專利名稱：人類可溶性cd146、其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在體內(nèi)、離體或體外調(diào)節(jié)血管發(fā)生的組合物和方法。更具體來說，本發(fā)明涉及可用于人類治療情形中的可溶性CD146蛋白以及相應(yīng)的抗體。本文描述的特定形式的CD146，可用于在體內(nèi)或離體帶動(dòng)成熟和未成熟內(nèi)皮細(xì)胞兩者，以及增加它們對(duì)血管發(fā)生的影響。它們還可用于制備組合物，特別是藥物、診斷或美容組合物以及相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明還涉及使用上面提到的化合物、組合物和細(xì)胞的治療或診斷方法以及美容性處理。
背景技術(shù)：
在高等生物體中，在胚胎發(fā)育過程中從分化的內(nèi)皮細(xì)胞形成新血管(血管生成) 或在成年期中從現(xiàn)有血管形成新血管(血管發(fā)生)，是器官發(fā)育、再生和傷口愈合的基本特征。治療性血管發(fā)生是治療患有導(dǎo)致組織局部缺血的疾病或障礙的患者的有效手段。由于發(fā)現(xiàn)了有利于新血管形成的促血管生成因子，使用非手術(shù)療法治療局部缺血已成為可能。到目前為止已經(jīng)描述了幾種候選促血管生成因子，它們成為臨床試驗(yàn)的主題。然而，熱情受到一系列負(fù)面臨床結(jié)果的阻礙。例如，對(duì)于VEGF來說，盡管該因子具有強(qiáng)的血管生成效應(yīng)，但其表達(dá)不能有效增加患者中的肌肉血流。這由滲漏血管腔隙和動(dòng)靜脈短路的形成干擾了下游微循環(huán)來解釋。已經(jīng)在成人外周血、骨髓和臍帶血中鑒定到內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC) (Asahara T， Murohara T, Sullivan A, Silver Μ, van der Zee R, Li Τ, Witzenbichler B, Schatteman G，Isner JM.推測的用于血管發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞的分離(Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.) Science. 1997 275 :964-7)。在從骨髓帶動(dòng)后，循環(huán)系統(tǒng)中的EPC參與新生兒新生血管化。已發(fā)現(xiàn)移植從血液或自體骨髓單核細(xì)胞獲得的培養(yǎng)擴(kuò)增的EPC，能夠在體內(nèi)增加局部缺血誘導(dǎo)的新生血管化。然而，在患者中使用培養(yǎng)細(xì)胞作為治療方法，受到外周血中EPC的低比例、需要收獲大量骨髓以分離足夠數(shù)量的EPC以及回收到的EPC的非均質(zhì)性的相當(dāng)大的限制。盡管其存在缺點(diǎn)，但使用血管生成生長因子至今仍是用于治療患者、例如表現(xiàn)出嚴(yán)重外周動(dòng)脈疾病(也稱為外周血管病)或局部缺血性心臟病的患者的治療性血管發(fā)生的主要策略。⑶146，也稱為MCAM、MUC18或Mel-CAM，是屬于免疫球蛋白超家族的內(nèi)皮連接的組分(Bardin N, Anfosso F, MasseJM, Cramer Ε, Sabatier F, Le Bivic A, Sampol J, Dignat-George F.將⑶146鑒定為參與細(xì)胞-細(xì)胞內(nèi)聚控制的內(nèi)皮連接的組分 (Identification of CD146 as a component of the endothelial junction involved in the control of cell-cell cohesion.)Blood. 2001 ;98 :3677-84)。作為該家族的成員，它由5個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)組成。已知CD146主要以兩種不同形式出現(xiàn)，其差別在于它們的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的長度長同工型(在本文中鑒定為“長⑶146”)和短同工型(在本文中鑒定為“短⑶146”)，二者都存在于細(xì)胞、主要是內(nèi)皮細(xì)胞的膜中。⑶146參與細(xì)胞和組織體系結(jié)構(gòu)的控制，正如通過在內(nèi)皮單層形成過程中其表達(dá)的調(diào)控、其參與細(xì)胞旁通透性的控制(Bardin N, Anfosso F, MasseJM, Cramer Ε, Sabatier F，Le Bivic A, Sampol J, Dignat-George F.將CD146鑒定為參與細(xì)胞-細(xì)胞內(nèi)聚控制白勺 1 ] 白勺(Identification of CD 146 as a component of the endothelial junction involved in the control of cell-cell cohesion.)Blood. 2001 ；98 :3677-84) 及其與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的共定位(Anfosso F, Bardin N, Vivier E，Sabatier F, Sampol J, Dignat-George F.與人類內(nèi)皮細(xì)胞中⑶146結(jié)合相關(guān)的由外至內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 (Outside-in signaling pathway linked to CD146 engagement in human endothelial cells.) J Biol Chem. 2001 ；276 :1564-9)所證實(shí)的。已報(bào)道，膜⑶146在人類黑素瘤中促進(jìn)腫瘤生長、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移。在人類惡性黑素瘤中，膜CD146的表達(dá)水平和分布與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的發(fā)生密切相關(guān)。已描述了抗膜 ⑶146抗體能夠在裸鼠中顯著抑制人類黑素瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移性質(zhì)(Mills L,Tellez C， Huang S, Baker C, McCarty Μ, Green L, Gudas JM, Feng X，Bar-Eli Μ.針對(duì) MCAM/MUC18 的全人類抗體抑制人類黑素瘤的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Fully human antibodies to MCAM/ MUC18 inhibit tumor growth and metastasis of human melanoma.) Cancer Res. 2002 ； 62 =5106-14.)。已經(jīng)顯示，在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)體外模型(Kang Y，Wang F,Feng J, Yang D, Yang X，Yan X. CD146的抑制降低了人類內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖(Knockdown of CD146 reduces the migration and proliferation of human endothelial cells.)Cell Res. 2006 ；16(3) :313-8)和雞絨毛尿囊膜(CAM)測定與小鼠腫瘤生長的體內(nèi)模型(Yan X，Lin Y, Yang D, Shen Y, Yuan Μ, Zhang Ζ, Li P, Xia H, Li L, Luo D, Liu Q, Mann K, Bader BL.新的抗CD146單克隆抗體AA98抑制血管發(fā)生和腫瘤生長(A novel anti_CD146 monoclonal antibody, AA98, inhibits angiogenesis and tumor growth)Blood. 2003 ； 102 :184-91)兩者中，膜⑶146表現(xiàn)出血管生成性質(zhì)。Yan等已經(jīng)顯示，mAb AA98表現(xiàn)出與正常組織的血管相比，抗腫瘤內(nèi)血管系統(tǒng)的明顯受限的免疫反應(yīng)性。最后，本發(fā)明人最近顯示了⑶146參與單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的調(diào)控(⑶146及其可溶性形式調(diào)控單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(CD146 and its soluble form regulate monocytes transendothelial migration)Arteriosclerosis, thrombosis and Vascular Biology, 2009；29 :746-53)。對(duì)于雞⑶146的兩種膜同工型來說，在文獻(xiàn)中已鑒定到不同的定位和功能差異。 在一項(xiàng)研究中，作者使用⑶146-GFP嵌合體分析雞⑶146在極化的上皮Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞中的定向，以鑒定每種同工型的對(duì)應(yīng)功能。他們通過共聚焦顯微術(shù)顯示， 短CD146和長CD146分別定位于頂端和底外側(cè)膜(Guezguez B, Vigneron P，Alais S， Jaffredo T, Gavard J, Mege RM，Dunon D.在 MDCK 細(xì)胞中雙亮氨酸基序?qū)?MCAM-1 細(xì)胞粘附分子革巴向底外側(cè)膜(A dileucine motif targets MCAM-I cell adhesion molecule to the basolateral membrane in MDCK cells)FEBS Lett. 2006 ；580 :3649-56) 在另一項(xiàng)研究中，同一個(gè)研究組顯示了長CD146通過在淋巴細(xì)胞中微絨毛誘導(dǎo)促進(jìn)滾動(dòng)并顯示出粘附受體活性，表明它參與活化的T細(xì)胞向炎性位點(diǎn)的募集(Guezguez B, Vigneron P，Lamerant N, Kieda C, Jaffredo T, Dunon D.黑素瘤細(xì)胞粘附分子(MCAM)/CD146 在淋巴細(xì)胞內(nèi)皮相互作用中的雙重功能:MCAM/CD146通過在淋巴細(xì)胞中微絨毛誘導(dǎo)促進(jìn)滾動(dòng)并且是內(nèi)皮粘附受體(Dual role of melanoma cell adhesion molecule (MCAM) /CD 146 in lymphocyte endothelium interaction :MCAM/CD146 promotes rolling via microvilli induction in lymphocyte and is an endothelial adhesion receptor)J Immunol. 2007 ； 179 :6673-85)?？扇苄问降蘑?46的存在最初是從western印跡發(fā)現(xiàn)的，并提出了其作為⑶146 膜結(jié)合形式的競爭性抑制劑的可能功能(Bardin N, Frances V, Combes V，Sampol J, Dignat-George F.⑶146 可溶形式在人類培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞中的生物合成和生產(chǎn)(⑶146 biosynthesis and production of a soluble form in human culturedendothelial cells.)FEBS Lett. 1998 ；421 :12-4)。然而，到目前為止，可溶形式還沒有在結(jié)構(gòu)或功能上表征。突破來自于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即人類CD146的生物活性形式不僅以膜結(jié)合形式、 而且以可溶形式存在于人類血清中。本發(fā)明人首先提出SCD146水平的變化可能與伴有內(nèi)皮屏障完整性例如通透性的變化、白細(xì)胞移居或血管發(fā)生的生理病理狀況相關(guān)(N. Bardin, F. Anfosso, V. Combes, J. Nedelec, I. Besson—Faure, P. Brunet, V. Moal, J. Sampol, and F. Dignat-George. 一種連接內(nèi)皮粘附分子可溶性CD146，在血管障礙中增加(Soluble CD146, a junctional endothelial adhesion molecule, is increased in vascular disorders)內(nèi)皮細(xì)胞專題討論會(huì) K ;DK，vol. 55，no. SUPPL. 01，2000 年 1 月 1 日，第 63 頁， ISSN :0340-6245)，然后描述了在患有慢性腎衰的患者血漿中sCD146水平的增加(Bardin N, Moal V, Anfosso F, Daniel L, Brunet P, Sampol J, Dignat-George F.—禾中的內(nèi) 1 標(biāo)志物可溶性⑶146，在與內(nèi)皮連接改變相關(guān)的生理病理背景下增加(Soluble⑶146，a novel endothelial marker，is increased in physiopathological settings linked to endothelial junctional alteration)Thromb Haemost· 2003 ;90 :915-20)。本發(fā)明人現(xiàn)在在本文中第一次描述了所述可溶形式的結(jié)構(gòu)，并證實(shí)了(具體參見本文中提供的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)人類可溶性CD146的治療性質(zhì)、特別是其血管生成性質(zhì)，與本技術(shù)領(lǐng)域的建議以及特別是mi Guang-JER等以前的觀察相矛盾(參見mi Guang-JER 等“可溶性METCAM/MUC 18在人類前列腺癌LNCaP細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤形成過程中阻斷血管發(fā)生，，(Soluble METCAM/MUC 18 blocks angiogenesis during the in vivo tumor formation of human prostate cancer LNCaP cells.)美國癌癥研究聯(lián)合會(huì)年會(huì)會(huì)議錄 (Proceedings of the American Association for cancer research annual meetings)， vol. 47，2006 年 4 月，page 59n 以及《AACR 第 97 屆年會(huì)》(97 annual meeting of the AACR) ；Washington DC, USA, 2006 年 4 月 01-05 日，ISSN :0197_016X)。在文獻(xiàn)中，已經(jīng)顯示了不同可溶性受體如可溶性EphB4或可溶性Notchl作為血管發(fā)生的內(nèi)源抑制劑起作用，起到它們的配體的捕集器的作用。對(duì)于阻斷VEGF的血管生成效應(yīng)的可溶形式的VEGFR2來說，情況也是如此(Holash J，Davis S，Papadopoulos N，等， VEGF捕集器具有強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)的VEGF阻斷劑(VEGF-Trap :a VEGF blocker with potent antitumor effects.), Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 ;99 :11393-8.)。相反，已經(jīng)顯示其他可溶性分子起到血管發(fā)生活化劑的作用，例如可溶性N-鈣粘蛋白片段(Derycke L，Morbidelli L, Ziche M等，可溶性N-鈣粘蛋白片段促進(jìn)血管發(fā)生(Soluble N-cadherin fragment promotes angiogenesis.) ,Clin Exp Metastasis. 2006 ;23 :187-201)或可溶性 CD40配體(Melter Μ, Reinders ME, Sho M等，CD40的連接誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)并在體內(nèi)促進(jìn)血管發(fā)生(Ligation of CD40 induces the expression of vascular endothelial growth factor by endothelial cells and monocytes and promotes angiogenesis in vivo.)，Blood. 2000 ;96 :3801-8.)。所觀察到的可溶性分子作為抑制劑或激活劑的相反效應(yīng)的原因未知，但可能是由于不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。因此，人們可以假設(shè)受體分子的可溶形式可能捕集配體并抑制效應(yīng)。相反，其他可溶性分子例如可溶性CD146由膜蛋白脫落產(chǎn)生，并可能用作活化其受體的配體。具體來說，發(fā)明人在本文中提供了新工具，使用可溶形式的CD146改進(jìn)了組織局部缺血的治療，同時(shí)降低了使用經(jīng)典使用的療法時(shí)觀察到的有害副作用。他們在本文中證明了可溶形式的CD146在新生血管化過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能。發(fā)明人在本文中對(duì)人類可溶形式的CD146(在本文中稱為“可溶性CD146”)進(jìn)行了性質(zhì)研究，鑒定了其可用于治療情形中的氨基酸序列。具體來說，發(fā)明人描述了其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、特別是內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的有利的趨化和血管生成效應(yīng)。人類可溶形式的CD146能夠在哺乳動(dòng)物對(duì)象、特別是人類對(duì)象中促進(jìn)治療性血管生成和/或血管發(fā)生。本文描述的產(chǎn)物和組合物的其他優(yōu)點(diǎn)將在下面進(jìn)一步指出。發(fā)明概述發(fā)明人在本文中第一次證明了人類可溶性CD146誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特別是內(nèi)皮祖細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和造血細(xì)胞的遷移能力或移動(dòng)性(趨化活性)和活化，并證明了該分子能夠在體內(nèi)促進(jìn)血管生成和/或血管發(fā)生。該分子可以單獨(dú)或與另一種促血管生成因子和/或與成熟或未成熟內(nèi)皮細(xì)胞組合給藥，是在表現(xiàn)出組織局部缺血或具有發(fā)生這種組織局部缺血的風(fēng)險(xiǎn)的患者中用于治療性血管發(fā)生的有利工具。具體來說，本發(fā)明提供了新的蛋白，即人類可溶性CD146，其在本文中被稱為“可溶性CD146”。該蛋白天然存在于人類血清中，并且其生物活性形式已被本發(fā)明人分離并提供在本文中。一方面，本發(fā)明描述了分離的人類可溶性CD146蛋白，其含有約558個(gè)氨基酸，優(yōu)選約552至約558個(gè)氨基酸，更優(yōu)選557、556、555、554、553或552個(gè)氨基酸。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的可用于哺乳動(dòng)物治療、特別是人類治療情形中的人類可溶性⑶146蛋白，其包含由選自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 的序列構(gòu)成的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的可溶性⑶146蛋白和可藥用載體的組合物。另一方面，該組合物還包含成熟或未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞、特別是內(nèi)皮祖細(xì)胞，和/或另一種促血管生成因子。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含已經(jīng)與人類可溶性⑶146蛋白接觸過的、和/或已經(jīng)進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)人類短的或可溶性CD146蛋白的成熟或未成熟內(nèi)皮細(xì)胞作為唯一生物活性劑。另一方面，本發(fā)明涉及本文描述的蛋白或組合物，其用于引起組織局部缺血，或以⑶146、特別是可溶性⑶146的受體的活化降低，或以選自編碼e-N0S、uPa、MMP-2和KDR 的基因的基因的表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)相比降低為特征的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的治療或診斷，或用于局部缺血的預(yù)防。具體來說，本發(fā)明涉及使用本文描述的蛋白或組合物制備組合物，用于本文指出的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的診斷、預(yù)防或治療。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中診斷、預(yù)防或治療本文指出的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的方法，特別是診斷癌癥(例如乳腺癌、黑素瘤等)的方法或預(yù)防或治療組織局部缺血的方法。診斷癌癥的方法優(yōu)選包含對(duì)哺乳動(dòng)物血清中可溶性CD146蛋白的量進(jìn)行定量的步驟。預(yù)防或治療組織局部缺血的方法優(yōu)選包含向哺乳動(dòng)物給藥有效量的在本文、特別是包含可溶性CD146蛋白的方法中描述的組合物的步驟。另一方面，本發(fā)明涉及使用本文描述的蛋白或組合物改進(jìn)瘢痕的美觀性，或預(yù)防性地促進(jìn)瘢痕形成或創(chuàng)傷、傷口或切口的愈合。本發(fā)明的目的是將本文描述的蛋白或組合物用于哺乳動(dòng)物上皮、特別是人類上皮的瘢痕形成，特別是在創(chuàng)傷、傷口或切口出現(xiàn)后或在皮膚移植的情形中。本發(fā)明的另一個(gè)目的是將本文描述的蛋白或組合物用于在哺乳動(dòng)物特別是人類中預(yù)防或治療焦痂或褥瘡。本發(fā)明的另一個(gè)目的是將本文描述的蛋白或組合物用于哺乳動(dòng)物、特別是人類的皮膚移植的情形中。本文還提供了單克隆抗體，其與包含由選自于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3,SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 禾口 SEQ ID NO :7 的序列構(gòu)成的氨基酸序列的人類可溶性CD146蛋白選擇性結(jié)合。該抗體優(yōu)選也中和本發(fā)明的人類可溶性CD146蛋白的生物活性。優(yōu)選情況下，抗體在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中降低或抑制新生血管化、血管通透性和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。本文公開的抗體或包含所述抗體和可藥用載體的藥物組合物，可以在哺乳動(dòng)物、 優(yōu)選為人類中用于預(yù)防或治療以不希望的過度新生血管化或血管通透性、諸如癌癥，以可溶形式的⑶146和/或⑶146、特別是可溶性⑶146的受體的過表達(dá)或過度活化、或以選自 e-NOS、uPa、MMP-2和KDR的編碼基因的基因與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)相比的過度表達(dá)為特征的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其分別編碼本發(fā)明的人類可溶性⑶146、人類短形式的⑶146或其重組體形式。核酸分子可以可復(fù)制載體的形式提供，所述可復(fù)制載體包含與用載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、特別是成熟或未成熟內(nèi)皮細(xì)胞或祖細(xì)胞、優(yōu)選為內(nèi)皮祖細(xì)胞所識(shí)別的控制序列可操作連接的核酸分子。本發(fā)明還提供了這種包含載體或核酸分子的宿主細(xì)胞。另一方面，本公開提供了包含任一種或多種本文描述的蛋白、抗體、細(xì)胞或組合物的試劑盒。典型情況下，試劑盒還包含按照所公開的方法使用蛋白、抗體、細(xì)胞或組合物的說明書。


圖1 重組人類可溶性⑶146在體內(nèi)和體外的趨化活性。A 在正常小鼠中維持12天的Matrigel膠塞的顯微鏡檢查。將含有1 μ g/μ 1 PBS 或 1 μ g/ μ 1 c-myc 肽的對(duì)照 Matrigel 膠塞和含有 1 μ g/ μ 1 rh_sCD146 (可溶性 DC146) 的Matrigel膠塞注射到同一小鼠中。在rh_sCD146存在下在matrigel膠塞中觀察到毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)(箭頭)。顯示了在對(duì)照或rh-s⑶146 matrigel中用抗⑶31抗體(綠色)和抗⑶117抗體(紅色)進(jìn)行的免疫染色。核用dapi標(biāo)記(藍(lán)色)。B 在通過penian靜脈注射有500，000個(gè)EPDC的裸鼠中維持12天的Matrigel 膠塞的免疫染色。將含有l(wèi)yg/μ C-myc肽的對(duì)照Matrigel膠塞和含有1 μ g/μ 1 rh-sCD146的Matrigel膠塞注射到同一小鼠中。matrigel膠塞中的免疫染色使用抗人類 ⑶31抗體(紅色)來進(jìn)行。細(xì)胞核用dapi標(biāo)記(藍(lán)色)。C :rh-sCD146在體外對(duì)EPC的趨化效應(yīng)。將EBM2培養(yǎng)基中的200，000個(gè)EPC接種到8 μ m孔徑Transwell濾器的上層區(qū)室中。將下列試劑以不同濃度添加到Transwell濾器的下層區(qū)室中的培養(yǎng)基中rh-sCD146、c-myc肽、免疫貧化的rh_sCD146(Ip rh_sCD146)、 其對(duì)照(IpC)或VEGF。將Transwell濾器在37°C下溫育過夜。將細(xì)胞用熒光染料標(biāo)記并測量熒光強(qiáng)度。結(jié)果是4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。*，**，#* 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P <0. 05， P < 0. 01，P < 0. 001。D 使用抗CD45抗體、抗CD34抗體、抗α sma抗體、抗Μ0ΜΑ2抗體、抗CD31抗體和抗 ⑶117抗體，在填充有rh-s⑶146并在正常小鼠中維持了 12天的matrigel膠塞的切片上進(jìn)行了免疫染色。核用DAPI標(biāo)記(藍(lán)色)。還使用⑶31/⑶146、⑶117/⑶31、⑶117/⑶146、 ⑶117/⑶33和⑶117/⑶45進(jìn)行了共標(biāo)記。給出了合并照片。黃色區(qū)域?qū)?yīng)于共標(biāo)記。在一些照片中，這些區(qū)域用箭頭更好地標(biāo)出。圖2 重組人類可溶性⑶146在體外對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞衍生細(xì)胞的促血管生成能力的影響。A 評(píng)估了在存在或不存在不同濃度的rh-s⑶146、Fc-⑶146或?qū)φ誌gGl、c-myc 肽、免疫貧化的rh-sCD146 (Ip rh_sCD146)或其對(duì)照(IpC)或VEGF的情況下，EPC在 Matrigel膠塞中制作假毛細(xì)血管的能力。在溫育5小時(shí)后對(duì)管的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果是6 個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM0 *，** 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P < 0. 05，P < 0. 01。B:使用在㈧中描述的實(shí)驗(yàn)條件評(píng)估了 EPC的增殖能力。結(jié)果是5個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。**，*** 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P < 0. 01，P < 0. 001。C 使用在㈧中描述的實(shí)驗(yàn)條件評(píng)估了 EPC的遷移能力。結(jié)果是4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM0 *，*** 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P < 0. 05，P < 0. 001。圖3 在內(nèi)皮祖細(xì)胞衍生細(xì)胞中血管生成基因轉(zhuǎn)錄本和產(chǎn)物對(duì)重組人類可溶性 ⑶146做出響應(yīng)而上調(diào)A 在用或未用50ng/ml rh_s⑶146處理3小時(shí)的EPC中，使用對(duì)血管生成途經(jīng)特異的寡核苷酸陣列監(jiān)測基因表達(dá)情況的改變。基因表達(dá)改變通過qPCR驗(yàn)證。結(jié)果是4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值。*，# 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P < 0. 05，P < 0. 01。B 進(jìn)行了 Western 印跡分析以證實(shí) MMP-2、e_N0S、uPA、KDR(也稱為 VEGFR2)的蛋白上調(diào)，并建立誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。對(duì)每種蛋白顯示了代表性實(shí)驗(yàn)。
C:在B中描述的3-5個(gè)實(shí)驗(yàn)的定量。*，**，*# 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P < 0.05，P
<0. 01，P < 0. 001。圖4 在大鼠局部缺血后肢模型中局部注射重組人類可溶性⑶146的效應(yīng)A 對(duì)大鼠進(jìn)行手術(shù)以在后肢中誘導(dǎo)局部缺血。在隨后的天中，對(duì)大鼠進(jìn)行含有 10 μ g/ml c-myc肽或10 μ g/ml rh_s⑶146的溶液的每日局部注射，注射5或12天。在手術(shù)后每5天對(duì)動(dòng)物的自斷離水平和血液灌注速率(激光多普勒分析)進(jìn)行分析，共進(jìn)行20 天。結(jié)果是每組中的9只不同動(dòng)物的平均值。*:實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比P <0.05。B 在手術(shù)后12天，在來自于對(duì)照未處理的、c-myc肽處理的或rh_s⑶146處理的大鼠的后肢肌肉切片上進(jìn)行組織化學(xué)檢查。C 在對(duì)照動(dòng)物、c-myc處理或rh_s⑶146處理的大鼠(12天)中，通過組織化學(xué)檢查觀察到的對(duì)炎癥和纖維變性水平、壞死纖維的量、血管發(fā)生和肌肉情況的影響的估算。給出了半定量，定義為_(不存在)，+/_(低表達(dá))，+(中等表達(dá))，++(高表達(dá))。D:使用抗CD117抗體(綠色)和抗CD146抗體(紅色)，在用或未用(對(duì)照) rh-s⑶146處理兩天的局部缺血大鼠的肌肉切片中進(jìn)行了共免疫染色。核用DAPI標(biāo)記(藍(lán)色)。給出了合并照片。黃色區(qū)域?qū)?yīng)于共標(biāo)記(用箭頭標(biāo)出)。圖5 :rh_s⑶146和VEGF在體外對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管生成能力的累加效應(yīng)A 評(píng)估了當(dāng) rh-sCD146(50ng/ml)和 VEGFQOng/ml) —起添加時(shí)晚期 EPC 的增殖能力，并與每種生長因子單獨(dú)添加時(shí)的效應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果是4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值 +/-SEM。B 使用傷口愈合測定法評(píng)估了當(dāng)rh-sCD146(50ng/ml)和VEGFQOng/ml) —起添加時(shí)晚期EPC的遷移能力，并與每種生長因子單獨(dú)添加時(shí)的效應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果是4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。C 在不同條件下評(píng)估了 EPC在matrigel膠塞中制造假毛細(xì)血管的能力。評(píng)估了當(dāng) rh-sCD146(50ng/ml)和VEGFQOng/ml) —起添加時(shí)毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量，并與每種生長因子單獨(dú)添加時(shí)的效應(yīng)進(jìn)行比較。此外，在對(duì)照條件(Ab)、存在rh-s⑶146 (Ab+rh-s⑶146)、 存在VEGF (Ab+VEGF)和存在兩種生長因子(Ab+rh_sCD146+VEGF)的情況下，測試了在添加生長因子前預(yù)溫育抗VEGFR2抗體(Ab)的影響。在最后一種條件(清洗過的 Ab+rh-s⑶146+VEGF)下，將抗體預(yù)溫育，然后清洗，再添加兩種生長因子。在溫育5小時(shí)后，對(duì)管的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果是6個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值+/-SEM。**:p<0.01，***:P
<0. 001，實(shí)驗(yàn)與對(duì)照相比。圖6 抗SCD146抗體的表征。在與G蛋白珠偶聯(lián)的s⑶146和Huvec上，通過流式細(xì)胞術(shù)分析分別測試了抗體與可溶性⑶146結(jié)合(A)但不與膜⑶146結(jié)合(B)的能力。顯示了在s⑶146上但不在膜 ⑶146上表現(xiàn)出結(jié)合的6種不同抗體。*** :p < 0. 001 ；$，$$ :p < 0. 01，ρ < 0. 001，Ab+sCD146 與 sCD146 相比。圖7 抗s⑶146抗體對(duì)s⑶146誘導(dǎo)的EPC增殖的增加的阻斷效應(yīng)。對(duì)于能夠結(jié)合可溶性⑶146但是不結(jié)合膜⑶146的抗體，測試了它們抑制s⑶146 對(duì)EPC增殖的效應(yīng)的能力。在這些抗體中，6種抗體顯著阻斷了 s⑶146誘導(dǎo)的EPC增殖。 *** :p < 0. 001 ；$，$$ :p < 0. 01，ρ < 0. 001，Ab+sCD146 與 sCD146 相比。
圖8 重組人類可溶性⑶146對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力的影響測試了不同濃度的可溶性CD146對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力的影響。結(jié)果是4個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值 +/-SEM。* :P < 0. 05，實(shí)驗(yàn)與對(duì)照(C)相比。發(fā)明詳述在下述本發(fā)明的描述中，將使用下列術(shù)語，它們打算如下指出的進(jìn)行定義?！叭祟愰L⑶146蛋白”或“長⑶146”是指主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞的膜中，并具有對(duì)應(yīng)于下列SEQ ID NO 8的氨基酸序列的人類蛋白、肽或氨基酸分子MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEITLPPSRKTEL WEVKSDKLPEEMGLLQGSSGDKRAP⑶QGEKYIDLRH“人類短⑶146蛋白”或“短⑶146”是指主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞的膜中，并具有對(duì)應(yīng)于下列SEQ ID NO 9的氨基酸序列的人類蛋白、肽或氨基酸分子MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESRGVVIVAVIVCILVLAVLGAVLYFLYKKGKLPCRRSGKQEMERNTSI“人類可溶性⑶146蛋白”或“可溶性⑶146”是指含有約552至約558個(gè)氨基酸、 優(yōu)選558個(gè)氨基酸、更優(yōu)選557、556、555、554、553或552個(gè)氨基酸的人類蛋白、肽或氨基酸分子。本發(fā)明的人類可溶性⑶146蛋白的實(shí)例包含氨基酸序列SEQ ID NO 8的至少1至 522位(含522位)殘基，優(yōu)選至少1至557位(含557位)殘基。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含由SEQ ID NO :1構(gòu)成的氨基酸序列的蛋白MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKE匪VLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKL，其對(duì)應(yīng)于本文中所述的可用于哺乳動(dòng)物治療、特別是人類治療情形中的優(yōu)選的人類可溶性CD146蛋白。另一種可用在哺乳動(dòng)物治療情形中的人類可溶性CD146蛋白具有由下列已鑒定的序列之一構(gòu)成的氨基酸序列SEQ ID NO 2 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPSEQ ID NO 3 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPESEQ ID NO 4 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKE匪VLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPSEQ ID NO 5 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKE匪VLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESEQ ID NO 6 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESSEQ ID NO 7 MGLPRLVCAFLLAACCCCPRVAGVPGEAEQPAPELVEVEVGSTALLKCGLSQSQGNLSHVDWFSVHKEK RTLIFRVRQGQGQSEPGEYEQRLSLQDRGATLALTQVTPQDERIFLCQGKRPRSQEYRIQLRVYKAPEEPNIQVNPL GIPVNSKEPEEVATCVGRNGYPIPQVIWYKNGRPLKEEKNRVHIQSSQTVESSGLYTLQSILKAQLVKEDKDAQFYC ELNYRLPSGNHMKESREVTVPVFYPTEKVWLEVEPVGMLKE⑶RVEIRCLADGNPPPHFSISKQNPSTREAEEETTN DNGVLVLEPARKEHSGRYECQAWNLDTMISLLSEPQELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQW LREETDQVLERGPVLQLHDLKREAGGGYRCVASVPSIPGLNRTQLVKLAIFGPPWMAFKERKVWVKENMVLNLSCEA SGHPRPTISWNVNGTASEQDQDPQRVLSTLNVLVTPELLETGVECTASNDLGKNTSILFLELVNLTTLTPDSNTTTG LSTSTASPHTRANSTSTERKLPEPESR在上述序列中，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 6是特別優(yōu)選的?？扇苄訡D146存在于人類血清中并從其中提取或人工再生。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 可溶性⑶146含有由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6構(gòu)成的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，本文公開的人類可溶性CD146是生物活性人類可溶性CD146，即它在體外、離體或體內(nèi)引發(fā)、促進(jìn)、增加或刺激血管生成和/或血管發(fā)生。優(yōu)選情況下，可溶性CD146顯示出趨化活性，即可溶性CD146能夠誘導(dǎo)內(nèi)源或外源細(xì)胞向其中將發(fā)生血管生成和/或血管發(fā)生的位點(diǎn)的調(diào)動(dòng)或遷移，所述細(xì)胞優(yōu)選為內(nèi)皮來源的細(xì)胞(KDR+和/或CD31+細(xì)胞)，優(yōu)選選自未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(特別是CD117+細(xì)胞)、成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(特別是KDR+細(xì)胞)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC) 例如干細(xì)胞(典型為骨髓衍生的干細(xì)胞)及其混合物，和/或允許或有利于這種細(xì)胞組織成血管樣結(jié)構(gòu)。生物活性人類可溶性CD146也能活化前面定義的內(nèi)皮細(xì)胞，即增加它們增殖的能力和/或促進(jìn)假毛細(xì)血管發(fā)生。本文公開的人類可溶性CD146還優(yōu)選能夠在優(yōu)選選自上面指出的細(xì)胞上，與 ⑶146的短同工型(“短⑶146”)、⑶146受體特別是可溶性⑶146受體、和/或與包含這種⑶146的短同工型和可溶性⑶146受體的復(fù)合物相互作用。正如前面解釋的，本發(fā)明的典型的人類可溶性CD146蛋白是可用于治療情形中 (治療性或預(yù)防性蛋白)或診斷情形中，并與向人類給藥、特別是通過注射到血流中和/或通過皮下和/或肌肉內(nèi)給藥相容的蛋白。術(shù)語“治療”是指治療性和預(yù)防性或防止性治療或措施兩者，其能夠減輕或治愈疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)。這樣的治療打算用于需要它的哺乳動(dòng)物對(duì)象，優(yōu)選為人類對(duì)象。 就此而言，考慮到的是患有導(dǎo)致組織局部缺血的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的對(duì)象，或被認(rèn)為處于發(fā)生這種疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的“風(fēng)險(xiǎn)”之中，因此必須進(jìn)行預(yù)防的對(duì)象。導(dǎo)致組織局部缺血的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)是導(dǎo)致異常血管生成和/或血管發(fā)生的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)，特別是導(dǎo)致不想要的過度新生血管化、血管通透性(內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接的改變)和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)。這種疾病的實(shí)例包括癌癥、糖尿病、衰老相關(guān)的黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、任何已知的血管疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化血管病、心血管病例如冠狀動(dòng)脈病、局部缺血性心臟病和中風(fēng)、 腦血管局部缺血、外周血管病例如外周動(dòng)脈閉塞性疾病。在這些導(dǎo)致不想要的新生血管化的病癥中，新的血管補(bǔ)給患病組織，破壞正常組織，并且在癌癥的情況下，新血管允許腫瘤細(xì)胞逃逸到循環(huán)中并駐留在其他器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。障礙可能是如上所述的疾病或創(chuàng)傷的結(jié)果。典型的障礙是例如炎癥、浮腫、纖維變性或壞死。機(jī)能障礙狀態(tài)的實(shí)例的特征在于至少一種特定形式的CD146或CD146受體、特別是可溶性CD146受體的缺乏，或正好相反，即它們與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)相比的過度表達(dá)。機(jī)能障礙狀態(tài)的其他實(shí)例以選自e-N0S、uPa、MMP-2和KDR的編碼基因的基因與正常表達(dá)相比的表達(dá)降低或過量為特征。有利情況下，以表達(dá)的缺乏為特征的機(jī)能障礙狀態(tài)通過本發(fā)明的人類可溶性 ⑶146或包含這種可溶性⑶146的治療性組合物或細(xì)胞來治療(如下所述)。有利情況下，以過量表達(dá)為特征的機(jī)能障礙狀態(tài)例如癌癥，通過本文所述的針對(duì)人類可溶性CD146的抗體或針對(duì)這種人類可溶性CD146的任何其他拮抗劑來治療。在具體實(shí)施方案中，機(jī)能障礙狀態(tài)例如癌癥可以通過將針對(duì)人類可溶性CD146的抗體與針對(duì)促血管生成因子例如VEGF的抗體合在一起來治療。因此，本說明書鑒定了分離的人類可溶性⑶146蛋白，其包含約552至558個(gè)氨基酸、優(yōu)選552至557個(gè)氨基酸、更優(yōu)選552或557個(gè)氨基酸?！胺蛛x的”是指從其在人類對(duì)象中的天然來源或環(huán)境的組分中，特別是從所述對(duì)象的骨髓或血液中鑒定并分離或回收。優(yōu)選的人類可溶性⑶146蛋白包含由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :6構(gòu)成的氨基酸序列，并對(duì)應(yīng)于可用于本文所述的哺乳動(dòng)物治療、特別是人類治療情形中的蛋白。本發(fā)明還提供了分別編碼本文描述的發(fā)明的蛋白的核酸分子。這樣的核酸分子是RNA或DNA，其優(yōu)選各自編碼生物活性人類⑶146、特別是本發(fā)明的人類可溶性⑶146、人類⑶146的短形式及其重組體形式。核酸序列的實(shí)例提供如下SEQ ID NO :17(短 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTACCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGAGCCGGGGCGTGGTCATC GTGGCTGTGATTGTGTGCATCCTGGTCCTGGCGGTGCTGGGCGCTGTCCTCTATTTCCTCTATAAGAAGGGCAAGCT GCCGTGCAGGAGCTCAGGGAAGCAGGAGATGGAGAGAAATACATCGATCTGASEQ ID NO :10(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAATGTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGSEQ ID NO :11(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGSEQ ID NO :12(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGGTGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGSEQ ID NO 13 (可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGSEQ ID NO 14(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTACCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTG CCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGSEQ ID NO 15 (可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCCCTGTGAACA GTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAGTCATCTGGTACAAGAAT GGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAGTCGAGTGGTTTGTACAC CTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTGTGAGCTCAACTACCGGC TGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGACAGAAAAAGTGTGGCTG GAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCTGATGGCAACCCTCCACC ACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAACGACAACGGGGTCCTGG TGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGGACACCATGATATCGCTG CTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCAGCCCCTGAGAGACAGGA AGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTGGCTGAGAGAAGAGACAG GCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAGGCGGCTATCGCTGCGTG GCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTTGGCCCCCCTTGGATGGC ATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGCGTCAGGGCACCCCCGGC CCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAGTCCTGAGCACCCTGAAT GTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTGGGCAAAAACACCAGCAT CCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGGCCTCAGCACTTCCACTGCCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGAGCSEQ ID NO 16(可溶性 CD146)ATGGGGCTTCCCAGGCTGGTCTGCGCCTTCTTGCTCGCCGCCTGCTGCTGCTGTCCTCGCGTCGCGGGT GTGCCCGGAGAGGCTGAGCAGCCTGCGCCTGAGCTGGTGGAGGTGGAAGTGGGCAGCACAGCCCTTCTGAAGTGCGG CCTCTCCCAGTCCCAAGGCAACCTCAGCCATGTCGACTGGTTTTCTGTCCACAAGGAGAAGCGGACGCTCATCTTCC GTGTGCGCCAGGGCCAGGGCCAGAGCGAACCTGGGGAGTACGAGCAGCGGCTCAGCCTCCAGGACAGAGGGGCTACT CTGGCCCTGACTCAAGTCACCCCCCAAGACGAGCGCATCTTCTTGTGCCAGGGCAAGCGCCCTCGGTCCCAGGAGTA CCGCATCCAGCTCCGCGTCTACAAAGCTCCGGAGGAGCCAAACATCCAGGTCAACCCCCTGGGCATCC CTGTGAACAGTAAGGAGCCTGAGGAGGTCGCTACCTGTGTAGGGAGGAACGGGTACCCCATTCCTCAAG TCATCTGGTACAAGAATGGCCGGCCTCTGAAGGAGGAGAAGAACCGGGTCCACATTCAGTCGTCCCAGACTGTGGAG TCGAGTGGTTTGTACACCTTGCAGAGTATTCTGAAGGCACAGCTGGTTAAAGAAGACAAAGATGCCCAGTTTTACTG TGAGCTCAACTACCGGCTGCCCAGTGGGAACCACATGAAGGAGTCCAGGGAAGTCACCGTCCCTGTTTTCTACCCGA CAGAAAAAGTGTGGCTGGAAGTGGAGCCCGTGGGAATGCTGAAGGAAGGGGACCGCGTGGAAATCAGGTGTTTGGCT GATGGCAACCCTCCACCACACTTCAGCATCAGCAAGCAGAACCCCAGCACCAGGGAGGCAGAGGAAGAGACAACCAA CGACAACGGGGTCCTGGTGCTGGAGCCTGCCCGGAAGGAACACAGTGGGCGCTATGAATGTCAGGGCCTGGACTTGG ACACCATGATATCGCTGCTGAGTGAACCACAGGAACTACTGGTGAACTATGTGTCTGACGTCCGAGTGAGTCCCGCA GCCCCTGAGAGACAGGAAGGCAGCAGCCTCACCCTGACCTGTGAGGCAGAGAGTAGCCAGGACCTCGAGTTCCAGTG GCTGAGAGAAGAGACAGGCCAGGTGCTGGAAAGGGGGCCTGTGCTTCAGTTGCATGACCTGAAACGGGAGGCAGGAG GCGGCTATCGCTGCGTGGCGTCTGTGCCCAGCATACCCGGCCTGAACCGCACACAGCTGGTCAACGTGGCCATTTTT GGCCCCCCTTGGATGGCATTCAAGGAGAGGAAGGTGTGGGTGAAAGAGAATATGGTGTTGAATCTGTCTTGTGAAGC GTCAGGGCACCCCCGGCCCACCATCTCCTGGAACGTCAACGGCACGGCAAGTGAACAAGACCAAGATCCACAGCGAG TCCTGAGCACCCTGAATGTCCTCGTGACCCCGGAGCTGTTGGAGACAGGTGTTGAATGCACGGCCTCCAACGACCTG GGCAAAAACACCAGCATCCTCTTCCTGGAGCTGGTCAATTTAACCACCCTCACACCAGACTCCAACACAACCACTGG CCTCAGCACTTCCACTGCCAGTCCTCATACCAGAGCCAACAGCACCTCCACAGAGAGAAAGCTGCCGGAGCCGGAGA GCCGG天然(非重組)分子可以從例如核酸文庫分離，所述核酸文庫從已知表達(dá)目標(biāo)蛋白的組織、例如血液特別是血清或骨髓制備，將文庫用適合的探針篩選，或者可以從組織樣品(骨髓、血液、血清等)、優(yōu)選為待治療對(duì)象的樣品分離(參見例如Hoskins RA, Stapleton M, George RA, Yu C, Wan KH, Carlson Jff, Celniker SE.通過反向 PCR 產(chǎn)物的自連(SLIP)進(jìn)行快速有效的 cDNA 篩選(Rapid and efficient cDNA library screening by self-ligation of inverse PCR products(SLIP))Nucleic Acids Research 2005 ；33 185-197)。此外，核酸分子可以人工產(chǎn)生，例如通過寡核苷酸合成(參見例如Michaels ML, Hsiao HM,Miller JH.使用PCR擴(kuò)展寡核苷酸合成的限度(Using PCR to extend the limit of oligonucleotide synthesis. )Biotechniques. 1992 ； 12 :44-48)。本發(fā)明的優(yōu)選人類可溶性CD146蛋白可以使用包含下列步驟的方法來獲得用表達(dá)人類可溶性CD146蛋白的適合載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并分離表達(dá)的人類CD146蛋白。本文描述了與另一個(gè)多肽例如標(biāo)簽多肽序列融合的重組人類可溶性 ⑶146(rh-s⑶146)蛋白(參見實(shí)驗(yàn)部分中帶有c-myc標(biāo)簽的人類可溶性⑶146，其中可溶性 CD146 的序列是 SEQ ID NO 7)。核酸分子可以提供在可復(fù)制載體中，所述可復(fù)制載體包含與用載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、特別是成熟或未成熟內(nèi)皮細(xì)胞或祖細(xì)胞、優(yōu)選為內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC，在本文中也稱為EPDC)、典型為前文中描述的細(xì)胞所識(shí)別的控制序列可操作連接的核酸分子。本發(fā)明還提供了這種包含載體或核酸分子的宿主細(xì)胞，正如下文中進(jìn)一步解釋的。本發(fā)明的氨基酸分子可以被設(shè)計(jì)成與在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中的診斷、治療或預(yù)防應(yīng)用相容。它們可以被例如糖基化、甲基化、乙?；⒘姿峄?，用于靶向不同類型的組織，特別是病理組織例如典型為局部缺血組織，優(yōu)選在人類中。適合用于表達(dá)糖基化可溶性人類⑶146的宿主細(xì)胞可以選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可用于促進(jìn)血管細(xì)胞生長、典型為內(nèi)皮細(xì)胞生長的組合物，特別是藥物組合物，其在可藥用載體或賦形劑中優(yōu)選以治療有效量包含本文所述的可溶性CD146蛋白?？扇苄訡D146蛋白的“治療有效量”是允許對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行前文所定義的治療的量?？捎糜诒景l(fā)明情形中的可藥用賦形劑、介質(zhì)或載體，是例如鹽水、等滲緩沖溶液例如20%甘露糖醇，任選與穩(wěn)定劑例如同基因的白蛋白或任何其他穩(wěn)定化蛋白、甘油等組合， 并且也與佐劑例如聚凝胺或DEAE葡聚糖等組合。在特定情況下，本文描述的包含可溶性⑶46、優(yōu)選為人類可溶性⑶146的組合，還可以包含至少一種其他血管生成因子。在本發(fā)明的上下文中，血管生成因子是有利于血管發(fā)育的因子?？捎糜诒景l(fā)明的情形中的血管生成因子可以選自血管生成素、血管新生蛋白因子-l、Del-l、成纖維細(xì)胞生長因子酸性(aFGF)和堿性(bFGF)、卵泡抑素、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)/擴(kuò)散因子(SF)、白介素-8(IL-8)、瘦素、midkine、胎盤生長因子、血小板衍生的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生的生長因子-BB(PDGF-BB)、多效生長因子(PTN)、 促紅細(xì)胞生成素(EPO)、內(nèi)皮一氧化氮合酶(e-NOS)、顆粒蛋白前體、增殖蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β )、腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管通透性因子(VPF)、促血管新生蛋白因子-I(Angl)、血纖維溶酶原激活劑尿激酶(PLAU/u-Pa)、基質(zhì)金屬肽酶MMP-2、VEGF受體2 (KDR)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子_1 (SDF-I) 等，及其混合物。優(yōu)選的促血管生成因子可以選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-參見實(shí)驗(yàn)部分和圖5)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 (SDF-I)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、促紅細(xì)胞生成素 (EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-8(IL-8)及其混合物。在另一種特定情況下，本文描述的包含針對(duì)可溶性⑶146的抗體的組合物，還可以包含針對(duì)上面指出的血管生成因子之一的至少一種其他抗體。在另一種特定情況下，本文描述的包含人類可溶性⑶146的組合物還可以另外包含成熟或未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞或祖細(xì)胞，典型為人類來源的，優(yōu)選為體外擴(kuò)增的祖細(xì)胞，特別是干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞，典型為源自血液或骨髓的細(xì)胞，例如選自于表達(dá)CD34、CD133、 CD31、VE-鈣粘蛋白、VEGFR2、c-Kit、CD45 和 / 或 Tie_2 的細(xì)胞。正如下面進(jìn)一步解釋的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是將包含前面提到的細(xì)胞的組合物與本文定義的可溶性CD146相接觸，然后任選摻入到可藥用賦形劑中。這樣的組合物不包含添加的可溶性⑶146。在優(yōu)選實(shí)施方案中，祖細(xì)胞是重組祖細(xì)胞。這樣的重組細(xì)胞可以使用適合的載體進(jìn)行遺傳修飾，所述載體包含表達(dá)、優(yōu)選能夠過表達(dá)特定生物活性形式的CD146、優(yōu)選為如上所定義的人類短形式的CD146或人類可溶形式的CD146的遺傳或核酸構(gòu)建物，或由這些構(gòu)建物構(gòu)成。有許多可用載體。優(yōu)選的載體可以選自質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒。載體組分一般包括但不限于下列一種或多種信號(hào)序列，復(fù)制原點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇(參見例如Liu Jff, Pernod G, Dunoyer-Geindre S, Fish RJ, Yang H, Bounameaux H, Kruithof ΕΚ.慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的人類血液來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子依賴性(Promoter dependence of transgene expression by lentivirus-transduced human blood-derived endothelial progenitor cells.) Stem Cells. 2006 ；24 :199-208)。這樣的祖細(xì)胞可以按照已知流程、優(yōu)選為適合于內(nèi)皮祖細(xì)胞的流程例如電穿孔或使用脂質(zhì)體，用適合的載體、優(yōu)選用上面描述的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后在任何已知的適合培養(yǎng)基(例如包含EGM-2的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基任選增補(bǔ)有下列一種或多種物質(zhì)適合的激素、生長因子、緩沖液等。然后可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)將祖細(xì)胞在體外擴(kuò)增(參見例如Delorme B等，在人類CD146+血液細(xì)胞中存在與成熟的內(nèi)皮細(xì)胞不同的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Presence of endothelial progenitor cells, distinct from mature endothelial cells, within human CD146+blood cells)Thromb Haemost. 2005 ； 94 :1270-9)。本發(fā)明還涉及了使用本發(fā)明的人類可溶性CD146蛋白離體制備如上所定義的表現(xiàn)出治療或預(yù)防性質(zhì)、特別是能夠在人體中刺激血管發(fā)生的成熟或未成熟內(nèi)皮細(xì)胞或祖細(xì)胞。事實(shí)上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這樣的細(xì)胞一旦給藥到對(duì)象，能夠靠其自身與本發(fā)明的人類可溶性⑶146蛋白接觸、“預(yù)處理”或“引發(fā)”，以誘導(dǎo)或刺激血管生成和/或血管發(fā)生?！邦A(yù)處理過”或“引發(fā)過”的細(xì)胞在任選摻入到可藥用載體中以前，已經(jīng)與本發(fā)明的人類可溶性 CD146蛋白接觸或在其存在下進(jìn)行培養(yǎng)。這樣的細(xì)胞以及優(yōu)選在可藥用載體中包含所述細(xì)胞的藥物組合物，是本發(fā)明的另一個(gè)目的。在制備這樣的藥物組合物時(shí)，任選進(jìn)一步添加人類可溶性⑶146。優(yōu)選的“預(yù)處理過”或“引發(fā)過”的細(xì)胞，是已經(jīng)過如前所解釋的遺傳修飾，以過表達(dá)短形式⑶146或可溶性⑶146的細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及本文所述的蛋白或組合物，其用于導(dǎo)致組織局部缺血，或以 ⑶146、特別是可溶性⑶146的受體的活化降低、或以選自e-N0S、uPa、MMP-2和KDR的編碼基因的基因的表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)值相比降低為特征的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的治療。本發(fā)明涉及本文所述的蛋白或組合物，其用于預(yù)防局部缺血。具體來說，本發(fā)明涉及使用本文所述的蛋白或組合物制備組合物，用于預(yù)防或治療前文中所指出的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中預(yù)防或治療本文所指出的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)的方法，特別是預(yù)防或治療組織局部缺血的方法， 包含向哺乳動(dòng)物給藥有效量的本文所述的包含可溶性CD146蛋白的組合物。另一方面，本發(fā)明涉及使用本文描述的蛋白或組合物改進(jìn)瘢痕的美觀性，或預(yù)防性地促進(jìn)瘢痕形成或創(chuàng)傷、傷口或切口的愈合。本發(fā)明的目的是將本文描述的蛋白或組合物用于哺乳動(dòng)物上皮、特別是人類上皮的瘢痕形成，特別是在創(chuàng)傷、傷口或切口出現(xiàn)后或在皮膚移植的情形中。本發(fā)明的另一個(gè)目的是將本文描述的蛋白或組合物用于在哺乳動(dòng)物特別是人類中預(yù)防或治療焦痂或褥瘡。有利情況下，用于瘢痕形成情形中的優(yōu)選組合物將按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法配制成用于表面施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了單克隆抗體，其與本發(fā)明的人類可溶性 CD146蛋白、優(yōu)選與包含由SEQ ID NO :1或SEQ NO :6構(gòu)成的氨基酸序列的蛋白選擇性結(jié)合。該抗體優(yōu)選也中和本發(fā)明的人類可溶性CD146蛋白的生物活性。優(yōu)選情況下，單克隆抗體在本文所定義的對(duì)象、典型為哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中降低或抑制新生血管化、血管通透性和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。單克隆抗體優(yōu)選也能降低或抑制可溶性CD146受體的過量表達(dá)(與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)相比)或選自e-N0S、uPa、MMP-2和KDR的編碼基因的基因的過量表達(dá)(與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)相比)。與人類可溶性⑶146蛋白和⑶146或可溶性⑶146蛋白受體(或⑶146蛋白受體亞基)兩者結(jié)合的抗體，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。制造這些抗體的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是己知的(參見例如 Despoix N, Walzer T, Jouve N, Blot-Chabaud M, Bardin N, Paul P, Lyonnet L, Vivier Ε, Dignat-George F, Vely F.小鼠 CD146/MCAM 是自然殺傷細(xì)胞成熟白勺t示志· (Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation)Eur J Immunol. 2008；38 :2855-64)。在本發(fā)明的情形中，由本發(fā)明人選擇的能夠選擇性結(jié)合可溶性CD146(與膜CD146 相比)的優(yōu)選抗體,在圖 7 上標(biāo)出(2B9-4、2B9-5、26D12-6、26D12-7、26D12-8 和 15E8-1)。本文描述的抗體可以相應(yīng)的適合劑量摻入到還包含可藥用載體的組合物中。在特定情況下，本文描述的包含本文所述的抗體、特別是特異性針對(duì)本文所述的優(yōu)選由SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 6構(gòu)成的人類可溶性⑶146的抗體的組合物，還可以包含至少一種其他抗血管生成因子。在本發(fā)明的情形中，抗血管生成因子是抑制或干擾血管發(fā)生的因子?？捎糜诒景l(fā)明情形中的抗血管生成因子可以選自針對(duì)如上定義的血管生成因子的抗體、angioarrestin、血管生成抑制素(血纖維溶酶原片段)、抗血管生成抗凝血酶III、 軟骨衍生的抑制劑(CDI)、CD59補(bǔ)體片段、內(nèi)皮抑素(膠原蛋白XVIII片段)、纖連蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素六糖片段、人類絨毛膜促性腺激素(hCG)、干擾素α/β/γ、干擾素誘導(dǎo)的蛋白(IP-IO)、白介素-12，kringle 5 (血纖維溶酶原片段)、金屬蛋白酶抑制劑 (TIMP)、2_甲氧基雌二醇、胎盤核糖核酸酶抑制劑、血纖維溶酶原激活物抑制劑、血小板因子_4(PF4)、催乳素16kD片段、增殖蛋白相關(guān)蛋白(PRP)、類視色素、四氫皮質(zhì)醇-S、血小板反應(yīng)蛋白-I(TSP-I)、轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-b)、血管抑制素、血管抑制因子(鈣網(wǎng)蛋白片段)等，及其混合物。本文公開的抗體或包含至少所述抗體和可藥用載體的藥物組合物，可以使用在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中，用于預(yù)防或治療以不想要的過度新生血管化或血管通透性為特征的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)，例如癌癥特別是乳腺癌或黑素瘤，或以CD146、特別是可溶性 ⑶146的受體的過表達(dá)或過度活化、或以選自e-NOS、uPa、MMP-2和KDR的編碼基因的基因與標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)相比的過量表達(dá)為特征的疾病、障礙或機(jī)能障礙狀態(tài)。診斷或藥物組合物的劑量，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待治療對(duì)象、給藥途徑、靶向組織、生物活性化合物(如本文所公開的)等進(jìn)行調(diào)整。可以使用各種不同方案進(jìn)行給藥，例如同時(shí)或順序給藥人類可溶性CD146和上文定義的任何其他化合物(例如上文描述的“預(yù)處理過的”、“引發(fā)過的”和/或遺傳修飾過的細(xì)胞)、單次或重復(fù)給藥等，其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行調(diào)整。含有本發(fā)明的產(chǎn)品的藥物組合物可以例如系統(tǒng)地、皮下、脊椎內(nèi)、腦內(nèi)給藥給患者，只要靶向病理組織或區(qū)域即可。優(yōu)選的注射方式是系統(tǒng)注射，特別是靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或皮下注射。本發(fā)明的分子還可用于診斷方法中。術(shù)語診斷是指任何體內(nèi)、離體或體外診斷，包括分子檢測、監(jiān)測、定量、比較等。具體來說，人類可溶性CD146蛋白可用作生物標(biāo)志物，為哺乳動(dòng)物、優(yōu)選為人類中的疾病、特別是局部缺血或癌癥的存在、腫瘤的轉(zhuǎn)移或這些疾病狀態(tài)的進(jìn)展提供指示。具體來說，人類可溶性CD146蛋白的血清濃度在這種情況下可能指示為高的值。事實(shí)上，可以將測量值同與對(duì)象健康狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較。具體來說，可溶形式的CD146的過表達(dá)可能指示了癌癥的存在。術(shù)語診斷還包括使用分子篩選在體外、離體或體內(nèi)引起或增加細(xì)胞凋亡的化合物或治療。本文還提供了試劑盒，其包含至少一種本文所述的生物活性產(chǎn)物例如人類可溶性 ⑶146，針對(duì)所述人類可溶性⑶146的抗體、特別是單克隆抗體，“預(yù)處理過”或“引發(fā)過”(用所述人類可溶性CD146刺激過)和/或遺傳修飾過(以過表達(dá)短形式的CD146或可溶性 CD146)的細(xì)胞，以及任選的(ii)提供指導(dǎo)的說明書。本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將在下面的實(shí)施例中描述，所述實(shí)施例應(yīng)該被視為說明性的而不是限制性的。所有在本申請(qǐng)中引用的參考文獻(xiàn)在此引為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1 可溶性⑶146顯示出血管生成性質(zhì)并在實(shí)驗(yàn)性后肢局部缺血中促進(jìn)新
生血管化。材料和方法重組人類可溶性⑶146對(duì)應(yīng)于可溶形式人類⑶146的帶有c-myc標(biāo)簽的重組蛋白從 Biocytex (Marseille，法國)獲得。⑶146在其N-端的表位標(biāo)簽?zāi)苁刮覀兪褂每筩-myc肽抗體(Abeam)特異性檢測重組分子并將其與內(nèi)源⑶146區(qū)分開。體內(nèi) Matrigel 膠塞
將非免疫受損小鼠或裸鼠麻醉，并將含有0. 1 μ g/μ 1 c-myc肽或0. 1 μ g/μ 1 rh-s⑶146的400 μ 1冰冷的matrigel分別注射到每只動(dòng)物的左側(cè)和右側(cè)腹股溝區(qū)域中。 然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)向動(dòng)物注射或不注射500，000個(gè)晚期EPC。12天后，取出matrigel膠塞并冷凍。上述過程在學(xué)術(shù)委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物使用規(guī)程下進(jìn)行。在大鼠中誘導(dǎo)后肢局部缺血通過完全切除整個(gè)左側(cè)股動(dòng)脈然后進(jìn)行微珠注射，對(duì)雄性大鼠進(jìn)行了單側(cè)后肢局部缺血。激光多普勒組織成像顯示，左側(cè)總股動(dòng)脈的阻塞在第一日將血液灌注減少了約 90%。手術(shù)后，將動(dòng)物分成四個(gè)處理組兩個(gè)對(duì)照組每日在局部缺血的內(nèi)收肌中注射IOyg c-myc肽5日或12日；兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相同處理，只是將c-myc肽替換成重組人類可溶性⑶146 (rh-s⑶146)。上述過程在學(xué)術(shù)委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物使用規(guī)程下進(jìn)行。激光多普勒血液流動(dòng)分析使用激光多普勒血流分析儀測量局部缺血與正常后肢相比的血液流動(dòng)比。在不同時(shí)間點(diǎn)(手術(shù)后第1、5、10、15和21日)，在目標(biāo)區(qū)域(腿和腳)上對(duì)動(dòng)物進(jìn)行2次連續(xù)的激光掃描。血液流動(dòng)被表示成局部缺血與正常后肢相比的比。形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和免疫化學(xué)評(píng)估在局部缺血誘導(dǎo)或啟動(dòng)后第20日，使用致死劑量的戊巴比妥(Clin Midy, Gentilly，法國)將動(dòng)物處死，并通過用4%磷酸鹽緩沖的聚甲醛(Sigma-Aldrich)進(jìn)行跨心臟灌注將肌肉固定。使用滑動(dòng)式切片機(jī)(CM1900，Leica，F(xiàn)rance SA)切出冷凍切片，并儲(chǔ)存在-20°C。所有切片由對(duì)實(shí)驗(yàn)條件未知的研究人員使用裝備有數(shù)字相機(jī)(DXM1200，Nikon France SA)的光學(xué)顯微鏡(Eclipse TE 2000-U, Nikon France SA)進(jìn)行檢查。在局部缺血誘導(dǎo)20天后，通過在用曙紅-蘇木精染色的連續(xù)肌肉切片上對(duì)局部缺血區(qū)域的核心和邊界區(qū)中誘導(dǎo)的細(xì)胞變化進(jìn)行顯微鏡檢查，執(zhí)行了組織學(xué)分析。切片檢查在光學(xué)顯微鏡下、在兩個(gè)連續(xù)切片上進(jìn)行。使用從無(_)到強(qiáng)(++)的四點(diǎn)標(biāo)度進(jìn)行了細(xì)胞變化的半定量評(píng)估。毛細(xì)血管密度通過肌肉冷凍切片的顯微鏡分析來確定。在體內(nèi)matrigel膠塞實(shí)驗(yàn)或?qū)∪膺M(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，使用5 μ m厚的切片用來染色。 在正常血清中阻斷后，將切片在4°C下用抗⑶31抗體(1/50)、抗⑶117抗體(1/50)、抗⑶34 抗體(1/40)、抗 CD45 抗體(1/200)、抗 M0MA2 抗體(1/200)、抗 α sma 抗體(1/80)、抗 CD33 抗體(1/100)或抗CD146抗體(1/100)處理。當(dāng)未結(jié)合時(shí)，信號(hào)放大使用熒光染料(Alexa 488 或 Alexa 647)偶聯(lián)的第二抗體(1/250 ； Invitrogen)。將切片用 DAPI(1 1000， Sigma-Aldrich)復(fù)染、漂洗并固定。為了評(píng)估非特異性染色，每隔一張切片在不含第一抗體的情況下溫育。循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離和細(xì)胞培養(yǎng)將在同意后從供體收獲的人類臍帶血樣品收集在肝素化的試管中。通過密度梯度離心分離單核細(xì)胞(MNC)。然后將臍帶血MNC在塑料三角瓶中在RPMI/10%胎牛血清 (FCS)中預(yù)鋪板M小時(shí)。將非黏附細(xì)胞鋪板在0.2%明膠包被的M孔板上(每個(gè)孔IO5個(gè)細(xì)胞)，并維持在增補(bǔ)有EGM-2 SingleQuots的內(nèi)皮基本培養(yǎng)基_2 (EBM-2) (EGM-2培養(yǎng)基， Clonetics, ffalkersville, MD, USA)中。為了擴(kuò)增內(nèi)皮祖細(xì)胞衍生細(xì)胞(EPDC)、也稱為晚內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，將集落用胰蛋白酶處理，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞重新鋪在平板或Iabtek載片上。將細(xì)胞維持在標(biāo)準(zhǔn)條件下(加濕氣氛，5% C02，37°C )。
對(duì)于EPDC刺激實(shí)驗(yàn)來說，將細(xì)胞在EBM2中維持3小時(shí)，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)用 50ng/ml 重組人類可溶性 CD146 (rh-sCD146) (biocytex)、20ng/ml VEGF (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)或適合的溶液刺激1至M小時(shí)。體外趨化活性實(shí)驗(yàn)在半透性Transwell濾器(8 μ m孔徑；24孔；B&D)上在EGM2培養(yǎng)基中進(jìn)行。 將500，000個(gè)事先用鈣黃綠素在37°C下標(biāo)記30分鐘的EPDC接種到上層區(qū)室中。然后在下層區(qū)室中加入不同濃度的rh-s⑶146，在37°C溫育過夜后測量EPDC跨過濾器的遷移。使用 cytofluor 裝置(Cytofluor Series 4000 ；PerSeptive Biosystems)測量熒光強(qiáng)度。Matrigel中內(nèi)皮細(xì)胞管的形成將 96 孑L板用冷的 Matrigel Basement Membrane (10mg/ml, BD Biosciences, Bedford, MA, USA) :EBM_2培養(yǎng)基的1 : 1的混合物預(yù)包被。在37°C下聚合45分鐘后，將 EPDC以IO4個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪于增補(bǔ)或未增補(bǔ)rh-s⑶146或VEGF的EBM中。5小時(shí)后， 在倒置顯微鏡下以400x的放大倍數(shù)對(duì)每種條件獲取代表性視野的照片。通過用Lucia 軟件(Nikon)測量血管總長度和每個(gè)視野中的血管數(shù)量來評(píng)估毛細(xì)血管形成。細(xì)胞增殖測定方法將EPDC接種在96孔板上(5. IO3/孔)，并在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。然后將細(xì)胞在EBM-2培養(yǎng)基中預(yù)溫育2小時(shí)。細(xì)胞增殖使用來自Roche Corporation的BrdU標(biāo)記和檢測試劑盒III，通過5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)在細(xì)胞DNA中的摻入來測定。簡單來說，將細(xì)胞在不存在或存在rh-sCD146或VEGF的情況下，在EBM-2培養(yǎng)基中與BrdU標(biāo)記溶液溫育12小時(shí)。將細(xì)胞DNA通過核酸酶處理進(jìn)行部分消化，并使用過氧化物酶偶聯(lián)的第一抗體檢測摻入的BrdU。使用Uvmc2微孔板讀板器(Mfas,Monaco)測量405nm處的吸光度。 結(jié)果用任意單位表示。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式三份。傷口愈合測定方法使用移液管尖頭在M孔板上培養(yǎng)的EPDC合生單層上制造可重現(xiàn)的傷口。使用 Olympus倒置顯微鏡以400x放大倍數(shù)測量傷口表面，并用Biocom Visiolab圖像分析軟件 (Les Ulis, France)獲取。除去培養(yǎng)基，將EPDC與含有或不含不同濃度rh_sCD146的EBM-2 溫育6小時(shí)。通過從原始傷口面積中減去溫育6小時(shí)后測量到的傷口面積，來計(jì)算細(xì)胞傷口修復(fù)。結(jié)果被表示成百分率，以原始傷口的面積作為100%。Western 印跡分析Western印跡分析如下執(zhí)行。簡單來說，將細(xì)胞在用或未用rh_s⑶146處理的板上，然后在PBS中清洗，從板上刮下，并用300 μ 1冰冷的裂解緩沖液(150mM NaCl, 50mM Tris HCl (pH 7. 4), 2. 4mM EDTA, 1% Nonidet P40，0. 5mM 苯甲基磺酰氟)在 4°C下提取 30 分鐘。在離心(12，000g，10min，4°C )除去細(xì)胞碎片和核之后，通過蛋白測定法(Biorad)對(duì)蛋白定量。將30 μ g蛋白重懸浮在40 μ 1 NuPage LDS樣品緩沖液(Invitrogen)中。然后對(duì)樣品進(jìn)行4-12% NuPage SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Invitrogen)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Invitrogen)。使用特異性第一抗體(抗KDR抗體、抗ul^a抗體、抗MMP-2抗體、抗e_N0S 抗體(參見下文))，然后用與過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體對(duì)膜進(jìn)行探測，并使用ECL試劑盒 (Amersham)檢測。膜在剝脫后使用各種抗體進(jìn)行探測?；虮磉_(dá)情況分析
從用或未用50ng/ml rh_sCD146處理3小時(shí)的培養(yǎng)的EPDC分離總細(xì)胞RNA。這使用RNeasy試劑盒Oliagen GmbH，Hilden，德國)，按照制造商的說明書包括DNase消化步驟來進(jìn)行。寡核苷酸陣列雜交使用血管發(fā)生寡核苷酸陣列(Tebu-Bio)按照制造商的說明書來進(jìn)行。使用軟件對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行定量。對(duì)于測試和參比DNA斑點(diǎn)兩者的信號(hào)平均強(qiáng)度來說， 進(jìn)行了背景的差減。針對(duì)所有比率的平均值進(jìn)行計(jì)算比率的歸一化。雜交進(jìn)行三次，并從一次代表性實(shí)驗(yàn)獲取數(shù)據(jù)。RNA分離、cDNA合成和實(shí)時(shí)PCR按照制造商的說明書包括DNase消化步驟，使用RNeasy試劑盒Oliagen GmbH, Hilden，德國)從EPDC分離總細(xì)胞RNA。將5 μ g總RNA在50 μ 1反應(yīng)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所述反應(yīng)含 40U RNaseOUT(Invitrogen, Frederick, Maryland, USA)、150ng 隨機(jī)六聚物引物 (Roche Manheim,德國)、10mM dNTP (Invitrogen)禾口 200U Superscript II (Invitrogen)。 在0. 4 μ M的優(yōu)化寡核苷酸濃度下，使用對(duì)各種基因或?qū)φ栈蛱禺惖囊锝M對(duì)cDNA樣品 (0. 2 μ 1)進(jìn)行qPCR.正向(F)和反向(R)特異性引物序列是UPA-F :TTTGCGGCCATCTACAGGAG(SEQ ID NO :18)UPA-R :AGTTAAGCCTTGAGCGACCCA (SEQ ID NO :19)KDR-F :TGTGGGTTTGCCTAGTGTTTCT(SEQ ID NO :20)KDR-R :CACTCAGTCACCTCCACCCTT(SEQ ID NO :21)eNOS-F :CTCATGGGCACGGTGATG(SEQ ID NO :22)eNOS-R :ACCACGTCATACTCATCCATACAC(SEQ ID NO :23)MMP2-F TGATCTTGACCAGAATACCATCGA (SEQ ID NO :24)MMP2-R :GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT (SEQ ID NO :25)反應(yīng)在20 μ 1總體積中使用FastMart DNA Master 5 SYBR GreenI試劑盒按照制造商的說明書(Roche)進(jìn)行。擴(kuò)增循環(huán)如下95°C下IOmin (熱啟動(dòng)PCR)，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95°C下10sec、62°C下IOsec和72°C下20sec (產(chǎn)物擴(kuò)增)。在擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束時(shí)，通過將溫度緩慢增加(0. rC/sec)到高達(dá)95°C，進(jìn)行了解鏈溫度分析。擴(kuò)增、數(shù)據(jù)獲取和分析使用Light Cycler儀器和LightCycler 3. 5. 2軟件(Roche)進(jìn)行。將每個(gè)基因的臨界循環(huán)數(shù)(Ct)針對(duì)GAPDH的臨界循環(huán)數(shù)進(jìn)行歸一化。給出的值是指針對(duì)IO6個(gè)GAPDH轉(zhuǎn)錄本拷貝的給定基因的轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)。肽、抗體和抑制劑制備了重組人類可溶形式的⑶146 (rh-s⑶146)及其FITC偶聯(lián)版本。該肽對(duì)應(yīng)于 N-端帶有c-myc表位標(biāo)簽的人類CD146的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EQKLISEEDL (SEQ ID NO :26))。標(biāo)簽用于特異性追蹤外源重組蛋白并用于對(duì)照免疫貧化實(shí)驗(yàn)。使用相應(yīng)的c-myc肽(Abeam) 作為對(duì)照。Fc-⑶146通過將人類IgGl的Fc部分與人類⑶146的細(xì)胞外部分融合來產(chǎn)生?？?KDR抗體(Sigma)、抗uPa抗體(American diagnostic inc.)、抗MMP-2 抗體(Calbiochem)、 抗 e-N0S抗體(Santa Cruz Biotechnology)、抗CD146 抗體(克隆 S-Endo-l ；Biocytex)、抗 CD31 抗體(B&D)、抗 CD45 抗體(B&D)、抗 CD33 抗體(B&D)和抗 CD117 抗體(B&D)以 1/500 的稀釋度使用。在本研究中使用的抗小鼠抗體是抗CD45抗體、抗CD34抗體、抗asma抗體、抗 M0MA2抗體(Dako Inc. ；Glostrup ；Denmark) >Alexa fluor 488抗CD31 抗體禾口Alexa fluor647 抗 CDl 17 抗體(Biolegend)、抗 CD33 抗體(Santa Cruz)和抗 CD146 抗體。在本研究中使用的抗大鼠抗體是抗⑶117抗體(Neuromics)和抗⑶146抗體。使用了抗VEGFR2 阻斷抗體(r212 ；Acris Antibodies GmbH, Herford ；德國)。使用免疫測定法測定培養(yǎng)基中的VEGF濃度。實(shí)驗(yàn)按照制造商(Invitrogen)的描述進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示成所標(biāo)明次數(shù)的實(shí)驗(yàn)的平均值士SEM。統(tǒng)計(jì)分析使用Prism軟件 (GraphPad Software Inc. , San Diego, USA)進(jìn)行。顯著差異使用非參數(shù)性 Mann Whitney 檢驗(yàn)確定。P值< 0.05被認(rèn)為是顯著的。MM內(nèi)皮細(xì)胞上的重組人類可溶性⑶146在體內(nèi)和體外表現(xiàn)出趨化活性本發(fā)明人通過在非免疫缺陷小鼠中植入含有rh-s⑶146(0，lyg/μ 1)的三維 matrigel膠塞，研究了內(nèi)皮細(xì)胞上rh_sCD146的趨化性質(zhì)。因?yàn)閞h_sCD146帶有myc標(biāo)簽 (參見材料和方法)，因此使用c-myc肽(0，1μβ/μ1)作為對(duì)照分子。結(jié)果顯示，在14天后，rh-sCD146 Matrigel膠塞與對(duì)照Matrigel膠塞相比含有多約100倍的細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠組織成血管樣結(jié)構(gòu)，并且它們大部分對(duì)CD31染色陽性，表明它們是內(nèi)皮來源的(圖
IA)。為了檢查在填充有rh-s⑶146的matrigel膠塞中存在的不同細(xì)胞類型，使用 ⑶31、⑶45、⑶34、α-SMA、CD117和M0MA-2進(jìn)行染色。圖IB中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，造血細(xì)胞 (CD45陽性)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(M0MA-2陽性)、平滑肌細(xì)胞和/或周細(xì)胞(α -SMA陽性)和內(nèi)皮細(xì)胞(⑶31陽性)可以被rh-s⑶146募集。在整合到血管樣結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞中， 本發(fā)明人觀察到了 CD34陽性細(xì)胞(造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞/成熟內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物)和被未分化標(biāo)志物CD117染色的未成熟細(xì)胞。為了更好地對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行表征，進(jìn)行了共染色 (圖1B)。結(jié)果顯示，參與血管樣結(jié)構(gòu)的⑶31陽性細(xì)胞也是⑶146陽性的。有趣的是，血管樣結(jié)構(gòu)中存在的約10-15%的⑶31陽性或⑶146陽性細(xì)胞與未分化標(biāo)志物⑶117共染色 (圖1B)。最后，雙標(biāo)記⑶117+/⑶33-和⑶117+/⑶45-顯示這些未分化細(xì)胞不是骨髓或造血來源的。本發(fā)明人在注射有人類EPC的裸鼠中進(jìn)行了相同類型的matrigel膠塞實(shí)驗(yàn)(圖
IB)。植入到裸鼠中并含有rh-sCD146(lyg/y 1)的Matrigel膠塞與對(duì)照膠塞相比能夠調(diào)動(dòng)大量細(xì)胞，正如已經(jīng)在正常小鼠中觀察到的(參見上文)。一部分這些細(xì)胞是人類EPC， 正如由抗人類CD31抗體的陽性標(biāo)記所證實(shí)的，而在相同動(dòng)物中的對(duì)照膠塞中沒有觀察到人類EPC。有趣的是，EPC還參與結(jié)構(gòu)化血管的塑造(圖1B)。在體外證實(shí)了 EPC上rh-s⑶146的趨化活性(圖1C)。rh_s⑶146的趨化活性從 0增加到50ng/ml，然后保持在高達(dá)400ng/ml的平穩(wěn)狀態(tài)。使用50ng/ml rh_sCD146觀察到的趨化效應(yīng)與使用20ng/ml VEGF觀察到的相似。在rh_s⑶146免疫貧化后，用c-myc肽或緩沖溶液處理的樣品中不能檢測到趨化活性。合在一起，這些結(jié)果證明了 rh-s⑶146能夠調(diào)動(dòng)成熟和未成熟內(nèi)源內(nèi)皮細(xì)胞和外部給藥的EPC兩者。這是分子的重要性質(zhì)，因?yàn)镋PC在血管發(fā)生和血管生成中發(fā)揮主要作用。
重組人類可溶性⑶146在體外增加內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的血管生成能力本發(fā)明人檢查了 rh-s⑶146對(duì)EPC的功能性質(zhì)的影響。為此目的，他們評(píng)估了不同濃度的rh-sCD146對(duì)EPC管形成、遷移和增殖的影響，并將這些影響與血管生成細(xì)胞因子 VEGF的影響進(jìn)行比較。在Matrigel膠塞模型中評(píng)估了毛細(xì)血管的形成，所述膠塞是基于層粘連蛋白的凝膠，其模擬細(xì)胞微環(huán)境并能夠進(jìn)行三維細(xì)胞組織化(圖2A)。當(dāng)將EPC接種到matrigel膠塞上時(shí)，發(fā)生內(nèi)皮管的自發(fā)形成，管反過來形成毛細(xì)血管網(wǎng)。添加rh_s⑶146 增加了該網(wǎng)絡(luò)的發(fā)生，正如通過管的數(shù)量(圖2A)和長度(數(shù)據(jù)未顯示)的增加所顯示的。 在25至100ng/ml rh_sCD146之間，這種效應(yīng)是劑量依賴性的。使用50ng/ml rh_sCD146 觀察到的效應(yīng)與使用20ng/ml VEGF觀察到的相似。當(dāng)細(xì)胞用對(duì)照c-myc肽或免疫貧化的 rh-s⑶146處理時(shí)，沒有觀察到效應(yīng)。還評(píng)估了 rh-s⑶146對(duì)EPC增殖(圖2B)和遷移(圖 2C)的影響。在兩種情況下，rh-s⑶146的影響是分子特異性的(rh_s⑶146免疫貧化后的緩沖液沒有影響)和劑量依賴性的。在這些實(shí)驗(yàn)中，50ng/ml rh_s⑶146的影響也與使用 20ng/ml VEGF觀察到的影響相似。因此，除了募集EPC之外，rh-s⑶146似乎能夠通過增加它們的血管生成活性來活化這些細(xì)胞。EPC在Matrigel膠塞中的增殖、遷移和組織成血管樣結(jié)構(gòu)的能力，以與使用 VEGF時(shí)過觀察到的非常相似的程度增加。自從R)lkman及同事在1971年的開創(chuàng)性工作以來，已經(jīng)對(duì)幾種血管生成生長因子的治療潛力進(jìn)行了廣泛研究。在它們之中，VEGF已被反復(fù)顯示出增加血管發(fā)生，并且已經(jīng)試驗(yàn)了大量基于注射 VEGF 肽或編碼 VEGF 的質(zhì)粒 DNA 的治療方法(Nomi M, Miyake H, Sugita Y, Fujisawa M，Soker S.生長因子和內(nèi)皮細(xì)胞在治療性血管發(fā)生和組織工程中的作用(Role of growth factors and endothelial cells in therapeutic angiogenesis and tissue engineering.)Curr Stem Cell Res Ther. 2006 ； 1 :333-43)。也已顯示bFGF增加小動(dòng)脈側(cè)枝生長，并且實(shí)驗(yàn)表明了 VEGF與bFGF之間的相 51 ! ft (Stavri GT, Zachary IC, Baskerville PA, Martin JF, Erusalimsky JD. M 性成纖維細(xì)胞生長因子在血管平滑肌細(xì)胞中上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，與缺氧的 ttl、同才百互作用(Basic fibroblast growth factor upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. Synergistic interaction with hypoxia.)Circulation. 1995 ；92(1) :11-4)。通過發(fā)展血管介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的募集的血管新生蛋白因子-1、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)似乎也參與梗死的心肌中局部缺血后血管的側(cè)枝形成(Vandervelde S, van Luyn MJ, Tio RA, Harmsen MC.干細(xì)胞介導(dǎo)的梗死心肌修復(fù)中白勺ilf號(hào) 1 專導(dǎo) 13子(Signaling factors in stem cell-mediated repair of infarcted myocardium), J Mol Cell Cardiol. 2005 ；39 (2) :363-76)。最后，已顯示內(nèi)皮一氧化氮合酶 e-N0S在缺血組織中表現(xiàn)出強(qiáng)的血管生成效應(yīng)(Duda DG, Fukumura D，Jain RK.，eNOS在新生血管化中的作用用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的N0(Role of eNOS in neovascularization :N0 for endothelial progenitor cells.)Trends Mol Med. 2004 ; 10 :143-5)?，F(xiàn)在，可溶形式的⑶146似乎作為一種新的非常相關(guān)的促血管生成生長因子， 正如由本發(fā)明人在本文中所證實(shí)的。事實(shí)上，本發(fā)明人的體外實(shí)驗(yàn)顯示，使用50ng/mlrh-sCD146獲得的效應(yīng)與使用20ng/mlVEGF時(shí)所觀察到的類似(圖2)。因?yàn)閞h-s⑶146和VEGF的效應(yīng)非常相似，因此本發(fā)明人測試了它們的效應(yīng)是否是累加的、協(xié)同的。為此，添加兩種因子rh-sCD 146 50ng/ml和VEGF 20ng/ml進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)(圖5)。結(jié)果顯示，兩種分子對(duì)EPC增殖(圖5A)、遷移(圖5B)和在matrigel中形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力(圖5C)的影響是累加的。為了進(jìn)一步了解機(jī)制，它們在抗VEGFR2 抗體的存在下在matrigel中進(jìn)行了附加的毛細(xì)血管形成實(shí)驗(yàn)。將這些抗體與一直用VEGF 和/或rh-s⑶146進(jìn)行處理以完全阻斷VEGFR2的細(xì)胞溫育，或與細(xì)胞進(jìn)行預(yù)溫育，然后清洗抗體并用rh-s⑶146加VEGF進(jìn)一步處理。該后一種條件允許在刺激之前阻斷存在于膜上的VEGFR2，但是rh-sCD146最終沒有誘導(dǎo)VEGFR2。結(jié)果(圖5C)顯示，抗VEGFR2抗體1/在對(duì)照條件下沒有效應(yīng)，2/完全阻斷VEGF 的效應(yīng)，并且3/部分阻斷rh-s⑶146的效應(yīng)。當(dāng)在抗體存在下添加rh-s⑶146和VEGF時(shí)， 與沒有抗體的條件相比毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量減少，并且管的數(shù)量與抗VEGFR2抗體存在下使用rh-sCD146所觀察到的相近。最后，當(dāng)將細(xì)胞與抗VEGFR2抗體預(yù)溫育，然后清洗抗體并用rh-s⑶146和VEGF進(jìn)一步刺激時(shí)，毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量與前述條件下相比明顯更高，表明rh-sCD146在細(xì)胞表面誘導(dǎo)了新的VEGFR2。合在一起，這些實(shí)驗(yàn)表明rh_sCD146響應(yīng)主要參與SCD146特異性途徑，但是在較少程度上也通過在細(xì)胞表面誘導(dǎo)新的VEGFR2來參與VEGF信號(hào)傳導(dǎo)途徑。還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以測試rh-sCD146處理是否改變VEGF分泌。用50ng/ml rh_sCD146 處理M小時(shí)的EPC與未處理過的EPC相比，顯示出VEGF分泌的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加 (71. 8+/-6. 1 比 54. 8+/-3. 2pg/ml, η = 6 ;p < 0. 05)。重組人類⑶146在內(nèi)皮祖細(xì)胞中誘導(dǎo)前血管生成基因的轉(zhuǎn)錄本發(fā)明人假設(shè)，在EPC上觀察到的rh-s⑶146的功能效應(yīng)可能部分依賴于基因轉(zhuǎn)錄。為了檢驗(yàn)這個(gè)假說，他們使用特異性針對(duì)血管生成基因的寡核苷酸陣列監(jiān)測了用 rh-s⑶146處理EPC后基因表達(dá)的變化。在113個(gè)被探測的基因(參見方法)中，一些被上調(diào)，其他被下調(diào)或沒有改變。在被上調(diào)的基因中，他們選擇了在用50ng/ml rh_s⑶146處理 3小時(shí)的EPC中可重復(fù)地上調(diào)了至少5倍的4個(gè)基因。它們包括eNOS、VEGF受體2 (KDR)、 基質(zhì)金屬肽酶MMP-2和血纖維溶酶原激活劑尿激酶(PLAU/u-Pa)(圖；3)。在用50ng/ml rh_sCD146處理EPC后這些基因表達(dá)的變化通過qPCR和^festern印跡分析進(jìn)行了驗(yàn)證。 qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，在用50ng/ml rh_s⑶146處理3小時(shí)后，所有四個(gè)基因的mRNA有效地、顯著地增加(圖3A)。在蛋白質(zhì)水平上，在處理后1小時(shí)eNOS和u_Pa的表達(dá)明顯增加，而在處理后3小時(shí)觀察到了 KDR和MMP-2的增加(圖和3C)。增加的蛋白表達(dá)維持了 M小時(shí)。因此，rh-s⑶146的一種主要效應(yīng)是增加幾種前血管生成蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在本研究中被rh-sCD146上調(diào)的蛋白似乎在血管發(fā)生過程中是特別重要的。具體來說，在血管生成期間或腫瘤血管發(fā)生期間，KDR的活性急劇增加。它通過誘導(dǎo)幾種蛋白例如uPA、uPAR和一些MMP的表達(dá)作用于內(nèi)皮細(xì)胞。在我們的研究中被 rh-sCD146誘導(dǎo)的兩種其他蛋白是u_PA和MMP-2。它們屬于蛋白水解復(fù)合物，其在遷移和細(xì)胞增殖期間促進(jìn)基膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。它們參與生理性和腫瘤性血管發(fā)生兩者。有趣的是，⑶146的活性通常顯得與MMP-2的活性偶聯(lián)。事實(shí)上，已經(jīng)顯示，通過抗MUC18抗體治療黑素瘤降低了 HUVEC在體外定植于Matrigel膠塞的能力，并且這與MMP-2的膠原酶活性降低相關(guān)。eNOS是另一種rh_s⑶146誘導(dǎo)的蛋白，其也似乎在血管發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 eNOS在干細(xì)胞調(diào)動(dòng)中的作用似乎是必需的。用eNOS合酶轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)劑AVE9488對(duì)源自于患有缺血性心肌病的患者的骨髓單核細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，能夠恢復(fù)這些祖細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管化的能力。局部注射重組人類可溶性⑶146在大鼠局部缺血后肢模型中增加新生血管化根據(jù)rh-sCD146的體外和體內(nèi)性質(zhì)，本發(fā)明人測試了它在大鼠后肢局部缺血的體內(nèi)模型中的潛在治療效果。圖4A中給出的結(jié)果顯示，在用10 μ g rh-s⑶146/天處理局部缺血后肢5天后，在開始局部缺血后5天，與用c-myc肽處理的對(duì)照動(dòng)物相比，動(dòng)物的自斷離水平顯著降低。相反，在開始局部缺血后10天或20天的處理組之間，它沒有顯著差異。 激光多普勒組織成像顯示，在第一天時(shí)，左側(cè)股總動(dòng)脈的阻塞使血液灌注降低了約90%。在第5天時(shí)，與對(duì)照組相比，用rh-s⑶146處理顯著增加了血液灌注速率，但是在第10和20天時(shí)，在兩個(gè)組之間沒有觀察到血流的進(jìn)一步顯著變化。當(dāng)用同樣劑量的rh-s⑶146(10yg/ day)處理動(dòng)物，但是處理更長的時(shí)間(12天)時(shí)，在第5、10和20天時(shí)，與對(duì)照大鼠相比，現(xiàn)在自斷離水平顯著降低。在這些條件下，從第5至第20天，血液灌注速率也顯著增加，在第 20天時(shí)達(dá)到相同動(dòng)物的對(duì)照腿中血液灌注速率的約60% (圖4A)。20天后肌肉切片的組織化學(xué)檢查顯示出在沒有用rh-sCD146處理的局部缺血后肢中存在炎癥、鈣化、纖維變性區(qū)域和大量壞死的肌纖維(圖4B)。相反，在用rh-sCD146處理12天的局部缺血后肢中，幾乎沒有觀察到纖維變性，炎癥和壞死的肌纖維大量減少(圖4B和圖4C)。毛細(xì)血管的檢查顯示，與對(duì)照局部缺血肢相比，它們的數(shù)量顯著增加，并且肌肉狀況顯著改善，大部分肌纖維完整(圖4B和圖4C)。有趣和有利的是，本發(fā)明人還觀察到了 rh-sCD146對(duì)斷肢愈合的營養(yǎng)效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。因?yàn)樵隗w內(nèi)，在含有rh-s⑶146 Wmatrigel膠塞中觀察到了參與血管樣結(jié)構(gòu)的CD117/CD146陽性內(nèi)皮前體細(xì)胞(參見圖1B)，本發(fā)明人測試了在局部缺血后的大鼠肌肉中是否也能檢測到這樣的細(xì)胞。為此，本發(fā)明人在開始處理后兩天分析了用或未用 rh-s⑶146處理過的具有后肢局部缺血的大鼠的肌肉，以便檢測早期事件。結(jié)果顯示，可以在rh-s⑶146處理過的動(dòng)物中檢測到⑶117/⑶146陽性細(xì)胞，而在對(duì)照大鼠中沒有發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞(圖4D)。Mrk體內(nèi)matrigel膠塞實(shí)驗(yàn)顯示，s⑶146在不同細(xì)胞類型上顯示出趨化活性，這包括內(nèi)皮細(xì)胞，正如由它們插入到血管樣結(jié)構(gòu)中以及它們對(duì)內(nèi)皮標(biāo)志物例如⑶34、⑶146或 ⑶31的陽性染色所證實(shí)的(這些細(xì)胞的雙重染色顯示它們是⑶33和⑶45陰性的，表明它們不是骨髓或造血來源的)，以及造血細(xì)胞例如單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和/或周細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示出SCD146能夠募集外源注射的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，在本文中也稱為 EPDC0募集的內(nèi)皮細(xì)胞參與血管樣結(jié)構(gòu)的形成。在體外，s⑶146增強(qiáng)EPC的血管生成性質(zhì)，具有增加的細(xì)胞遷移、增殖和建立毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的能力。到目前為止，可溶性CD146的受體仍然未知。膜CD146不是該受體，因?yàn)樵趦煞N分子之間還沒有親同種相互作用的證據(jù)。具體來說，觀察到的效應(yīng)是與VEGF的效應(yīng)累加的。s⑶146增強(qiáng)VEGFR2的表達(dá)和 VEGF的分泌。與促血管生成前體的功能相一致，s⑶146刺激的EPC的基因表達(dá)情況分析具體揭示了 eNOS、uPa、MMP2和VEGFR2的上調(diào)。膜結(jié)合⑶146的沉默抑制了這些響應(yīng)。在后肢局部缺血模型中測試了 s⑶146的潛在治療價(jià)值。本發(fā)明證實(shí)，局部注射 SCD146顯著減少自斷離、組織壞死、纖維變性、炎癥并增加血流。在本文中確立了在肢體局部缺血模型中s⑶146顯示出趨化和血管生成性質(zhì)，并促進(jìn)有效的新生血管化。因此，重組人類SCD146支持了在局部缺血疾病和障礙中用于治療性血管發(fā)生的新策略。控制s⑶146的有利效應(yīng)的完整機(jī)制是未知并有待確定的，但是可能涉及幾條途徑。SCD146能夠作用于局部內(nèi)皮駐留細(xì)胞和/或單核細(xì)胞浸潤，因?yàn)楸景l(fā)明人證明了在體內(nèi)對(duì)matrigel膠塞中的單核細(xì)胞的趨化效應(yīng)(Bardin N, Blot-Chabaud M, Despoix N等， CD146及其可溶形式調(diào)控單核細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(CD146 and its soluble form regulate monocyte transendothelial migration.)Arterioscler. Thromb Vasc Biol. 2009 ；29 746-53)?？蛇x地或此外，s⑶146可能通過將內(nèi)皮祖細(xì)胞募集到新生血管化區(qū)域而在血管生成中發(fā)揮作用。與該后一種假說相一致，表現(xiàn)出晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞特征的細(xì)胞被募集到 matrigel膠塞中，并組織成血管樣結(jié)構(gòu)。此外，在用s⑶146處理兩天后的肌肉切片中，可以觀察到未成熟內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)施例2 根據(jù)活的人類皮膚外植體上的皮膚愈合動(dòng)力學(xué)研究有效成分的愈合活性本研究的目的是根據(jù)由UVB輻照在活的皮膚外植體上誘導(dǎo)的表皮和真皮損傷的愈合動(dòng)力學(xué)證實(shí)SCD146的活性。該活性通過觀察普通形態(tài)學(xué)并通過纖連蛋白和整合蛋白 β4的特異性免疫標(biāo)記物來評(píng)估。操作方法外植體的制備制備了來自于42歲女性的腹部整形術(shù)(Ρ718ΑΒ42)的三十個(gè)外植體，并將其在 BIO-EC外植體培養(yǎng)基(BEM)中保持存活。將外植體在各含有ImL BEM的12孔培養(yǎng)板中如下所述分成兩批9個(gè)外植體和兩批6個(gè)外植體
權(quán)利要求
1.一種人類可溶性⑶146蛋白，其含有552至558個(gè)氨基酸。
2.權(quán)利要求1的蛋白，其包含由選自SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的序列構(gòu)成的氨基酸序列。
3.一種組合物，其包含權(quán)利要求1或2的蛋白和可藥用載體。
4.權(quán)利要求3的組合物，其還包含選自血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I(SDF-I)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-8(IL-8)的血管生成因子及其混合物。
5.權(quán)利要求3或4的組合物，其還包含內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，優(yōu)選為已經(jīng)與人類可溶性 ⑶146蛋白接觸過的細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中內(nèi)皮祖細(xì)胞是包含表達(dá)權(quán)利要求2的可溶性CD146蛋白或SEQ ID NO 9的人類短⑶146蛋白的核酸構(gòu)建物的重組細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中載體是質(zhì)粒。
8.一種單克隆抗體，其選擇性結(jié)合權(quán)利要求2的蛋白。
9.一種組合物，其包含權(quán)利要求8的抗體和可藥用載體。
10.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白或權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)的組合物，用于治療引起哺乳動(dòng)物組織局部缺血的疾病或障礙。
11.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白或權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)的組合物，用于預(yù)防哺乳動(dòng)物局部缺血。
12.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白或權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)的組合物，用于哺乳動(dòng)物上皮的瘢痕形成。
13.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白或權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)的組合物，用于預(yù)防哺乳動(dòng)物焦痂或用于哺乳動(dòng)物皮膚移植的情形中。
14.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白或權(quán)利要求3至7任一項(xiàng)的組合物改進(jìn)瘢痕的美觀性的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白離體制備能夠刺激人體血管發(fā)生的成熟或未成熟內(nèi)皮細(xì)胞的應(yīng)用。
16.權(quán)利要求8的單克隆抗體或權(quán)利要求9的組合物用于治療哺乳動(dòng)物以不希望的過度新生血管化、不希望的血管通透性和/或CD146受體的過度活化為特征的疾病或障礙的應(yīng)用。
17.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在體內(nèi)、離體或體外調(diào)節(jié)血管發(fā)生的組合物和方法。更具體來說，本發(fā)明涉及可用于人類治療情形中的可溶性CD146蛋白以及相應(yīng)的抗體。本發(fā)明描述的特定形式的CD146，可用于在體內(nèi)或離體帶動(dòng)成熟和未成熟內(nèi)皮細(xì)胞兩者，以及增加它們對(duì)血管發(fā)生的影響。本發(fā)明還涉及包含這些化合物的組合物，特別是藥物或診斷組合物，包括試劑盒等，以及使用所述化合物、組合物和細(xì)胞的治療或診斷方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102300983SQ201080006283
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月30日
發(fā)明者卡里姆·哈爾霍里, 弗蘭克斯·迪格納特-喬治, 本杰明·吉列特, 納薩莉·巴丁, 馬塞爾·布羅特-查寶德 申請(qǐng)人:地中海大學(xué), 法國國家衛(wèi)生及研究醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)