專(zhuān)利名稱(chēng)：使用酶在dna中產(chǎn)生隨機(jī)雙鏈斷裂的制作方法
使用酶在DNA中產(chǎn)生隨機(jī)雙鏈斷裂
背景技術(shù)：
將基因組DNA斷裂成較小的不同大小的片段是在許多測(cè)序技術(shù)中重要的步驟。目前機(jī)械斷裂方法，例如超聲處理、自適應(yīng)-聚焦聲法(adaptive-focused acoustics)或者霧化，沒(méi)有堿基切割偏好地產(chǎn)生DNA片段。但是這些方法，具有在非磷酸二酯鍵的地方破壞DNA的可能性，且與酶方法相比具有較低的DNA回收效率。另一方面，酶方法，例如依靠具有特定識(shí)別序列的限制性內(nèi)切核酸酶的那些，產(chǎn)生固定的特定大小的片段，其依賴于識(shí)別序列出現(xiàn)的頻率是可大或可小的。迄今為止，對(duì)于非特異性核酸酶的研究已經(jīng)顯示盡管識(shí)別和切割不需要非特異性序列，但是這些酶顯示出對(duì)于在切割位點(diǎn)的某些堿基的偏好(Anderson Nucleic Acids Res. 9(13) :3015-27(1981) ；Herrera 禾口 Chaires J. Mol. Biol. 236(2) :405-11 (1994))。發(fā)明簡(jiǎn)述在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，提供了包括小于1 200單位比率的非特異性核酸酶和T7Endo I突變體的制劑。在一種實(shí)施例中，非特異性核酸酶是一種嗜鹽弧菌(Vibrio vulnificus) (Vvn)核酸酶，其在Q69具有突變。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，提供了從大的DNA產(chǎn)生適合測(cè)序的片段的方法， 其包括將感興趣的DNA與包含小于1 200單位比率的非特異性核酸酶和T7 Endo I突變體的制劑混合。大DNA被切割成大小適合測(cè)序的片段。正如上所述，在方法中使用的非特異性核酸酶的例子是Vvn核酸酶，更具體地是具有增強(qiáng)比活的Vvn核酸酶突變體，如在Q69 的突變。大DNA的片段可包含一個(gè)或者兩個(gè)平端并可以被進(jìn)一步修飾以與測(cè)序DNA使用類(lèi)型的連接物(adapter)連接。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示使用麥芽糖-結(jié)合蛋白(MBP) -T7 Endo I突變體和ΜΒΡ-Vvn組合的DNA 斷裂。CB4 是 2 體積MBP-T7 Endo I 突變體(PA/A) (0. 13 單位 / μ 1)和 1 體積MBP-Vvn (0. 14 單位/μ )的混合物。每條泳道代表30μ1反應(yīng)，其中5yg基因組DNA(如在泳道的上方所指示)與3 μ 1 CB4在37°C下溫育。每個(gè)反應(yīng)在30分鐘、60分鐘和90分鐘時(shí)間間隔后用15mM EDTA停止。DNA片段被乙醇沉淀和接著風(fēng)干。DNA沉淀物在50 μ 1 1 X凝膠加樣染料——橙色(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs, Inc. ), (NEB), Ipswich, MA, NEB#B7022)中再懸浮并加樣在2%瓊脂糖凝膠上?？蛑甘敬蠹s100-200bps的片段。圖IA顯示來(lái)自海拉(宮頸腺癌)細(xì)胞、大腸桿菌(E.coli)和CpG海拉細(xì)胞 (NEB#4007)的基因組DNA的斷裂。圖IB顯示來(lái)自鯡魚(yú)(Herring)精子、λ噬菌體和Jurkat (人急性T-細(xì)胞白血病) 細(xì)胞基因組DNA的斷裂。圖2顯示與兩個(gè)DNA梯序列Ml-2_對(duì)數(shù)DNA梯序列(NEB#N3200，Ipswich, ΜΑ)
和Μ2——NEB PCR標(biāo)記物(NEB #N3234，Ipswich，ΜΑ)比較，用CB4混合物產(chǎn)生的DNA片段。 建立7種反應(yīng)并包含3 μ 1 CB4混合物和5 μ g DNA梯序列(NEB#N3231)的每50 μ 1反應(yīng)物在37°C下溫育不同時(shí)間，隨后用15mM EDTA以0、5、10、20、40、80和160分鐘時(shí)間間隔終止。片段加樣在瓊脂糖凝膠上。圖3A-;3B顯示從30μ 1反應(yīng)物中的Iyg λ DNA，在37 °C下、30分鐘使用核酸酶 MBP-Vvn核酸酶(野生型(WT))或者M(jìn)BP-Vvn核酸酶^)69 的連續(xù)稀釋產(chǎn)生DNA片段。圖3A 泳道M是NEB (Ipswich，MA) PCR標(biāo)記物(謝3234)；泳道1-9是在泳道1中的2yg MBP-Vvn核酸酶(野生型)起始的連續(xù)2倍稀釋(稀釋緩沖液20mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、50mM NaCl、0. 15% Triton X-100 禾口 0. 1 μ g/ml BSA)。泳道 3 中使用的酶的量定義為一個(gè)凝膠單位，其中90% DNA片段小于150bp。圖3B 泳道M是NEB (Ipswich，MA) PCR標(biāo)記物(#3234)；泳道1-9是在泳道1中的 1. 5 μ g MBP-Vvn酶(突變體)起始的連續(xù)2倍稀釋(稀釋緩沖液如上)。泳道6中使用的酶的量定義為一個(gè)凝膠單位。圖4顯示對(duì)與由MBP-T7 Endo I突變體和MBP-Vvn核酸酶^69S) (CB4v2)組成的混合物使用不同溫育時(shí)間產(chǎn)生的DNA片段。CB4v2是2體積MBP-T7 EndoI突變體(0. 16單位/ μ 1)禾口 1體積MBP-Vvn核酸酶(Q69S) (0. 048TCA單位/ μ 1)的混合物。每個(gè)泳道代表在37°C下與相同量的3 μ 1 CB4v2混合物一起溫育的具有5 μ g不同基因組DNA (如在泳道上方所指示)的50 μ 1反應(yīng)物。每個(gè)反應(yīng)在30分鐘、60分鐘和90 分鐘時(shí)間間隔后用15mM EDTA停止。DNA片段被乙醇沉淀和接著風(fēng)干。DNA沉淀物在50 μ 1 IX凝膠加樣染料——橙色(NEB#B7022，Ipswich, ΜΑ)中再懸浮并加樣在2%瓊脂糖凝膠上。框指示大約150bp片段。圖5顯示Vvn核酸酶0)69S)突變體的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。氨基酸序列從19位開(kāi)始，由于信號(hào)肽(1-18)沒(méi)有克隆在MBP-Vvn核酸內(nèi)切酶0169S)構(gòu)建物中?！?” 指示Q突變成S的69位。圖6A和6B顯示在分開(kāi)的反應(yīng)容器中使用許多不同核酸內(nèi)切酶、然后斷裂產(chǎn)物合并(圖6A)和在相同反應(yīng)容器中一起使用兩種核酸內(nèi)切酶(圖6B)在時(shí)間范圍上的比較。 M是2-對(duì)數(shù)DNA梯序列和C是未消化的pUC19?！癬N_”指示其中pUC19的帶切口形式遷移。 “-L-”指示其中pUC19的線性形式遷移?！?S-”指示其中pUC19的超螺形式遷移。圖6A顯示分別使用產(chǎn)生切口酶MBP-Vvn核酸內(nèi)切酶0169S)和MBP_T7Endo I突變體的隨機(jī)雙鏈切割。8 μ g pUC19與1. 376TCA單位MBP-Vvn核酸內(nèi)切酶在480 μ 1反應(yīng)中溫育。在另一個(gè)新管中，8 μ g pUC19與5. 6單位MBP-T7 Endo I突變體在480 μ 1反應(yīng)中溫育。樣品在37 °C下溫育。在0、5、10、15、20、30、40、和60分鐘時(shí)，從每個(gè)溫育混合物中移出 30μl，且通過(guò)添加EDTA(終濃度15mM)使反應(yīng)停止。具有相同溫育時(shí)間的樣品集中在一起并加樣在對(duì)應(yīng)于溫育時(shí)間0至60分鐘的從1至8泳道的0. 8%瓊脂糖凝膠上。圖6B顯示一起使用MBP-T7Endo I突變體和MBP-Vvn核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶 (Q69S)的隨機(jī)雙鏈切割。16yg pUC與1. 376T. C. Α.單位/ μ 1的MBP-Vvn核酸內(nèi)切酶 (Q69S)和5. 6單位/ μ 1ΜΒΡ-Τ7 Endo I突變體(CB4V2)在480 μ 1反應(yīng)中溫育。樣品在 37°C下溫育。在0、5、10、15、20、30、40、和60分鐘時(shí)，從每個(gè)溫育混合物中移出60 μ 1，且通過(guò)添加EDTA(終濃度15mM)使反應(yīng)停止。樣品加樣在對(duì)應(yīng)于溫育時(shí)間0至60分鐘的從1 至8泳道的0. 8%瓊脂糖凝膠上。發(fā)現(xiàn)了 MBP-T7 Endo I突變體和產(chǎn)生切口酶MBP-Vvn核酸內(nèi)切酶0169S)對(duì)隨機(jī)DNA片段產(chǎn)生的協(xié)同作用。圖7顯示為核酸酶混合物確定合適單位比率的滴定。通過(guò)凝膠電泳確定T7 Endo I突變體對(duì)現(xiàn)有切口位點(diǎn)的特異性切割。連續(xù)2倍稀釋酶且單個(gè)單位被定義為能夠?qū)?0%底物轉(zhuǎn)換成2個(gè)片段的酶量。從最濃(泳道1)到最稀(泳道9)顯示連續(xù)稀釋。T7內(nèi)切酶突變體對(duì)現(xiàn)有切口位點(diǎn)——其在上述底物制備時(shí)由Bsal/Nt. BstNBI產(chǎn)生——的特異性切割將線性切口 2. 44Kb雙鏈DNA(dsDNA)轉(zhuǎn)化成2個(gè)片段(1. 37Kb和1. 07Kb)。因此，1單位T7 核酸內(nèi)切酶突變體被定義為用在20 μ 1反應(yīng)物中包含5單位E. coli連接酶、60μΜΝΑ0/20πιΜ Tris-HCl (pH 7. 5) UOmM MgCl2、0. 15% Triton X-100 和 50mM NaCl 的緩沖液，在 37°C下 1 個(gè)小時(shí)將90% (如在泳道5中所示)的2 μ g線性切口的2. 44kb的dsDNA轉(zhuǎn)化成2個(gè)片段 (1.37kb和1. 07kb)所需要的酶的量。泳道“M”是2-對(duì)數(shù)DNA梯序列(NEB, Ipswich, MA, #3200)。圖8顯示與包含核酸內(nèi)切酶混合物的產(chǎn)品一起運(yùn)送的數(shù)據(jù)卡片。實(shí)施方式詳述在本發(fā)明的實(shí)施方式中，提供組合物和方法，其依靠制劑中的酶混合物，產(chǎn)生具有大約均一大小——其中均一大小可根據(jù)需要而預(yù)先確定并通過(guò)例如，改變溫育時(shí)間產(chǎn)生——雙鏈DNA片段。與單獨(dú)的非特異性核酸酶切割反應(yīng)相比，酶制劑通過(guò)包括抵消-切口 (counter-nicking)活性減少dsDNA片段中非生產(chǎn)性切口的數(shù)量。抵消-切口允許產(chǎn)生確定長(zhǎng)度的突出端，其在正常解離條件下會(huì)解離，且其能修復(fù)成平端以用于隨后的操作。修復(fù)可涉及回切(chewing back) 3'突出端或者通過(guò)聚合酶的方式合成5’突出端的互補(bǔ)序列。 具有平端或者單個(gè)核酸突出端的連接物可接著與修飾的片段連接。這些片段可接著用于各種測(cè)序平臺(tái)?，F(xiàn)有技術(shù)中隨機(jī)斷裂方法產(chǎn)生突出端，但是這些是非離散大小的并至少產(chǎn)生兩個(gè)問(wèn)題。第一，因?yàn)榻怄湝囟热Q于突出端的長(zhǎng)度和堿基組成，末端的解離不均一。第二，存在超出片段解離需要的過(guò)多切口是在隨后步驟中——包括擴(kuò)增和/或者實(shí)際測(cè)序反應(yīng)—— 需要的聚合作用的阻礙。涉及模板物理一致性的測(cè)序平臺(tái)也會(huì)受到影響。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，制劑包含非特異性核酸酶和T7核酸內(nèi)切酶I或其突變體。盡管可使用對(duì)于切割A(yù)T或者GC堿基對(duì)有偏好的核酸酶，但是優(yōu)選地選擇對(duì)于GC或者AT沒(méi)有明顯偏好的核酸酶。屬于后者范疇的核酸酶的例子獲得自嗜鹽弧菌(Vvn) (GI 2625684 Wu，等人，Appl Environ Microbiol 67(1) :82-8(2001) 其它可在制劑中利用的細(xì)胞外核酸酶包括來(lái)自霍亂弧菌(Vibrio cholera) 白勺 Dns (Focareta and Manning Gene 53(1) :31-40(1987) ； ^ 自 Il @ ^；胃(Erwinia chrysanthemi)的 NucM(Moulard，等人，Mol Microbiol 8(4) :685-95(1993)；來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的 Endo I (Jekel, et al Gene 154(1) :55-59(1995)；來(lái)自嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)的 Dns 和 DnsH (Chang 等人，Gene 122(1) 175-80 (1992)和 Dodd， 等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 173(1) :41-6(1999) ；Wang，等人，Nucleic Acids Res 35: 584-94(2007)；和 Wang，等人，Nucleic Acid Res. 35 :584-594 (2007)) 這里顯示核酸酶的突變能導(dǎo)致提高的比活。例如，Vvn核酸內(nèi)切酶的Q69突變產(chǎn)生具有增強(qiáng)比活的核酸酶。具體地，實(shí)施例利用Q69S。發(fā)現(xiàn)例如當(dāng)基因與MBP的基因結(jié)合產(chǎn)生在周質(zhì)空間中積聚的融合蛋白以改進(jìn)突變體核酸內(nèi)切酶突變體回收時(shí)，在宿主細(xì)胞中容易產(chǎn)生突變體核酸酶。包含非特異性核酸的酶制劑添加T7 Endo I突變體對(duì)于具有期望性質(zhì)的片段的產(chǎn)生具有重要的有益效果。在T7 Endo I突變體存在的情況下，由于它抵消-切口的活性，通過(guò)在變性條件下產(chǎn)生不同大小片段的非特異性核酸酶產(chǎn)生的切口有效地消失。抵消-切口活性產(chǎn)生具有末端的片段，其能容易地從切口位點(diǎn)優(yōu)選地解離8個(gè)或者更少的核苷酸。酶混合物對(duì)于dsDNA的其它有益效果包括產(chǎn)生DNA片段，其具有可預(yù)知的突出端傾向(disposition)和長(zhǎng)度，其適合于修復(fù)或者移除以允許連接有時(shí)候DNA測(cè)序平臺(tái)需要的連接物。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，許多核酸酶組合在反應(yīng)混合物中，其中至少一種核酸酶是在任一條鏈上能夠在整條DNA引入隨機(jī)切口的類(lèi)型和第二種核酸酶能夠在該第一個(gè)切口的緊鄰處抵消-切口，但是在DNA雙螺旋的相對(duì)鏈上，因此，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂。分別使用源自弧菌的非特異性核酸酶和在美國(guó)
發(fā)明者管楚狄, 謝沛仲 申請(qǐng)人:新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司