專利名稱：包含泛素或泛素樣蛋白、膜易位序列和生物活性分子的融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本公開涉及包含泛素或泛素樣蛋白、與所述泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的 膜易位序列、和與所述膜易位序列的C-末端連接的生物活性分子的跨膜融合蛋白，編碼所 述跨膜融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸序列的重組表達載體，由所述重組表達載 體轉(zhuǎn)化的細胞，和使用所述跨膜融合蛋白將所述生物活性分子遞送至細胞中的方法。
背景技術(shù)：
由于報道了多種疾病是由細胞中蛋白質(zhì)的異?；钚运鶎е碌模砸呀?jīng)嘗試開發(fā) 通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的異?；钚詠碇委熂膊〉乃幬?。具體而言，已基于可特異性調(diào)節(jié)生物活性 的酶-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用對肽、多肽和蛋白質(zhì)藥物進行了研究。即使肽、多 肽和蛋白質(zhì)具有卓越的生物學選擇性和效果，它們由于其大小和多種生化性質(zhì)也難以穿透 細胞膜。由于肽、多肽和蛋白質(zhì)無法直接遞送至細胞中，因此它們作為有效藥物的實際使用 具有局限性。已進行了多種嘗試將肽、多肽或蛋白質(zhì)遞送至細胞中。最近，已使用跨膜肽將肽、 多肽或蛋白質(zhì)遞送至細胞中。自從在1988年報道了在與培養(yǎng)基一起使用時HIV-I的Tat 蛋白主動轉(zhuǎn)運至細胞中以來，已對蛋白質(zhì)的細胞穿透機制進行了研究。從那時起，已對穿透 細胞膜的多種肽，例如，果蠅的Antp蛋白中存在的信號序列(跨膜序列)或胞質(zhì)穿透序列、 單純皰疹病毒(HSV)的VP22蛋白、和成纖維細胞生長因子(FGF)進行了各種研究。根據(jù)最近的研究，膜易位序列(MTQ直接穿透細胞膜而不用受體/轉(zhuǎn)運體，然而其 它細胞穿透肽(CPP)需要使用受體/轉(zhuǎn)運體來遞送。因此，MTS不依賴于受體/轉(zhuǎn)運體的 表達。另外，由于MTS獨立于胞吞作用地轉(zhuǎn)移，MTS更有效地轉(zhuǎn)移至細胞中。MTS可在細胞 間遷移，盡管其它CPP無法以相同的方式遷移。由于這些特征，膜易位序列正在吸引大量的 關(guān)注。然而，因為它的疏水性，難以在動物試驗中應用MTS。例如，如果在重組細胞中表達 包含MTS的融合蛋白，那么所述包含MTS的融合蛋白作為具有差的穩(wěn)定性的異源形式的包 含體獲得。此外，難以從所述包含體得到活性融合蛋白。因此，仍然需要開發(fā)穩(wěn)定轉(zhuǎn)移至細胞中的包含MTS的融合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
提供包含泛素或泛素樣蛋白、與所述泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的膜易位 序列、和與所述膜易位序列的C-末端連接的生物活性分子的跨膜融合蛋白，編碼所述跨膜 融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸序列的重組表達載體，由所述重組表達載體轉(zhuǎn)化 的細胞，和使用所述跨膜融合蛋白將所述生物活性分子遞送至細胞中的方法。在實施方案中，使用所述跨膜融合蛋白將所述生物活性分子遞送至細胞中的方法 包括將所述跨膜融合蛋白與細胞接觸。
還公開了產(chǎn)生所述跨膜融合蛋白的方法。在實施方案中，所述方法包括在容許所 述跨膜融合蛋白表達的條件下培養(yǎng)由編碼所述跨膜融合蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞； 和從宿主細胞培養(yǎng)物回收所述跨膜融合蛋白。另外的方面將在以下的說明書中部分地闡述，從所述說明書中部分地明晰，或者 可以通過所示實施方案的實踐而知悉。


從結(jié)合附圖考慮的實施方案的以下描述，這些方面和/或其它方面將變得明晰且 更易于理解，在附圖中圖1是說明根據(jù)本發(fā)明實施方案的融合蛋白轉(zhuǎn)移至細胞中和/或細胞核中的示意 圖；圖2A至圖2C顯示的是顯現(xiàn)在小鼠細胞中本發(fā)明實施方案的融合蛋白或?qū)φ盏捏w 內(nèi)分布的熒光顯微圖像，所述小鼠細胞是在將所述融合蛋白或?qū)φ崭鼓?nèi)注射至小鼠中之 后分離的；和圖3是顯示腫瘤體積作為根據(jù)本發(fā)明實施方案的融合蛋白或?qū)φ杖诤系鞍字兴?含p53-pl8的注射時間的函數(shù)的圖。
具體實施例方式現(xiàn)將詳細提及實施方案，其實例在附圖中說明，其中相同的附圖標記始終表示相 同的要素。在這點上，當前的實施方案可具有不同的形式，并且不應理解為局限于本文所作 的描述。因此，以下僅通過參照附圖描述實施方案以解釋本說明書的各方面。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，跨膜融合蛋白包含泛素或泛素樣蛋白；與所述泛素或 泛素樣蛋白的C-末端連接的膜易位序列；和與所述膜易位序列的C-末端連接的生物活性 分子。本文使用的術(shù)語“跨膜融合蛋白”指具有在體外和/或體內(nèi)將生物活性分子遞送 到細胞或細胞核中的能力的融合蛋白。此外，“膜易位序列(MTS) ”是具有可穿透細胞膜的磷 脂雙層的氨基酸序列的多肽。MTS在N-末端具有單一疏水區(qū)，并且由相對少的氨基酸(7-17 個氨基酸)以柔性螺旋結(jié)構(gòu)形成。由此，MTS具有疏水性。如本文所用的術(shù)語“連接”意指兩個或更多個生物分子連接，使得至少保留與所述 生物分子有關(guān)的生物學功能、活性和/或結(jié)構(gòu)的一些。對于多肽，該術(shù)語意指兩個或更多個 多肽的連接產(chǎn)生融合多肽，該融合多肽至少保留每個多肽成分各自單獨的活性的一些。所 述兩個或更多個多肽可直接連接或藉由接頭連接。泛素( )是存在于所有真核細胞中的高度保守的蛋白質(zhì)，其包括76個氨基酸。泛 素在如昆蟲、鱒魚和人一樣不同的物種之間顯示出完美的同源性。另外，泛素相對于PH變 化是穩(wěn)定的，在高溫下不易變性，并且相對于蛋白酶是穩(wěn)定的。因此，如果將泛素與MTS融 合，那么可以降低MTS的水不溶性。泛素樣蛋白(WdL)是具有類似于泛素的性質(zhì)的蛋白質(zhì)。泛素樣蛋白的實例包括 Ne dd8、SUMO-1、SUM0-2、NUB1、PIC1、UBL3、UBL5 禾Π ISG15。所述跨膜融合蛋白中的泛素或泛素樣蛋白可選自野生型泛素、野生型泛素樣蛋白、突變體泛素和突變體泛素樣蛋白。突變體泛素通過將野生型泛素的氨基酸序列改變成 另一氨基酸序列來獲得。例如，突變體泛素可通過用Arg替代野生型泛素的Lys或通過用 RGA殘基替代野生型泛素的C-末端的RGG殘基來制備。在通過用Arg替代野生型泛素的 Lys制備的突變體泛素中，存在于第6、第11、第27、第四、第33、第48和第63氨基酸位置 的Lys可以獨立地或以任意組合用Arg替代。所述跨膜融合蛋白中的泛素或泛素樣蛋白在C-末端具有可或不可由蛋白酶切割 的氨基酸序列。由蛋白酶切割的氨基酸序列可通過檢索本領域已知的數(shù)據(jù)庫來鑒定。例 如,在互聯(lián)網(wǎng)上可從Swiss Institute of Bioinformatics的ExPASy (專業(yè)蛋白質(zhì)分析系 統(tǒng))蛋白質(zhì)組學服務器獲得的工具P印tideCutter可以用于鑒定蛋白酶和由該蛋白酶切割 的氨基酸序列。在一些實施方案中，如果由蛋白酶識別的氨基酸序列包含在泛素或泛素樣蛋白 中，那么跨膜融合蛋白中的泛素或泛素樣蛋白在所述融合蛋白轉(zhuǎn)移至細胞中之后可由所述 細胞中存在的蛋白酶切割，使得證或^^從該融合蛋白中釋放且生物活性分子可執(zhí)行合乎 需要的功能。即使跨膜融合蛋白中的生物活性分子在通過蛋白水解切割去除泛素或泛素樣 蛋白之后仍然包括MTS，MTS也不影響生物活性分子的功能，因為MTS的多肽序列短。在一 些實施方案中，即使在不通過細胞蛋白酶從跨膜融合蛋白切下泛素或泛素樣蛋白時，生物 活性分子也可執(zhí)行合乎需要的功能?？缒と诤系鞍字械腗TS可為任何具有可穿過細胞膜的磷脂雙層的氨基酸序列的 多肽，沒有限制。例如，MTS可為具有選自SEQ ID NOS 1至15的序列的多肽?？缒と诤系鞍字械摹吧锘钚苑肿印笔且赃M入細胞內(nèi)為目標的具有所需生物活性 的多肽或蛋白質(zhì)，其可與MTS連接并轉(zhuǎn)移至細胞中?？缒と诤系鞍字械纳锘钚苑肿邮情L度為至少兩個氨基酸的肽或蛋白質(zhì)。所述多 肽可以是與細胞永生有關(guān)的蛋白質(zhì)如SV40大T抗原和端粒酶；抗凋亡蛋白如突變體p53和 BclxL ；抗體；癌基因產(chǎn)物如ras、myc、人乳頭瘤病毒E6/E7和腺病毒Ela ；細胞周期調(diào)節(jié)蛋 白如細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶；綠色熒光蛋白；或酶如β-半乳糖苷酶和 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，但不限于此?？缒と诤系鞍字邪纳锘钚苑肿涌蔀橛H水蛋白，但不限于此。另外，生物活性 分子可為激素、激素樣蛋白、酶、酶抑制劑、信號轉(zhuǎn)導蛋白或其部分、抗體或其部分、單鏈抗 體、結(jié)合蛋白或其結(jié)合域、抗原、粘著蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白、毒蛋白、細胞因子、轉(zhuǎn)錄因 子、凝血因子、疫苗等，但不限于此。例如，跨膜融合蛋白中包含的生物活性分子可為ρ53、ρ18、ρ53_ρ18、ρ21、ρ25、 ρ57、ρ16、ρ15、ΝΙΡ71、神經(jīng)調(diào)節(jié)素1、PTEN腫瘤抑制劑、ARF腫瘤抑制劑、APC、CD95、雌酮、 MENU BRCAU Von Hippel-Lindau腫瘤抑制劑、RKIP、nm23、內(nèi)皮抑制素、胰島素、胰島素樣 生長因子1 (IGF-I)、生長因子、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/ 巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、白介素-Ia和β、 白介素_3、白介素_4、白介素-6、白介素-2、表皮生長因子(EGF)、降鈣素、促腎上腺皮質(zhì) 激素(ACTH)、腫瘤壞死因子(TNF)、阿托西班、布舍瑞林、西曲瑞克、地洛瑞林、去氨加壓素、 強啡肽A(l-13)、依降鈣素、依來多辛、依替巴肽、生長激素釋放激素-II (GHRH-II)、戈那瑞 林、戈舍瑞林、組氨瑞林、亮丙瑞林、賴氨加壓素、奧曲肽、催產(chǎn)素、加壓素、胰泌素、辛卡利特、特利加壓素、胸腺噴丁、胸腺素α 1、曲普瑞林、比伐盧定、卡貝縮宮素、環(huán)孢素、艾可西定 (exedine)、蘭瑞肽、黃體生成素釋放激素(LHRH)、那法瑞林、甲狀旁腺激素、普蘭林肽、恩夫 韋地(T-20)、胸腺法新或齊考諾肽，但不限于此。當生物活性分子需要遞送至細胞核中時，跨膜融合蛋白可進一步包含核定位信號 域?！昂硕ㄎ恍盘栍?NLS) ”是能夠穿過細胞的核膜的氨基酸序列，其包含在從胞質(zhì)向 細胞核轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)中。在此，氨基酸序列不受限制，只要該序列具有NLS功能。可用作 NLS 的多肽可為 KKKRK(SEQ ID NO 26)、PKKKRKV(SEQ ID NO 27)、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:28)等，但不限于此。NLS可位于跨膜融合蛋白的選自如下的至少一個區(qū)域中泛素或泛素樣蛋白的 C-末端、MTS的C-末端、和生物活性分子的C-末端?！胺蛛x的”當用于描述本文公開的各種多肽或多核苷酸時意指已經(jīng)自其天然環(huán)境 的成分鑒定并分離和/或回收的多肽或多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和多肽以及 化學合成的多核苷酸和多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，提供用于將生物活性分子遞送至細胞的組合物。所述組 合物包含本文公開的跨膜融合蛋白；和可藥用載體。所述跨膜融合蛋白可以使得生物活性 分子以治療有效量遞送的量存在于所述組合物中。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，提供編碼跨膜融合蛋白的多核苷酸，所述跨膜融合蛋白 包含泛素或泛素樣蛋白；與所述泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的MTS ；和與所述MTS的 C-末端連接的生物活性分子。如本文所用的“多核苷酸”是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。多核苷酸 可為單鏈或雙鏈核酸。多核苷酸包括RNA基因組序列、cDNA序列、從cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA序列、 和天然多核苷酸的類似物，除非在本文另外指明。多核苷酸不僅包括編碼跨膜融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，還包括其互補 序列?；パa序列可為與所述核苷酸序列完美互補的序列或基本上互補的序列。即，互補序 列可為在本領域已知的嚴緊條件下與例如編碼跨膜融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列 雜交的序列。具體而言，嚴緊條件意指，例如，在6XSSC中在約45°C與DNA雜交，隨后在 0. 2XSSC/0. 1% SDS中在約50°C -65°C洗滌一次或多次。編碼在跨膜融合蛋白中包含的泛素或泛素樣蛋白的核苷酸序列可源自哺乳動物， 例如人。另外，編碼泛素或泛素樣蛋白的核苷酸序列可通過檢索已知的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫， 例如，National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)Entrez數(shù)據(jù)庫或European Molecular BiologyLaboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)數(shù)據(jù)庫 來獲得。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，重組載體包含編碼跨膜融合蛋白的多核苷酸和與所 述多核苷酸序列可操作地連接的啟動子，所述跨膜融合蛋白包含泛素或泛素樣蛋白；與 所述泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的MTS ；和與所述MTS的C-末端連接的生物活性分 子。本文使用的術(shù)語“可操作地連接”指核苷酸表達調(diào)控序列(例如，啟動子序列)與 另一核苷酸序列的功能性結(jié)合，并且所述核苷酸表達調(diào)控序列由此可調(diào)控所述另一核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。重組載體可為在宿主細胞中穩(wěn)定地表達跨膜融合蛋白的表達載體。所述表達載體 可為用于在植物、動物或微生物中表達外源蛋白的本領域已知的載體。重組載體可以使用 本領域已知的各種方法形成?？蓸?gòu)建重組載體供在原核或真核宿主細胞中使用。例如，如果載體是供在原核宿 主細胞中使用的表達載體，那么該載體可包含能夠使轉(zhuǎn)錄起始的啟動子，如p/啟動子、trp 啟動子、Iac啟動子、tac啟動子和T7啟動子；使翻譯起始的核糖體結(jié)合位點；和轉(zhuǎn)錄/翻 譯終止序列。當使用真核細胞作為宿主細胞時，載體可含有操作真核細胞的復制起點，例 如，fl復制起點、SV40復制起點、pMBl復制起點、腺復制起點、AAV復制起點和BBV復制起 點，但不限于此。在用于真核宿主細胞的表達載體中使用的啟動子可為源自哺乳動物細胞 基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如腺病毒 分裂后期啟動子、痘苗病毒7. 5K啟動子、SV40啟動子、巨細胞病毒啟動子或HSV的tk啟動 子)。用于真核宿主細胞的表達載體通常也可包含聚腺苷酸化序列作為轉(zhuǎn)錄終止序列。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，提供包含編碼本文公開的跨膜融合蛋白的多核苷酸序列 的宿主細胞。所述宿主細胞可為由重組載體轉(zhuǎn)化的細胞，所述重組載體包含編碼所述跨膜 融合蛋白的多核苷酸。宿主細胞可在基因組中包含編碼跨膜融合蛋白的多核苷酸，或者可包含含有所述 多核苷酸序列的重組載體，所述跨膜融合蛋白包含泛素或泛素樣蛋白；與所述泛素或泛 素樣蛋白的C-末端連接的MTS ；和與所述MTS的C-末端連接的生物活性分子?？煞€(wěn)定地且連續(xù)地克隆或表達重組載體的宿主細胞可為任何本領域已知的宿 主細胞。原核宿主細胞的實例是大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21、大腸桿菌RR1、大腸桿 菌LE392、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776、大腸桿菌W3110、芽孢桿菌屬菌種如枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtillis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的菌株、腸道細 菌禾口如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens) 或多種假單胞菌屬O^eudomonas)菌種等菌株。真核宿主細胞的實例是釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)、昆蟲細胞、植物細胞或動物細胞如中華倉鼠卵巢(CHO)、 W138、BHK、C0S-7、293、H印G2、3T3、RIN 和 MDCK 細胞系。所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的重組載體可使用本領域已知的遞送方法遞 送至宿主細胞。遞送方法可根據(jù)宿主細胞變化。如果宿主細胞是原核細胞，可使用CaCl2S 法或電穿孔方法。如果宿主細胞是真核細胞，可使用顯微注射、磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂質(zhì)體 介導的轉(zhuǎn)染或基因轟擊。然而，遞送方法不限于此。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞可使用由可選擇的標記表達的表型和本領域已知的方法來選 擇。例如，如果可選擇的標記是特定的抗生素抗性基因，那么經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞可通過將所 述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞在含有該抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來辨別。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，公開制備跨膜融合蛋白的方法。所述方法包括將包 含編碼跨膜融合蛋白的多核苷酸序列的細胞在表達該跨膜融合蛋白的條件下培養(yǎng)，所述跨 膜融合蛋白包含泛素或泛素樣蛋白、與所述泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的MTS、和與 所述MTS的C-末端連接的生物活性分子；和回收在培養(yǎng)基中表達的跨膜融合蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞的培養(yǎng)可以使用本領域已知的方法進行。例如，可將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞接種到Y(jié)T液體培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。當細胞密度達到預定水平時，可向培養(yǎng)基中加入異丙 基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以誘導通過IacZ啟動子進行的蛋白質(zhì)表達。然后，可收 集在細胞內(nèi)表達的或分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。在細胞內(nèi)表達的或分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)可使用本領域已知的純化方法分離。 例如，可以使用利用硫酸銨的溶解度分級分離、大小分級和過濾、以及各種層析分離方法 (根據(jù)大小、電荷、疏水性或親水性的分離)以獲得分離的蛋白質(zhì)。例如，如果跨膜融合蛋白 包含谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，可使用谷胱甘肽樹脂柱有效地分離所述蛋白質(zhì)。如果跨膜融 合蛋白包含6x His序列，可使用Ni2+-NTA His-結(jié)合樹脂柱來獲得所需蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供將跨膜融合蛋白遞送至細胞中的方法。
所述方法可以包括將跨膜融合蛋白與細胞接觸。將跨膜融合蛋白與細胞接觸可在體外或體內(nèi)進行。所接觸的細胞可為單獨的細 胞、組織中的細胞、器官中的細胞或個體中的細胞。將跨膜融合蛋白與細胞接觸可通過使細 胞暴露于溶解在緩沖液中的跨膜融合蛋白在體外直接進行。將跨膜融合蛋白與細胞在體內(nèi) 接觸可包括向受試者施用跨膜融合蛋白。受試者可為哺乳動物，例如人。跨膜融合蛋白的施用可為跨膜融合蛋白的胃腸外 施用至個體?？缒と诤系鞍卓蔀閱为毜幕蚺c可藥用賦形劑組合。胃腸外施用可使用靜脈內(nèi) 注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、內(nèi)胚層注射、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺部施用、直腸 施用等。由于施用的跨膜融合蛋白包含MTS，可將生物活性分子遞送至與已使用上述方法施 用的跨膜融合蛋白接觸的細胞中。將參考以下實施例更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明性目的，而非意 在限制本發(fā)明的范圍。圖1示意性地說明根據(jù)本發(fā)明實施方案的融合蛋白轉(zhuǎn)移至細胞和/或細胞核中。在示意圖中，如果由蛋白酶識別的氨基酸序列包含在泛素或泛素樣蛋白100中， 那么在將融合蛋白轉(zhuǎn)移至細胞140中之后，可通過細胞140中存在的蛋白酶切割跨膜融合 蛋白中的泛素或泛素樣蛋白酶100，使得泛素或泛素樣蛋白100從融合蛋白中釋放并且生 物活性分子130可在胞質(zhì)溶膠中執(zhí)行合乎需要的功能?；蛘?，如果融合蛋白具有NLS 110， 生物活性分子130可在細胞核150中執(zhí)行合乎需要的功能。即使跨膜融合蛋白中的生物活 性分子130在通過蛋白水解切割去除泛素或泛素樣蛋白100之后仍包括MTS 120,MTS 120 也不影響生物活性分子130的功能，因為MTS 120的多肽序列短。實施例實施例1 制備用于包含泛素、NLS、MTS和p53_pl8的跨膜融合蛋白的表達載體制備用于產(chǎn)生跨膜融合蛋白的表達載體，所述跨膜融合蛋白包含順序連接的親水 多肽泛素、NLS、MTS和生物活性多肽p53-pl8。為了產(chǎn)生跨膜融合蛋白，制備pET-NLS-kFGF4-p53表達載體，其包含編碼NLS多肽 序列KKKRK(SEQ ID NO 26)的多核苷酸序列、編碼已知的MTS序列即kFGF4生長因子的前 導序列(AAVALLPAVLLALLAP ；SEQ IDNO 1)的多核苷酸序列、和編碼p53多肽N-末端片段 (mdm2結(jié)合域)的多核苷酸序列。所述表達載體如下制備將編碼NLS-kFGF4-p53多肽的 寡核苷酸的有義鏈禾口反義鏈退火(有義鏈5' ttgaattcaaaaagaagagaaaggccgcggtagcgct gctcccggcggtcctgctggccttgctggcgcccgaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaagcttaa3 ‘ ；SEQ ID NO :16,反義鏈5' ttaagcttgttttcaggaagtagtttccataggtctgaaaatgtttc gggcgccagcaaggccagcaggaccgccgggagcagcgctaccgcggcctttctcttctttttgaattcaa3‘ ；SEQ ID N0:17)，然后用限制酶EcoRI和HindIII切割退火產(chǎn)物。將切下的片段插入使用相同限 制酶切割的載體pET22b中。然后，使用聚合酶鏈式反應(PCR)合成已知的人泛素cDNA序列的多核苷酸和已知 的人pl8(CDKN2C)cDNA序列的多核苷酸。在人泛素多核苷酸片段的PCR合成中，使用5 ‘ t tggatccggtagtggaagcatgcagattttcgtgaaa3 ‘ (SEQ IDNO ； 18)禾口 ttgaattcaccacgaagt ctcaacacaa3' (SEQ ID NO :19)分別作為正向和反向引物。該正向和反向引物各自包含供 BamHI和EcoRI用的限制位點。在人ρ 18多核苷酸片段的PCR合成中，使用5 ‘ ttaagcttatg gccgagccttgggggaacgagttgg3‘ (SEQ ID NO :20)作為正向引物，并使用 5' ttctcgagttatt gaagattttgtggctcc3' (SEQ ID NO :21)作為反向引物。該正向和反向各自包含供HindIII 和BioI用的限制位點。然后，為了改善pl8的親水性，使用5' cttagaggtgctaatcccgatttg 3' (SEQ ID NO :22)作為正向引物和 5' gtctttcaaatcgggattagcacc3‘ (SEQ ID NO 23) 作為反向引物來進行核酸序列的定點誘變，從而將第71位氨基酸苯丙氨酸(F)的密碼子用 天冬酰胺(N)的密碼子替代。將突變體命名為"pl8(F71N)"。PCR 通過本領域已知方法使用 GeneAmp PCR System 9700 (AppliedBiosystem)進 行。PCR 產(chǎn)物使用 QIAquick Multiwell PCR Purification 試劑盒(Qiagen)純化，并將各 產(chǎn)物克隆至pGEM-T fesy載體(!Iomega)中。然后，對于產(chǎn)生的各重組pGEM-T fesy載體， 用所述載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(大腸桿菌DH5 α )，其后使用QIApr印Spin Miniprep試劑盒 (Qiagen)從經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞的培養(yǎng)物分離質(zhì)粒。使用BamHI和EcoRI切割包含人泛素cDNA的pGEM_T Easy載體，并使 用HindIII和XhoI切割包含人pl8(F71N)的cDNA的pGEM-T Easy載體。然后，將 兩種片段插入pET-NLS-kFGF4-p53表達載體中。將這種最終制備的能夠表達人泛 素-NLS-MTS-p53-pl8 (F71N)融合蛋白的載體命名為 pET_Ub-NLS_kFGF4-p53-pl8 (F71N)。 插入pET載體中的人泛素-NLS-MTS-p53-pl8融合蛋白的多肽序列和編碼該多肽序列的多 核苷酸序列分別如SEQ ID NOS 25和24所示。在SEQ ID NO :24的多核苷酸序列中，第1至第2 個核苷酸編碼人泛素，第235 至第249個核苷酸編碼NLS，第250至第297個核苷酸編碼KFG4前導序列，第298至第336 個核苷酸編碼P53，和第343至第849個核苷酸編碼pl8。在如SEQ ID NO :25中所示的氨 基酸序列中各多肽的位置可從在SEQ ID NO 24的核苷酸序列中的相應位置推斷。如上所述還制備對照跨膜融合蛋白表達載體，其類似于 pET-Ub-NLS-kFGF4-p53-pl8 (F71N)載體，但在融合蛋白的NH2-末端缺乏泛素。將該對照 融合蛋白載體表示為pET-NLS-kFGF4-p53-pl8(F71N)載體，并將該對照融合蛋白表示為 NLS-kFGF4-p53-pl8(F71N)。實施例2 跨膜融合蛋白的表達和純化在用根據(jù)實施例1制備的pET-Ub-NLS-kFGF4-p53-pl8 (F71N)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿 菌BL21(DE!3)中過表達所述跨膜融合蛋白。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細菌在YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當在600nm 吸光度的光密度為0. 5時，向培養(yǎng)基加入0. 5mMIPTG,并將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)在 18°C進一步培養(yǎng)16小時。將培養(yǎng)的細胞在包含5%甘油、5πιΜβ-巰基乙醇、0.2% Triton
9X-100和0. 2MNaCl的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中進行超聲處理，然后離心以獲得上 清液(10，000Xg)。將所述上清液施加至以緩沖液平衡的Ni2+-NTA超流柱(Qiagen)，用5 倍柱體積的洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0，5%甘油，5mM β -巰基乙醇，0. 2% Triton X-100和IM NaCl)洗滌，并用洗脫緩沖液(50mMTris-HCl，pH 8.0，5%甘油，5福β-巰基乙 醇，0. 2% Triton X-100和0. 2M NaCl)洗脫。收集包含所述融合蛋白的級分，并使用Amicon Ultra-15 CentrifugalFiIter (Mi 1 ipore)去除級分中所含的鹽，然后將所述級分濃縮。使 用牛血清清蛋白(BSA)作為標準品對純化的蛋白的濃度定量。測定包含泛素的融合蛋白和不含泛素的融合蛋白(對照)的表達和純化特性。結(jié) 果示于下文表1。根據(jù)當前實施方案的包含泛素的融合蛋白顯示出高表達量、以及卓越的親 水性、產(chǎn)率、濃度和純度。表 權(quán)利要求
1.分離的跨膜融合蛋白，包含泛素或泛素樣蛋白；與所述泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的膜易位序列；和與所述膜易位序列的C-末端連接的生物活性分子。
2.權(quán)利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述泛素或泛素樣蛋白是突變體。
3.權(quán)利要求2的跨膜融合蛋白，其中所述突變體泛素用Arg替代在野生型泛素的氨基 酸序列中的Lys。
4.權(quán)利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述泛素或泛素樣蛋白具有由蛋白酶切割的蛋白 酶識別氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述泛素或泛素樣蛋白是選自如下的泛素樣蛋 白Nedd8、SUM0-1、SUM0-2、NUBl、PICl、UBL3、UBL5和 ISG15。
6.權(quán)利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述膜易位序列包含具有選自SEQIDNOS :1至15 的序列的多肽。
7.權(quán)利要求1的跨膜融合蛋白，其中所述生物活性分子選自p53、pl8(raKN2C)、 神經(jīng)調(diào)節(jié)素1、PTEN腫瘤抑制劑、ARF腫瘤抑制劑、APC、CD95、雌酮、MENl、BRCAl、 Von Hippel-Lindau腫瘤抑制劑、RKIP、nm23、內(nèi)皮抑制素、胰島素、胰島素樣生長因子 I(IGF-I)、生長因子、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞 集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、白介素-Ia和β、白介 素_3、白介素_4、白介素-6、白介素-2、表皮生長因子(EGF)、降鈣素、促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH)、腫瘤壞死因子(TNF)、阿托西班、布舍瑞林、西曲瑞克、地洛瑞林、去氨加壓素、強啡 肽A(l-13)、依降鈣素、依來多辛、依替巴肽、生長激素釋放激素-II (GHRH-II)、戈那瑞林、 戈舍瑞林、組氨瑞林、亮丙瑞林、賴氨加壓素、奧曲肽、催產(chǎn)素、加壓素、胰泌素、辛卡利特、特 利加壓素、胸腺噴丁、胸腺素α 1、曲普瑞林、比伐盧定、卡貝縮宮素、環(huán)孢素、艾可西定、蘭瑞 肽、黃體生成素釋放激素(LHRH)、那法瑞林、甲狀旁腺激素、普蘭林肽、恩夫韋地(Τ-20)、胸 腺法新和齊考諾肽。
8.權(quán)利要求1的跨膜融合蛋白，進一步包含核定位信號域。
9.權(quán)利要求8的跨膜融合蛋白，其中所述核定位信號域包含具有SEQIDNO J6的多肽。
10.編碼權(quán)利要求1-9任一項的跨膜融合蛋白的分離的多核苷酸。
11.重組載體，包含權(quán)利要求10的多核苷酸；和與所述多核苷酸可操作地連接的啟動子。
12.由權(quán)利要求10的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
13.將跨膜融合蛋白遞送至細胞的方法，所述方法包括在體外將權(quán)利要求1-9任一項 的跨膜融合蛋白與細胞接觸。
14.產(chǎn)生跨膜融合蛋白的方法，包括在容許所述跨膜融合蛋白表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主細胞；和從宿主細胞培養(yǎng)物回收所述跨膜融合蛋白。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述宿主細胞是細菌宿主細胞。
16.用于將生物活性分子遞送至細胞的組合物，包含權(quán)利要求1-9任一項的跨膜融合 蛋白；和可藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含泛素或泛素樣蛋白、膜易位序列和生物活性分子的融合蛋白及其用途。具體地，本發(fā)明涉及包含泛素或泛素樣蛋白、與該泛素或泛素樣蛋白的C-末端連接的膜易位序列、和與該膜易位序列的C-末端連接的生物活性分子的跨膜融合蛋白，編碼所述跨膜融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸序列的重組表達載體，由所述重組表達載體轉(zhuǎn)化的細胞，和使用所述跨膜融合蛋白將所述生物活性分子遞送至細胞中的方法。
文檔編號C12P21/02GK102086231SQ201010574418
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者李兌洙, 李在日, 李英善 申請人:三星電子株式會社