蛋白質(zhì)唾液酸化的快速和準(zhǔn)確分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于分析糖蛋白質(zhì)的唾液酸化的方法和試劑盒。糖蛋白質(zhì)樣品在三個(gè)條件下分別孵育：含β-半乳糖苷酶，含β-半乳糖苷酶+α-唾液酸酶，不含酶。酶處理后，用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC?PAD）定量測(cè)定樣品中總的半乳糖，非唾液酸化的半乳糖和在培養(yǎng)基中的外源半乳糖。所述值的測(cè)定可以推導(dǎo)出糖蛋白質(zhì)的唾液酸化的百分比。
【專利說明】蛋白質(zhì)唾液酸化的快速和準(zhǔn)確分析
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明描述的是用于分析蛋白質(zhì)唾液酸化的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]許多蛋白質(zhì)行使它們的生物學(xué)功能需要糖基化。通常，末端，“加帽”，糖基鏈的碳水化合物是唾液酸殘基。唾液酸包括一個(gè)N-和O-連接的神經(jīng)氨酸家族。N-連接的唾液酸通過將乙酰基或羥乙?；糠诌B接到神經(jīng)氨酸的氨基酸殘基而形成，分別形成N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc)。如果神經(jīng)氨酸的氨基被羥基基團(tuán)取代，這會(huì)產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-非酮糖(nonulosonic)酸(KDN)。O-連接的唾液酸是用甲基，乙?；?，乳?；?，硫酸，或磷酸基團(tuán)取代Neu5Ac，Neu5Gc,或KDN的一個(gè)或多個(gè)羥基而形成。因此，存在大量且不同種類的唾液酸。
[0003]此外，一般來說，由于這些修飾的許多生物學(xué)功能，有相當(dāng)大的興趣來分析蛋白質(zhì)唾液酸化作用。唾液酸化作用對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)和蛋白質(zhì)生物療法的功效是重要的。因此，已研發(fā)了一些分析方法用來評(píng)估糖蛋白的唾液酸含量。例如，基于抗體的測(cè)定方法可用于確定特定的碳水化合物部分。末端唾液酸殘留可以從目標(biāo)糖蛋白進(jìn)行酶分離并通過HPLC分析。然而，這些方法都有缺點(diǎn)且通常需要純的樣品或高的濃度。生物制藥行業(yè)使用的常規(guī)方法的精確度低，數(shù)據(jù)可變性高，且由于基質(zhì)干擾它們并不能應(yīng)用于復(fù)雜的培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的方法克服了這些缺點(diǎn)并提供了蛋白質(zhì)唾液酸化作用的準(zhǔn)確和可重復(fù)的定量。
[0004]總的來說，本發(fā)明所述的方法包括兩個(gè)步驟:(1)使用酶促反應(yīng)來水解來自糖蛋白的半乳糖和唾液酸殘基；和(2)使用離子交換色譜方法來分離和定量半乳糖殘基。該方法的酶促反應(yīng)部分涉及在特 異性的外-糖苷酶，β - (1-4)-半乳糖苷酶(β -半乳糖苷酶)作用下暴露的(未加帽的)末端半乳糖殘基的釋放，而末端唾液酸殘基在α -(2-3，6，8，9)唾液酸酶(α-唾液酸酶)作用下釋放。消化之前，將樣品至少分為三管。第一管，反應(yīng)Α，是背景樣品，并且僅包括酶促反應(yīng)緩沖液。第二管，反應(yīng)B，與能夠切割所有未由唾液酸加帽的半乳糖殘基的半乳糖苷酶反應(yīng)。第三管，反應(yīng)C，與唾液酸苷酶和半乳糖苷酶共同消化。唾液酸苷酶除去加帽的唾液酸并允許β_半乳糖苷酶切割所有暴露的半乳糖殘基。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAECPAD)用于測(cè)定三個(gè)樣品中存在的半乳糖的量。未加帽的半乳糖(即，反應(yīng)B)與總的半乳糖卿，反應(yīng)C)的比值用來計(jì)算半乳糖殘基的加帽百分比，同時(shí)也計(jì)量培養(yǎng)基(反應(yīng)Α)中存在的任何游離半乳糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種用于分析蛋白質(zhì)的唾液酸化的方法。
[0006]本發(fā)明也提供了一種用于測(cè)定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法，其包括:(a)制備用于分析的蛋白質(zhì)；(b)酶處理制備的蛋白質(zhì)，包括:將制備的蛋白質(zhì)分成多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，包括(i)至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品作為培養(yǎng)基樣品(反應(yīng)A) ;(ii)在至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶(反應(yīng)B); (iii)在至少另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少β-半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反應(yīng)C);并孵育多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；以及(C)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；(d)測(cè)定多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的碳水化合物含量；和&)計(jì)算蛋白質(zhì)的唾液酸化百分比。
[0007]本發(fā)明還提供了一種方法，其進(jìn)一步包括:(f)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)陽性和陰性對(duì)照；(g)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；以及(h)將多個(gè)蛋白質(zhì)樣品與多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照進(jìn)行比較。
[0008]本發(fā)明也提供了用于測(cè)定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的HPAEC-PAD色譜法的應(yīng)用，其包括:(a)制備用于分析的蛋白質(zhì)；(b)酶處理制備的蛋白質(zhì)，包括:將制備的蛋白質(zhì)分成多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，包括(i)至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品作為培養(yǎng)基樣品(反應(yīng)A) ;(ii)在至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少β_半乳糖苷酶(反應(yīng)B) ; (iii)在至少另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少β-半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反應(yīng)C);并孵育多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；以及(C)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；(d)測(cè)定多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的碳水化合物含量；以及(e)計(jì)算蛋白質(zhì)的唾液酸化百分比。
[0009]本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用，其進(jìn)一步包括:(f)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)陽性和陰性對(duì)照；(g)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；以及(h)將多個(gè)蛋白質(zhì)樣品與多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照進(jìn)行比較。
[0010]本發(fā)明還提供了一種用于測(cè)定任何蛋白質(zhì)的唾液酸含量的試劑盒，其包括:包括含有預(yù)定量的半乳糖苷酶和唾液酸酶的多個(gè)容器的至少一個(gè)容器；任選地，容器含有至少一種緩沖液組合物，一種陽性對(duì)照樣品，一種陰性對(duì)照樣品，和碳水化合物標(biāo)準(zhǔn)品，以及記載了用于測(cè)定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法的說明書，包括如下記載:(a)制備用于分析的蛋白質(zhì)；(b)酶處理制備的蛋白質(zhì)，包括:將制備的蛋白質(zhì)分成多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，包括(i)至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品作為培養(yǎng)基樣品(反應(yīng)A);(ii)在至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少β -半乳糖苷酶(反應(yīng)B) ； (iii)在至少另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少β -半乳糖苷酶和α -唾液酸酶(反應(yīng)C);并孵育多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；以及(C)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；(d)測(cè)定多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的碳水化合物含量；以及(e)計(jì)算蛋白質(zhì)的唾液酸化百分比。`
[0011]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其進(jìn)一步包括:(f)利用HPAEC-PAD色譜法分析陽性和陰性對(duì)照；(g)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；以及(h)將多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的結(jié)果與多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果進(jìn)行比較。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為反應(yīng)A，B和C的示意圖，及每個(gè)相應(yīng)的反應(yīng)得到的數(shù)據(jù)。唾液酸化加帽百分比可以分別由反應(yīng)C和B的差值與反應(yīng)C和A的差值的商確定。見公式I。
[0013]圖2為在反應(yīng)C中消化的recAlpha-Ι樣品的典型的色譜圖。半乳糖洗脫時(shí)間的范圍為約14到16分鐘。
[0014]圖3為用去離子水透析或者經(jīng)IOkDa旋轉(zhuǎn)過濾器離心的上游recAlpha_l樣品的色譜圖比較。雜質(zhì)殘留在透析的樣品中，但幾乎完全被IOkDa旋轉(zhuǎn)過濾器去除。
[0015]圖4表明recAlpha-Ι培養(yǎng)基中的上游賦形劑可以被檢測(cè)到并且可以在半乳糖峰的附近共同洗脫。在A圖中，在旋轉(zhuǎn)過濾器純化后的一些樣品中顯示出賦形劑峰在半乳糖峰旁邊洗脫。對(duì)于反應(yīng)B的樣品，雜質(zhì)峰是從半乳糖峰去除的基線且是不完整的。在B圖中，為雜質(zhì)峰與反應(yīng)C的樣品共同洗脫的過程。在這種情況下，雜質(zhì)峰如上所示必須被分割以將其從整合入半乳糖峰的面積中排除。
[0016]圖5為通過分析從糖蛋白衍生的中性單糖和氨基單糖的混合物來確認(rèn)方法特異性。
[0017]圖6為一種典型的半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的例子。
【具體實(shí)施方式】
[0018]可以使用本發(fā)明所述方法進(jìn)行分析的蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是α 1-蛋白酶抑制劑(也稱為α 1-抗胰蛋白酶)。α 1-蛋白酶抑制劑是保護(hù)細(xì)胞免受蛋白酶參與的凝血和炎癥的天然存在的絲氨酸蛋白酶抑制劑糖蛋白。缺乏α-l蛋白酶抑制劑，α 1-抗胰蛋白酶缺乏，導(dǎo)致呼吸紊亂例如肺氣腫和慢性阻塞性肺疾病(C0PD)。因此，可以使用α-1蛋白酶抑制劑作為一種生物治療來治療α -1蛋白酶抑制劑缺乏相關(guān)的疾病。重組α -1蛋白酶抑制劑(recAlpha-Ι)是由含有部分或完全由末端唾液酸(N-乙酰氨基酸)加帽的N-連接糖基碳水化合物結(jié)構(gòu)的PerC6細(xì)胞系分泌的。末端唾液酸的量的減少已證明recAlpha-Ι的血清半衰期的減少。因此，在研究recAlpha-Ι作為治療藥物的功能或功效時(shí)，確定在recAlpha-1中由唾液酸加帽的半乳糖殘基的百分比顯得尤為重要。
[0019]實(shí)施例
[0020]實(shí)施例1:用于分析的樣品的制備及酶消化
[0021]本實(shí)施例提供了一種用于測(cè)定糖蛋白的唾液酸含量的方法。該方法開始于用于碳水化合物部分的酶水解的蛋白質(zhì)樣品的制備。因此，該蛋白質(zhì)必須被帶入與酶促反應(yīng)相容的條件中，包括調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，除去溶液組分例如溶解的鹽類，緩沖液，其它蛋白質(zhì)，糖類，賦形劑，等等，這些可能·會(huì)干擾酶。如本發(fā)明用到的，術(shù)語“制備”或短語“制備用于分析的蛋白質(zhì)”描述了去除可能干擾酶水解的溶液組分和用去離子水稀釋蛋白溶液至試驗(yàn)最佳濃度的過程。
[0022]至少有兩種非限制性的典型方法可以用于制備來自用于分析的蛋白質(zhì)的蛋白溶液成分:(1)用去離子水透析或者(2)離心過濾(也稱為旋轉(zhuǎn)過濾)。在這兩種情況下，特定截留分子量(MWCO)的半透膜被用來除去低分子量物質(zhì)同時(shí)保留目標(biāo)蛋白分析物。有用的截留分子量范圍包括 lkDa，2.5kDa，5kDa，10kDa，20kDa，50kDa，100kDa，250kDa，和 500kDa。在透析過程中，蛋白質(zhì)被插入到透析膜中并在4°C下用過量的去離子水或合適的緩沖液和/或鹽溶液透析至少4小時(shí)。
[0023]可替換地，除了透析，蛋白質(zhì)樣品可以通過離心過濾來制備以用于酶消化。在離心過濾時(shí)，用特定MWCO的半透膜將蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行離心分離。分子量低于MWCO的溶液組分在離心過程中通過過濾器，而蛋白和較高分子量的物質(zhì)被保留。通常情況下，由于水穿過半透膜，蛋白溶液在旋轉(zhuǎn)過濾時(shí)得到濃縮。一般來說，作為一個(gè)非限制性的例子，在制備蛋白質(zhì)樣品時(shí)按照制造商的說明使用一個(gè)IOkDa的旋轉(zhuǎn)過濾器。
[0024]在酶消化前，用去離子水將蛋白質(zhì)樣品稀釋至1.0-1.5mg/ml的濃度，使得它們?cè)谠囼?yàn)的線性范圍內(nèi)。一旦樣品被稀釋，就確定了用于每個(gè)條件的至少一種反應(yīng)(即，A、B、和C)。將制備的蛋白質(zhì)溶液分成至少三個(gè)樣品來進(jìn)行酶促脫糖基化。參見圖1。反應(yīng)A是背景對(duì)照(對(duì)照外源性半乳糖)。該反應(yīng)僅由酶促反應(yīng)的緩沖液組成，并作為可能存在于包含蛋白質(zhì)分析物的培養(yǎng)基中的碳水化合物的對(duì)照。反應(yīng)B包含的β-半乳糖苷酶，水解非唾液酸化的碳水化合物基團(tuán)，但不能水解那些被唾液酸基團(tuán)“加帽”的碳水化合物基團(tuán)。反應(yīng)C同時(shí)含有α-唾液酸酶和β-半乳糖苷酶。在該反應(yīng)中，α-唾液酸酶水解加帽的唾液酸部分，然后允許半乳糖苷酶水解所有的碳水化合物基團(tuán)。在這個(gè)結(jié)合了 α-唾液酸酶和β -半乳糖苷酶的反應(yīng)中，所有的糖基化(即唾液酸化和未唾液酸化的)從蛋白質(zhì)中除去，而在半乳糖苷酶反應(yīng)中，只有未加帽(未唾液酸化的)碳水化合物基團(tuán)被除去。3個(gè)反應(yīng)條件的組分如表1所示。
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種用于測(cè)定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法，其特征在于，該方法包括: (a)制備用于分析的蛋白質(zhì)； (b)酶處理制備的蛋白質(zhì)，包括:將制備的蛋白質(zhì)分成多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，包括 (i)至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品作為培養(yǎng)基樣品(反應(yīng)A)； (ii)在至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶(反應(yīng)B)； (iii)在至少另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反應(yīng)C);并孵育多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；以及 (c)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)蛋白質(zhì)樣品； Cd)測(cè)定多個(gè)蛋白 質(zhì)樣品的碳水化合物含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，進(jìn)一步包括: Cf)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)陽性和陰性對(duì)照； (g)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；以及 (h)將多個(gè)蛋白質(zhì)樣品與多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照進(jìn)行比較。
3.用于測(cè)定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的HPAEC-PAD色譜法的應(yīng)用，其特征在于，包括: (a)制備用于分析的蛋白質(zhì)； (b)酶處理制備的蛋白質(zhì)，包括:將制備的蛋白質(zhì)分成多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，包括 (i)至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品作為培養(yǎng)基樣品(反應(yīng)A)； (ii)在至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶(反應(yīng)B)； (iii)在至少另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反應(yīng)C);并孵育多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；以及 (c)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)蛋白質(zhì)樣品； (d)測(cè)定多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的碳水化合物含量；以及 Ce)計(jì)算蛋白質(zhì)的唾液酸化百分比。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，進(jìn)一步包括: Cf)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)陽性和陰性對(duì)照； (g)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；以及 (h)將多個(gè)蛋白質(zhì)樣品與多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照進(jìn)行比較。
5.一種用于測(cè)定任何蛋白質(zhì)的唾液酸含量的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: 包括含有預(yù)定量的半乳糖苷酶和唾液酸酶的多個(gè)容器的至少一個(gè)容器； 任選地，容器含有至少一種緩沖液組合物，一種陽性對(duì)照樣品，一種陰性對(duì)照樣品，和碳水化合物標(biāo)準(zhǔn)品，以及 記載了用于測(cè)定蛋白質(zhì)的唾液酸含量的方法的說明書，包括如下記載: (a)制備用于分析的蛋白質(zhì)； (b)酶處理制備的蛋白質(zhì)，包括:將制備的蛋白質(zhì)分成多個(gè)蛋白質(zhì)樣品，包括 (i)至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品作為培養(yǎng)基樣品(反應(yīng)A)； (ii)在至少一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶(反應(yīng)B)； (iii)在至少另一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中加入至少半乳糖苷酶和α-唾液酸酶(反應(yīng)C);并孵育多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；以及 (c)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)蛋白質(zhì)樣品；(d)測(cè)定多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的碳水化合物含量；以及Ce)計(jì)算蛋白質(zhì)的唾液酸化百分比。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中，進(jìn)一步包括:Cf)利用HPAEC-PAD色譜法分析陽性和陰性對(duì)照；(g)利用HPAEC-PAD色譜法分析多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品；以及(h)將多個(gè)蛋白質(zhì)樣品的結(jié) 果與多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果進(jìn)行比較。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103635590SQ201280033128
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月14日
【發(fā)明者】王子豪, J·斯隆, K·維 申請(qǐng)人:基立福有限公司