罐反應(yīng)器。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，液體(例如培養(yǎng)基)能夠通過氣動(dòng)輔助流動(dòng)或通過蠕動(dòng)泵從一個(gè)生物反應(yīng)器運(yùn)輸至另一生物反應(yīng)器。本發(fā)明還包括培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，所述方法特征在于a)在具有至少500升體積、優(yōu)選具有至少1000升體積的第一生物反應(yīng)器中，在合適的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，b)將通過增殖至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而獲得的含細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入具有至少2000升體積、優(yōu)選具有至少4000升體積的第二生物反應(yīng)器，c)在所述具有至少2000升體積、優(yōu)選具有至少4000升體積的第二生物反應(yīng)器中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，d)將在步驟c)中獲得的含細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入具有至少10000升體積、優(yōu)選具有至少 20000升體積的第三生物反應(yīng)器，以及e)在具有至少10000升體積、優(yōu)選具有至少20000升體積的第三生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法特征在于所使用的生物反應(yīng)器中至少一種為本發(fā)明的生物反應(yīng)器，更優(yōu)選所使用的所有生物反應(yīng)器都是本發(fā)明的生物反應(yīng)器。在本文中，本發(fā)明的生物反應(yīng)器為在說明書、實(shí)施例和權(quán)利要求書中描述的所有生物反應(yīng)器。步驟e)的生物反應(yīng)器優(yōu)選以分批或分批補(bǔ)料模式來操作。優(yōu)選將細(xì)胞在步驟e) 中培養(yǎng)10至15天。步驟a)也稱為階段N-3和/或N_2。步驟c)也稱為階段N_1。步驟e)也稱為階段N。優(yōu)選在步驟a)、c)和e)的生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)條件相同。更優(yōu)選，在步驟a)、c) 和e)的生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)條件諸如pH、溶氧張力和溫度的工藝參數(shù)方面的均相環(huán)境。優(yōu)選在步驟a)、c)和e)中生物反應(yīng)器中的pH、溶氧張力和溫度相同。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)移步驟b)和/或d)之后的接種比為至少 10% v/v，更優(yōu)選11% v/v(l比9稀釋)以上至30% ν/ν以下，更優(yōu)選20% ν/ν (1比5稀釋)。優(yōu)選在步驟b)和d)中轉(zhuǎn)移全部培養(yǎng)基或僅部分培養(yǎng)基。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案為從屬權(quán)利要求中的主題(subject-matter)。在接下來的實(shí)施例和附圖中將更詳細(xì)地說明本發(fā)明。

圖1顯示了本發(fā)明的生物反應(yīng)器。1為生物反應(yīng)器。10為罐(T)的直徑。20為生物反應(yīng)器的總直線高度(H)。30為生物反應(yīng)器的基部高度(Hb)。40為生物反應(yīng)器的頂部高度(Hh)。50為最大操作體積時(shí)的液體高度(HJ。60為頂部葉輪直徑(Dw)。68為頂部葉輪。70為底部葉輪直徑(Dlis)15 78為底部葉輪。80為罐底部與底部葉輪中線之間的間隙(Dc)。90為葉輪間距(Ds)。100為液體表面以下至頂部葉輪的間隙(D。)。108為分布器。110為分布器至罐底部的間隙(S。)。120為分布器至底部葉輪的間隙(D。-S。)。128為擋板。138為位于下圈的孔。148為位于頂部葉輪68中線的孔。圖2顯示了本發(fā)明的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。111為具有1000升體積的生物反應(yīng)器。11 為具有4000升體積的生物反應(yīng)。1為本發(fā)明的具有20000升體積的生物反應(yīng)器。實(shí)施例1 :20000升生物反應(yīng)器對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，20000升生物反應(yīng)器以分批或分批補(bǔ)料的模式運(yùn)行10至 15天。通過經(jīng)由葉輪系統(tǒng)的攪拌從而將哺乳動(dòng)物細(xì)胞保持在均相懸浮液中。容器幾何結(jié)構(gòu)用于20000升生物反應(yīng)器的容器幾何結(jié)構(gòu)通過反復(fù)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)來確定，在所述反復(fù)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)中改變最大工作體積、自由空間直線側(cè)距離、高寬比凡/T以及葉輪與罐直徑D/T 的比例，直到實(shí)現(xiàn)可接受的高寬比。生物反應(yīng)器高寬比氏/T此關(guān)鍵設(shè)計(jì)參數(shù)允許對(duì)生物反應(yīng)器幾何結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。具有較高高寬比的罐提供較長氣體駐留時(shí)間，其允許較大的Kp。然而，增加的頂部壓力能夠引起可溶氣體的形成。在罐中較低的高寬比凡/τ可導(dǎo)致較短的氣體駐留時(shí)間，從而要求較大氣流用于充氣，導(dǎo)致更多的泡沫產(chǎn)生。還通過Η/Γ來限制葉輪驅(qū)動(dòng)的攪拌以增加Κρ，因?yàn)樵诘透邔挶戎袑⒃谙氯~輪旋轉(zhuǎn)時(shí)發(fā)生表面破壞(breakage)和產(chǎn)生渦旋。由此，高寬比的選擇在很大程度上以在表1中列出的議題的經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)。表1 各種高寬比的效果總結(jié)
權(quán)利要求
1.一種用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器，其特征在于所述生物反應(yīng)器(1)具有至少4000升的體積，以及至少一個(gè)頂部葉輪(68)和至少一個(gè)底部葉輪(78)，其中所述頂部葉輪(68)為水翼式葉輪。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述生物反應(yīng)器(1)具有頂部葉輪(68)和底部葉輪(78)，所述頂部葉輪(68)優(yōu)選為三葉水翼式設(shè)計(jì)的葉輪，所述底部葉輪 (78)優(yōu)選為四斜葉大稠度葉輪。
3.根據(jù)前述任一權(quán)利要求中所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述葉輪(60，70)與罐 (10)的直徑比為0.35以上至0.55以下，優(yōu)選0.40以上至0. 48以下，最優(yōu)選0.44以上至 0. 46以下。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述頂部葉輪的功率數(shù) (Np)為0. 1以上至O·9以下。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述頂部葉輪的流量數(shù) (Nq)為0.4以上至0.9以下。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述底部葉輪的功率數(shù) (Np)為O·5以上至O·9以下。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述底部葉輪的流量數(shù) (Nq)為0. 50以上至0.85以下。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述生物反應(yīng)器(1)具有至少一個(gè)分布器(108)。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述生物反應(yīng)器(1)具有至少一個(gè)擋板(128)。
10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述生物反應(yīng)器(1)具有至少兩個(gè)用于添加堿的(138，148)，所述孔優(yōu)選空間上彼此分離。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的生物反應(yīng)器，其特征在于所述生物反應(yīng)器(1)具有至少10000升的體積，最優(yōu)選至少20000升的體積。
12.—種培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其特征在于在權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器中，在合適的培養(yǎng)條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述至少兩個(gè)葉輪的攪拌速率為55W/ m3以上至85W/m3以下。
14.一種用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于a)具有至少500升、優(yōu)選至少1000升的體積的第一生物反應(yīng)器(111)連接至b)體積大于所述第一生物反應(yīng)器(1)并具有至少2000升、優(yōu)選至少4，000升的體積的第二生物反應(yīng)器(11)，其中所述具有至少2000升、優(yōu)選至少4000升的體積的第二生物反應(yīng)器(11)連接至c)權(quán)利要求1至16任一項(xiàng)所述的第三生物反應(yīng)器(1)，所述第三生物反應(yīng)器(1)具有至少10000升、優(yōu)選至少20000升的體積，其體積大于所述第二生物反應(yīng)器(11)的體積。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于所述第一或第二生物反應(yīng)器(111、11)中的至少一種為權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器。
16.一種培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其特征在于a)在具有至少500升的體積、優(yōu)選至少1000升的體積的第一生物反應(yīng)器中，在合適的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，b)將通過增殖所述至少一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而獲得的含細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至具有至少 2000升的體積、優(yōu)選至少4000升的體積的第二生物反應(yīng)器，c)在具有至少2000升的體積、優(yōu)選至少4000升的體積的所述第二生物反應(yīng)器中培養(yǎng)被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，d)將在步驟c)中獲得的含有細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至第三生物反應(yīng)器，所述第三生物反應(yīng)器具有至少10000升的體積、優(yōu)選至少20000升的體積，和e)在所述具有至少10000升的體積、優(yōu)選至少20000升的體積的所述第三生物反應(yīng)器中培養(yǎng)所述被轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所使用的所述生物反應(yīng)器中至少一種為權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于在步驟a)、c)和e)的所述生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)條件相同。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有至少兩個(gè)葉輪的大規(guī)模生物反應(yīng)器、大規(guī)模生物反應(yīng)器系統(tǒng)和使用這些生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)和增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12M1/06GK102307984SQ201080007208
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月9日
發(fā)明者莫斯汗·肯 申請(qǐng)人:英國龍沙生物醫(yī)藥股份有限公司