專(zhuān)利名稱(chēng)：一種3′-唾液酸乳糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種唾液酸乳糖的制備方法，具體涉及一種3’ -唾液酸乳糖的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，糖生物學(xué)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的熱點(diǎn)。在眾多糖類(lèi)物質(zhì)中，唾液酸糖質(zhì)原料成為最受關(guān)注的板塊之一。唾液酸一般位于機(jī)體內(nèi)糖鏈部分的末端，這一位置通常是發(fā)生生理學(xué)反應(yīng)的敏感端和生命信息傳遞的第一接觸位點(diǎn)，具有舉足輕重的地位?，F(xiàn)階段研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)唾液酸與機(jī)體內(nèi)眾多的生理和病理發(fā)生有極大的關(guān)聯(lián)性，由此生命科學(xué)衍生出了以揭示唾液酸類(lèi)物質(zhì)的生物學(xué)功能為目標(biāo)的新的研究領(lǐng)域“唾液酸生物學(xué)”(sialobiology)。生物體內(nèi)的唾液酸大都不是以游離狀態(tài)存在的，多數(shù)情況下唾液酸與其他糖類(lèi)、多肽或者酯類(lèi)連接在一起形成復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮生理功能，如唾液酸化乳糖 (Sialylactose)、唾液酸化神經(jīng)節(jié)苷酯(GMl)等。人乳中含有80多種寡糖，其中含有唾液酸的寡糖大概有40種，包括3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖、唾液酸乳-N-四糖等，而牛乳中含唾液酸寡糖含量較少，且沒(méi)有3'-唾液酸乳糖。這些唾液酸寡糖除了提供給嬰兒營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還具有抗感染、促進(jìn)大腦發(fā)育和增強(qiáng)嬰兒免疫力等功效，而且研究證明3'-唾液酸乳糖在抗病毒和感染方面的作用比6'-唾液酸乳糖強(qiáng)。關(guān)于唾液酸單體在人體內(nèi)的功能與作用存在很大爭(zhēng)議。研究表明，唾液酸單體進(jìn)入機(jī)體后降解成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺，并進(jìn)一步被機(jī)體當(dāng)作能源物質(zhì)吸收。因此唾液酸單體無(wú)法直接參與機(jī)體內(nèi)大分子乳神經(jīng)粘附分子、糖蛋白、糖脂等的合成。在另外一項(xiàng)對(duì)比人乳喂養(yǎng)與牛乳喂養(yǎng)的嬰兒發(fā)育比較研究中發(fā)現(xiàn)，人乳喂養(yǎng)嬰兒的大腦的發(fā)育較好。此外，還有研究表明，唾液酸乳糖能夠提供嬰兒對(duì)細(xì)菌和病毒的抵抗能力。由于人乳唾液酸比牛乳唾液酸含量高，這激起了奶粉生產(chǎn)廠家對(duì)開(kāi)發(fā)模擬人乳的產(chǎn)品研發(fā)。目前，眾多廠商紛紛在自己生產(chǎn)的嬰兒奶粉中主要添加富含唾液酸寡糖的乳清粉、乳清提取物或蛋黃提取物。但是，這些外源添加物質(zhì)中唾液酸寡糖成份及含量與人乳相差較大，還無(wú)法滿足模擬人乳的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種唾液酸乳糖的制備方法，為嬰兒奶粉添加更為有效的唾液酸類(lèi)營(yíng)養(yǎng)因子提供保障。本發(fā)明的技術(shù)方案一種產(chǎn)3'-唾液酸乳糖的菌株，分類(lèi)命名為大腸桿菌 {Escherichia co7i)K235 WXJYL-11，已經(jīng)在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行專(zhuān)利保藏，保藏編號(hào) CCTCC NO :M208088。用所述菌株發(fā)酵制備3'-唾液酸乳糖的方法，工藝為
(1)高密度培養(yǎng)以大腸桿菌CCTCC NO :M208088為菌種，在發(fā)酵罐中添加發(fā)酵培養(yǎng)基，
3接種量為4%，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程維持溫度30-37°C，通氣量1-1. 5 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為600-800 r/ min ；在發(fā)酵過(guò)程中流加氨水控制pH為6-7，發(fā)酵周期為32-48小時(shí)；發(fā)酵2_6小時(shí)后開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，直至發(fā)酵結(jié)束前半小時(shí)停止添加，添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的體積數(shù)與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積數(shù)相當(dāng)，以均速加入發(fā)酵體系內(nèi)。發(fā)酵培養(yǎng)基成分g/L:山梨醇30，乳糖20，硫酸銨2. 5，三水合磷酸氫二鉀2.5， MgSO4 0.9，胰蛋白胨 1.5。補(bǔ)料培養(yǎng)基成分g/L 山梨醇400，硫酸銨50。(2)流加乳糖配置10_20g/L的乳糖溶液；在發(fā)酵16-20小時(shí)后，以發(fā)酵體系計(jì) 0. 5-5 g/L的恒定速率向發(fā)酵罐中流加乳糖溶液直至發(fā)酵結(jié)束前5-10小時(shí)停止流加。(3)離心除菌發(fā)酵結(jié)束后，取步驟(2)所得發(fā)酵液80°C加熱處理30分鐘，然后以 6000 rpm離心10分鐘除去菌體，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥。(4)菌體加熱裂解將步驟(3)所得菌泥加水稀釋3 5倍，沸水浴加熱45-60分鐘，然后以IOOOOrpm離心10分鐘除去細(xì)胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2。(5)離子交換樹(shù)脂吸附和脫吸將步驟(3)所得上清液1和步驟(4)所得上清液 2合并，加熱至80-90°C，恒溫加熱15分鐘；用截留分子量IOOODa的膜進(jìn)行超濾，收集濾出液；用截留分子量500Da超濾膜處理濾出液，收集處理后的截留液；將截留液通入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，用水洗脫，把培養(yǎng)基中的乳糖和產(chǎn)物3'-唾液酸乳糖分開(kāi)，收集富含3'-唾液酸乳糖的洗脫液。(6)真空干燥將步驟(5)所得洗脫液進(jìn)行真空濃縮，然后再進(jìn)行噴霧干燥，即獲得產(chǎn)品3'-唾液酸乳糖。步驟(5)所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為Diaion UBK 530，即酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯Na型或K型樹(shù)脂。所述3 ‘-唾液酸乳糖結(jié)構(gòu)如下所示
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)3'-唾液酸乳糖的菌株，分類(lèi)命名為大腸桿菌(fecAericAia co7i)K235 WXJYL-11,已經(jīng)在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行專(zhuān)利保藏，保藏編號(hào)CCTCC NO :M208088。
2.用權(quán)利要求1所述菌株發(fā)酵制備3'-唾液酸乳糖的方法，其特征在于工藝為(1)高密度培養(yǎng)以大腸桿菌CCTCCN0:M208088為出發(fā)菌種，在發(fā)酵罐中添加發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為4%，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程維持溫度30-37 °C，通氣量1-1. 5 vvm,攪拌轉(zhuǎn)速為 600-800 r/min ；在發(fā)酵過(guò)程中流加堿液氨水控制pH為6_7，發(fā)酵周期為32-48小時(shí)；發(fā)酵 2-6小時(shí)后開(kāi)始添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，直至發(fā)酵結(jié)束前半小時(shí)停止添加，添加補(bǔ)料培養(yǎng)基的體積數(shù)與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積數(shù)相當(dāng)，以均速加入發(fā)酵體系內(nèi)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分g/L 山梨醇30，乳糖20，硫酸銨2. 5，三水合磷酸氫二鉀2. 5，MgSO4 0.9，胰蛋白胨1.5 ；補(bǔ)料培養(yǎng)基成分g/L 山梨醇400，硫酸銨50 ；(2)流加乳糖配置10-20g/L的乳糖溶液；在發(fā)酵16-20小時(shí)后，以發(fā)酵體系計(jì)0.5-5 g/L的恒定速率向發(fā)酵罐中流加乳糖溶液直至發(fā)酵結(jié)束前5-10小時(shí)停止流加；(3)離心除菌發(fā)酵結(jié)束后，取步驟(2)所得發(fā)酵液80°C加熱處理30分鐘，然后以6000 rpm離心10分鐘除去菌體，得到含有唾液酸乳糖的上清液1和菌泥；(4)菌體加熱裂解將步驟(3)所得菌泥加水稀釋3 5倍，沸水浴加熱45-60分鐘，然后以IOOOOrpm離心10分鐘除去細(xì)胞碎片，得到含有唾液酸乳糖的上清液2 ；(5)離子交換樹(shù)脂吸附和脫吸將步驟(3)所得上清液1和步驟(4)所得上清液2合并，加熱至80-90°C，恒溫加熱15分鐘；用截留分子量IOOODa的膜進(jìn)行超濾，收集濾出液； 用截留分子量500Da超濾膜處理濾出液，收集處理后的截留液；將截留液通入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，用水洗脫，把培養(yǎng)基中的乳糖和產(chǎn)物3'-唾液酸乳糖分開(kāi)，收集富含3'-唾液酸乳糖的洗脫液；(6)真空干燥將步驟(5)所得洗脫液進(jìn)行真空濃縮，然后再進(jìn)行噴霧干燥，即獲得產(chǎn)品3'-唾液酸乳糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述3'-唾液酸乳糖的制備方法，其特征在于步驟(5)所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為Diaion UBK 530，即酸磺化聚苯乙烯-二乙烯基苯Na型或K型樹(shù)脂。
全文摘要
一種3′-唾液酸乳糖的制備方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以大腸桿菌CCTCC NOM208088為出發(fā)菌種，在發(fā)酵罐中添加發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵2-6小時(shí)后添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，發(fā)酵中后期流加乳糖；將所得發(fā)酵液離心得上清液1和菌體，將離心后菌體加水稀釋并加熱裂解，再次離心得上清液2，然后將所得上清液1和上清液2合并，通過(guò)離子交換樹(shù)脂吸附和脫吸、真空干燥得到產(chǎn)品3′-唾液酸乳糖。本發(fā)明通過(guò)大腸桿菌CCTCC NOM208088菌株大量制備3′-唾液酸乳糖，該產(chǎn)品可改變傳統(tǒng)嬰兒奶粉中外源添加物質(zhì)中唾液酸寡糖成份偏少的現(xiàn)狀，為嬰兒奶粉添加更為有效的唾液酸類(lèi)營(yíng)養(yǎng)因子提供保障。
文檔編號(hào)C12P19/12GK102154163SQ20101061733
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者朱莉 申請(qǐng)人:朱莉