專利名稱：一種用于合成磷酸肌酸鈉的生物工程方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種肌酸激酶的制備方法，并通過此酶在體外催化合成磷酸肌酸鈉。 該方法可用于磷酸肌酸鈉的大規(guī)模生產(chǎn)制備。
背景技術：
磷酸肌酸是人體自身存在的一種物質(zhì)，主要存在于心肌，骨骼肌，腦等器官和組織中。它的生理作用主要有1，它對能量物質(zhì)ATP起到緩沖作用，上述器官和組織在生命活動過程中所消耗的大量ATP由它來補充，以避免ATP供應的波動；2，它是能量物質(zhì)ATP分子中高能磷酸基團傳遞的載體，線粒體所生成ATP分子的高能磷酸基團在細胞漿中向耗能部位傳遞就是以胞漿中的磷酸肌酸為載體，并通過胞漿中磷酸肌酸一肌酸激酶系統(tǒng)來實現(xiàn)的。各種藥理實驗證明磷酸肌酸作為細胞中的ATP這種能量物質(zhì)的轉(zhuǎn)移載體，可以起到改善缺血缺氧心肌的細胞代謝，抑制血小板凝聚，抑制凝血甘油的積累，穩(wěn)定細胞膜的作用。能減輕再灌注引起的過氧化物損傷，改善微循環(huán)，增加主動脈及冠狀動脈的血流量。由于磷酸肌酸具有廣泛的生理活性，前蘇聯(lián)，意大利等國家在1987年就作了大量研究，將磷酸肌酸鈉作為心肌保護劑首先應用于心臟外科手術中，配制在心麻溶液中使用。 結果顯示用藥組血流動力很快恢復，纖顫率減少，竇性心率也很快恢復，對缺血缺氧的心肌細胞膜有良好的保護作用。磷酸肌酸鈉在心肌梗塞疾病治療中同樣有著顯著的效果，臨床研究證明磷酸肌酸鈉對于心肌梗塞患者的心室早搏次數(shù)和心動過速有明顯的改善效果，可以作為心肌梗塞患者的重要資料藥物。另外，磷酸肌酸鈉對治療心肌缺血、缺氧引起的心力衰竭、心肌炎、冠心病等疾病也有著很好的療效。果糖二磷酸是用于心絞痛、心衰、心肌梗塞的輔助治療藥物，在臨床治療中適用癥較廣，磷酸肌酸鈉作為一種新型產(chǎn)品，較之果糖二磷酸鈉具有許多優(yōu)勢首先，磷酸肌酸鈉的供能方式是直接供能，而且能夠穿透細胞膜，相比較果糖二磷酸鈉其效率有著顯著的提高，其能值為果糖二磷酸的三倍；其次，由于磷酸肌酸鈉為人體內(nèi)源性物質(zhì)，故在用藥安全性上磷酸肌酸鈉無使用禁忌和不良反應，無配伍禁忌，可以和其他藥物混合使用，對于孕婦和兒童無禁忌，比果糖二磷酸鈉有更廣的使用范圍。目前磷酸肌酸的制備有化學合成和生物酶法合成兩種方法?；瘜W合成法以肌酸和三氯氧磷為原料采用一步成鹽工藝和多步鹽型轉(zhuǎn)換工藝。其合成反應劇烈升溫，副反應較多，工藝控制比較困難。工藝總回收率不足20%，能耗和成本較高并有大量廢水排放。酶法合成具有反應條件溫和，反應速度快和專一性強等優(yōu)點，但由于生產(chǎn)用酶采用生化提取難以規(guī)?；苽洹⒌孜飪r格昂貴等原因一直沒有得到產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種合成磷酸肌酸鈉的方法，旨在解決化學合成和生物提取酶法合成的缺陷。為了解決上述問題，本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)用基因工程方法重組構建含有編碼肌酸激酶核苷酸序列的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)，并分離純化，得到高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到磷酸肌酸。本項目采用重組肌酸激酶，解決了酶源保障的問題，保留了酶促合成法的優(yōu)點，明顯提高了反應和純化過程的可控性。生物催化法工藝成本比化學合成法低；少量污水沒有生物毒性，經(jīng)簡單的生物處理就可以達到排放標準?？傊锎呋üに囋诠?jié)能、降耗、減排的工業(yè)發(fā)展方向上取得顯著效果，有望成為磷酸肌酸鈉主流生產(chǎn)工藝。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
具體實施例方式實施例1采用常規(guī)方法提取人腦樣品RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得人腦cDNA。以權利說明6中所述引物為引物，采用PCR方法從人腦cDNA中釣取CKBB基因。具體PCR條件為95°C，5min;
權利要求
1.一種用于合成磷酸肌酸鈉的生物工程方法，其特征在于用基因工程方法重組構建含有編碼肌酸激酶核苷酸序列的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)，并分離純化，得到高純度、高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到磷酸肌酸鈉。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物工程方法，其特征在于所述大腸桿菌工程菌株是含有編碼肌酸激酶核苷酸序列的工程菌株，該肌酸激酶的核苷酸序列來源于人，該工程菌株已于2010年12月8日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物保藏中心，保藏號為CGMCC4427。
3.根據(jù)權利要求1所述的生物工程方法，其特征在于所述大腸桿菌工程菌株中包含一種含有肌酸激酶基因序列的原核表達載體 pET28a-CKBB。
4.根據(jù)權利要求3所述的生物工程方法，其特征在于所述的該原核表達載體pET28a-CKBB中含有編碼人源肌酸激酶蛋白的一段基因序列 (SEQl)。
5.根據(jù)權利要求4中所述的生物工程方法，其特征在于所述基因序列(SEQl)，其序列信息見說明書。
6.一對引物(primerl and primer2)，用于擴增權利要求5中所述基因序列。
7.根據(jù)權利要求1所述的生物工程方法，其特征在于所述的高活性的肌酸激酶，是通過權利要求書1和2中所述的工程菌株在改良的培養(yǎng)基中進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)，并分離和純化得到高活性高純度的肌酸激酶。
8.根據(jù)權利要求7所述的生物工程方法，其特征在于所述的改良的培養(yǎng)基包括胰蛋白胨5-15g/L，酵母抽提物5-15g/L，K2HPO4 3H20 10-30g/L, NaH2PO4 2H20 5_20g/L，消泡劑0. 05%-0. 2%，并在接種前加入卡那霉素至最終濃度20-100mg/L，無菌MgSO4至終濃度0. 5-1. 5g/L，無菌葡萄糖至終濃度2_10g/L，pH值調(diào)節(jié)至 6. 0-7. 0。
9.根據(jù)權利要求7所述的生物工程方法，其特征在于所述高密度培養(yǎng)的方法包括以下步驟在發(fā)酵罐中進行補料分批高密度發(fā)酵，將PH值控制在6. 0-7.0、溫度控制在 250C _37°C、用于菌體富集的培養(yǎng)時間控制在2-8小時、IPTG誘導的工作濃度控制在 0. 05-lmM，并將誘導時間控制在10-30小時。
10.根據(jù)權利要求1所述的生物工程方法，其特征在于所述酶法催化合成的方法包括以下步驟以肌酸、三磷酸腺苷(ATP)為原料，添加鎂離子和肌酸激酶，以甘氨酸和氫氧化鈉緩沖對作為緩沖體系，在一定PH值、溫度和時間范圍內(nèi)進行反應。
11.根據(jù)權利要求10所述的生物工程方法，其特征在于所述酶法催化合成的方法包括以下步驟反應液中ATP濃度控制在10-50mM，肌酸濃度控制在ATP濃度的2_5倍，氯化鎂濃度控制在10-50mM，甘氨酸濃度控制在10-50mM，肌酸激酶的加入量控制在10_200mg/L，pH值控制在8. 5-10. 5，反應溫度控制在20°C _50°C，反應時間控制在1_5小時。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于合成磷酸肌酸鈉的生物工程方法，該方法包括以下步驟用基因工程方法重組構建含有肌酸激酶的大腸桿菌工程菌株；利用該工程菌株進行大規(guī)模高密度培養(yǎng)并分離純化，得到高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合適的條件下進行酶法催化合成，得到磷酸肌酸。該方法具有底物利用率高、產(chǎn)物回收率高、反應條件溫和、反應時間短、對環(huán)境污染小、成本低等優(yōu)點，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/11GK102533880SQ20101061755
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權日2010年12月31日
發(fā)明者馮俊杰, 王永宏, 王琳, 鄭春楊 申請人:北京百川飛虹生物科技有限公司