專利名稱：一種檢測蚊傳病原體的多重pcr試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測領域，尤其涉及蚊媒病原體(乙型腦炎病毒、登革熱病毒、瘧 原蟲、絲蟲)的基因檢測，特別是一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒及檢測方法。
背景技術：
在我國流行或曾經(jīng)流行的蚊媒病有瘧疾、絲蟲病、乙型腦炎、登革熱等。檢測蚊媒 攜帶病原體是早期發(fā)現(xiàn)流行、預防蚊媒病的有效措施之一。蚊蟲是瘧疾、絲蟲病、乙型腦炎、登革熱等多種傳染病的傳播媒介。蚊媒病的監(jiān)測， 以往的研究多是針對單種病原體檢測，對于蚊媒病的防治應當綜合考慮。從蚊媒方面來監(jiān) 測病原體，屬于早期監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)傳染病的方法，半巢式多重PCR檢測蚊媒病原體方法將為 蚊媒病防治提供一種早期的綜合高效的監(jiān)測方法，對蚊媒病的有效預警和控制有較大價值。目前，世界上仍有100多個國家為瘧疾流行區(qū)，約22億人受瘧疾的威脅，每年有 300 500萬瘧疾臨床病例，死亡人數(shù)為110 270萬。瘧疾也是嚴重危害我國人民身體健 康，影響社會經(jīng)濟發(fā)展的重大寄生蟲病。經(jīng)過多年堅持不懈的積極防治，我國在控制瘧疾流 行、減少危害程度方面取得了顯著成效。由于我國瘧疾疫區(qū)各類流行因素尚未根本改變，流 動人口劇增導致傳染源擴散與積累，氣候變暖、生態(tài)環(huán)境變化造成媒介按蚊密度增加，惡性 瘧原蟲和媒介按蚊對防治藥物抗性的產(chǎn)生和擴散，這些問題嚴重影響了我國瘧疾防治工作 的進程，近年來瘧疾發(fā)病數(shù)呈不穩(wěn)定狀態(tài)。國家衛(wèi)生部已經(jīng)制定了消除瘧疾的計劃，為保證 該計劃的實施，應當有計劃、連續(xù)、系統(tǒng)地開展瘧疾疫情、監(jiān)測，掌握瘧疾流行規(guī)律和趨勢， 為評價防治效果和制訂瘧疾防治對策提供科學依據(jù)。有效的蚊媒檢測是加強我國預防控制 瘧疾的重要技術保障，是有效開展預防和控制瘧疾工作的重要內容。淋巴絲蟲病是嚴重危害人民健康的寄生蟲病之一，在我國流行的絲蟲病有班氏絲 蟲病和馬來絲蟲病兩種，分別由班氏吳策線蟲和馬來布魯線蟲引起。曾經(jīng)在15個省(市、 區(qū))流行，受威脅人口達3. 3億。經(jīng)過40年的防治，實現(xiàn)了全國基本消滅絲蟲病。現(xiàn)有報 告，在經(jīng)濟、衛(wèi)生條件較差的邊遠貧困地區(qū)，以及防治、監(jiān)測工作中存在薄弱環(huán)節(jié)的地區(qū)，與 鄰國絲蟲病流行區(qū)接壤地帶，外來流動人口聚集地區(qū)，即使只存在個別的高密度微絲蚴血 癥者就可在當?shù)匾鸾z蟲新感染。滅病務盡，防止絲蟲病在我國死灰復燃，消滅絲蟲病地區(qū) 仍需繼續(xù)開展監(jiān)測工作。對于黃病毒屬病毒，以乙腦、登革熱為例。乙腦是由乙腦病毒引起，由蚊蟲傳播的 急性傳染病。乙腦致死率和致殘率高，是威脅人群特別是兒童健康的主要傳染病之一。夏秋 季為發(fā)病高峰季節(jié)，流行地區(qū)分布與媒介蚊蟲分布密切相關，我國曾是乙腦高度流行區(qū)，在 20世紀60年代和70年代初期全國曾發(fā)生大流行，70年代以后隨著大范圍接種乙腦疫苗， 乙腦發(fā)病率明顯下降，近年來維持在較低的發(fā)病水平，全國乙腦報告病例數(shù)每年在5000 10000例之間，但由于疫苗接種的盲區(qū)或其他原因，局部地區(qū)時有暴發(fā)流行。登革病毒有1 4型，經(jīng)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。按照《中華人民共和國傳染病防治法》的規(guī)定為乙類傳染病。是熱帶、亞熱帶地區(qū)的一個非常重要的公共衛(wèi)生問題。目 前，世界上約有25億人受到登革病毒感染的威脅，每年發(fā)生登革病毒感染患者超過1億人， 并且有50萬人發(fā)展成為登革出血熱或登革休克綜合征，造成大約25000人死亡。我國20 世紀90年代以來，本病主要在廣東、福建流行，多為小規(guī)模流行或散發(fā)。1999年和2004年 因輸入性病例導致福建和浙江等地發(fā)生暴發(fā)流行，其它省區(qū)近年來也常有輸入性病例的發(fā) 生。由于登革病毒傳播迅猛、發(fā)病率高，特別是近些年由于人員流動頻繁和國際旅游的迅 猛發(fā)展，使登革病毒的流行范圍及其傳播媒介埃及伊蚊和白紋伊蚊的分布范圍也在相應擴 大。登革病毒在一個地區(qū)往往存在不同血清型病毒的交替流行，這更增加了登革出血熱和 登革休克綜合征發(fā)生的威脅。登革出血熱和登革休克綜合征的病死率較高，不僅嚴重影響 人民的身體健康，而且嚴重影響當?shù)亟?jīng)濟、貿易和旅游事業(yè)的發(fā)展。實施流行性乙型腦炎和 登革熱的蚊媒監(jiān)測，有助于提前發(fā)現(xiàn)疫情，科學地預測、預警，及時采取有效防治措施，降低 發(fā)病率。從蚊媒方面來監(jiān)測瘧原蟲絲蟲黃病毒屬病毒感染，在傳染病監(jiān)測中屬于早期監(jiān)測 和發(fā)現(xiàn)傳染病流行的方法，蚊媒檢測對于蚊媒病的有效預警和控制有重要的意義。以往的 研究都是針對一種病原體檢測，對于蚊媒病的防治應當綜合考慮。簡便準確的檢測方法是發(fā)現(xiàn)蚊傳病原體的重要技術保障，掌握其流行規(guī)律和趨勢 為評價防治效果和制訂防治對策提供科學依據(jù)(Nuchprayoon et al.，2003)。還可用于蚊 傳疾病的臨床檢測。監(jiān)測蚊蟲感染情況，對瘧疾和絲蟲病控制具有重要影響(Gage et al., 2008)。診斷絲蟲病和瘧疾，傳統(tǒng)方法是顯微鏡鏡檢，雖然此方法方便，費用低廉并且相對準 確，但是往往需要技術熟練和費時的勞動，而且不足以檢測瘧原蟲低密度血樣。為解決這些 不足，發(fā)展了免疫學方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫吸附層析(ICT)，用來精確 評估血樣和蚊蟲群體病原體攜帶情況[Nuchprayoon et al. ,2003, Wirtz et al.，1985]。 以后又發(fā)展了更簡單，更敏感的診斷方法，即基于更先進的免疫免疫吸附層析(ICT)和聚 合酶鏈反應(PCR)技術。如高度敏感的種屬特異性免疫吸附層析(ICT)能夠快速檢測血檢 陰性血樣中的班氏絲蟲(Weil et al. ,1997)；類似的技術已經(jīng)開發(fā)用于檢測人體內瘧原蟲 和岐體內子孢子(Bangs et al. ,2002, Wirtz et al.，1985，Wongsrichanalai，2001)。使用敏感特異的檢測技術如PCR可以獲得準確的疾病流行狀況。檢測蚊蟲體內瘧 原蟲、絲蟲DNA可以間接反映人群的感染情況(Bockarie et al.，2000，Chanteau et al.， 1994, Goodman et al. , 2003, Ramzy et al. , 1997, Rao et al. , 2006, Rougemont et al., 2004,Vasuki et al.，2008，Chansiri and Phantana，2002，F(xiàn)arid et al. ,2001, Williams et al.，2002)。用RFLP-PCR方法以班氏絲蟲SspI 188bp重復DNA序列為靶基因，能檢測0. Ipg 的班氏絲蟲基因組 DNA (Chansiri and Phantana, 2002, Farid et al.，2001，Williams et al. ,2002) ο 以絲蟲轉錄間隔 1 區(qū)(internal transcribed spacerl，ITS-1)序列為靶基因 RFLP-PCR可以檢測多種絲蟲(Nuchprayoon et al. ,2005) 使用多重PCR法檢測蚊蟲和血 樣中班氏絲蟲和馬來絲蟲(Chansiri etal.，2001，Mishra et al.，2005，Mishra et al.， 2007)。巢式PCR敏感度高，與傳統(tǒng)PCR相比它能檢測到更微量的絲蟲，但目前使用巢式PCR 檢測絲蟲鮮有報道。隨著班氏絲蟲和馬來絲蟲ITS-I基因序列的發(fā)表，可以在這個高度重 復序列上設計引物，建立基于PCR原理的各種新的檢測方法。
在瘧原蟲檢測方面，免疫層析試驗已作為診斷瘧疾的選擇，但是其靈敏度不足而 不能用于常規(guī)診斷(Humar et al.，1997，Tham et al.，1999)。DNA探針相比鏡檢靈敏度 有所提高(Waters and McCutchan，1989)，但是這種方法不適于大量樣本的篩選。PCR檢測 多以小核糖體亞基 DNA (SSU rDNA)為靶基因(Li et al.，1995 ；Schindler et al.，2001 ； Snounou et al.，1993)。由于瘧原蟲SSU rDNA基因拷貝數(shù)較少，每個基因組4_8拷貝(Goman et al.，1991)，巢式 PCR 被用來檢測微量原蟲(Rubio et al. , 1999 ；Schindler et al.， 2001 ；Snounou et al.，1993 ；Zalis et al.，1996)。巢式PCR 比傳統(tǒng)PCR特異性和靈敏度更 高，但巢式PCR是兩次PCR，步驟較為繁瑣(Picken et al. , 1996)；單管半巢式PCR(Single tube hemi-nested PCR, STHN PCR)步驟簡單，但敏感度不及兩步巢式 PCR (Montenegro et al.，2004)。real-time PCR以18S rDNA為靶基因檢測人血樣中4種瘧原蟲，靈敏度高特異 性強，但real-time PCR成本較高，不適合大量樣本的篩選(Rougemont et al. ,2004) 雖然有許多關于檢測蚊媒黃病毒屬特定種或屬的分子診斷(Chow et al. ,1993, Fulop et al. ,1993,Tanaka,1993,Chang et al. ,1994,Puri et al. ,1994,Pierre et al., 1994，Meiyu et al.，1997，Kuno, 1998)，但迄今為止僅 Scaramozzino 和 Lanciotti 報道的 屬特異性半巢式PCR具有較高敏感性。Pyke (2004)用TaqMan RT-PCR檢測了澳大利亞腦炎 病毒，1(01^(2006)用139]\&111儀31-^1116 one-step RT-PCR定量檢測了登革病毒，Dyer(2007) 用同樣方法建立了檢測節(jié)肢動物傳播的黃病毒屬的方法，國內周曉俊等.(2008)建立了 SYBR Green I Real-time PCR檢測黃病毒屬的方法，該技術不僅實現(xiàn)了 PCR從定性別定量 的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等 特點，但缺點則是機器及反應耗材費用相對較高，造成目前在使用上無法達到普及?？傊?， 國內外對于蚊傳病原體的檢測大多靈敏度不高，成本較高，且不能同時檢測蚊蟲攜帶的多 種病原體。本發(fā)明也可用于西尼羅病毒、黃熱病毒的初步鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒及檢測方法，所述 的這種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒及檢測方法要解決現(xiàn)有技術中的檢測蚊傳病原 體的方法靈敏度不高、成本較高、且不能同時檢測蚊蟲攜帶的多種病原體的技術問題。本發(fā)明一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，含有如下引物1)檢測黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測瘧原蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ IDNO 6所示；4)檢測瘧原蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，
下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測馬來絲蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測馬來絲蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。進一步的，所述的黃病毒屬病毒包括乙型腦炎病毒、或者登革熱病毒1型、或者登 革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒4型、西尼羅病毒和黃熱病毒。進一步的，所述的瘧原蟲屬包括惡性瘧原蟲、或者間日瘧原蟲、或者諾氏瘧原蟲、 或者卵形瘧原蟲、或者三日瘧原蟲。進一步的，所述的試劑盒中還含有聚合酶鏈式反應試劑。進一步的，所述的試劑盒中還含有陰性質控標準品。進一步的，所述的試劑盒中還含有陽性標準品。進一步的，所述的陰性質控標準品為滅菌ddH20。進一步的，所述的陽性標準品為乙型腦炎cDNA、或者登革熱病毒cDNA、或者間日 瘧原蟲DNA、或者惡性瘧原蟲DNA。進一步的，所述的聚合酶鏈式反應試劑中各組份為1) 10倍聚合酶鏈式反應緩沖液；2)四種脫氧核糖核苷酸，四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為25mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的濃度為5mg/ml ；4) EXTaq 酶，EXTaq 酶的濃度為 5U/ μ L ；5)滅菌雙蒸水。進一步的，所述的10倍聚合酶鏈式反應緩沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。進一步的，所述的試劑盒中的所有的引物的濃度均為ΙΟμΜ。本發(fā)明還提供了一種檢測蚊傳病原體的方法，包括一個提取蚊蟲核酸的步驟，還 包括一個將提取的核酸在PCR擴增儀上進行擴增的步驟，還包括一個將擴增的產(chǎn)物進行電 泳檢測的步驟，還包括確定蚊傳病原體具體種類的測序步驟。進一步的，在一個將提取的核酸在PCR擴增儀上進行擴增的步驟中，1)檢測黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測瘧原蟲第一輪PCR的引物
7
上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)檢測瘧原蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測馬來絲蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測馬來絲蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ IDNO 13所示。本發(fā)明還提供了上述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒在檢測乙型腦炎 病毒、或者登革熱病毒1型、或者登革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒 4型、或者西尼羅病毒和黃熱病毒/惡性瘧原蟲、或者間日瘧原蟲、或者諾氏瘧原蟲、或者卵 形瘧原蟲、或者三日瘧原蟲/馬來絲蟲、或班氏絲蟲中的應用。本發(fā)明和已有技術相比較，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明建立了一種對上述蚊 媒病原體的快速有效分子鑒定方法，為蚊媒病的早期有效預警提供可靠的信息資料。本發(fā) 明建立了半巢式多重PCR檢測蚊傳病原體(瘧原蟲、絲蟲、黃病毒)的方法，將為我國蚊媒 病防治工作提供一種低廉高效的早期監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)傳染病流行的方法。半巢式多重PCR檢測 蚊媒病原體方法將為我國蚊媒病防治提供一種早期的綜合高效的監(jiān)測方法，對蚊媒病的有 效預警和控制有較大價值。本發(fā)明可以應用于多種樣品的檢測，如蚊蟲、病人血液、組織液等。使用本發(fā)明 的試劑盒可快速、靈敏、同時檢測蚊蟲攜帶的多種病原體包括乙型腦炎病毒、登革熱病毒 1-4型、黃熱病毒、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、馬來絲 蟲等多種病原體。從而為我國蚊媒病防治工作提供一種低廉高效的早期監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)蚊媒病 流行的方法，對預防蚊媒病提供有效預警資料。


圖1是采用本發(fā)明的試劑盒檢測蚊傳瘧原蟲(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、諾氏瘧原 蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和馬來絲蟲)的結果圖；M :DNA分子標準Marker I ；K 陰性對照(ddH20PCR產(chǎn)物)；1 蚊蟲內馬來絲蟲與約 氏瘧原蟲DNA模板PCR產(chǎn)物；2 海南病人血樣惡性瘧原蟲DNA模板PCR產(chǎn)物；3 淮北病人 濾紙血跡瘧原蟲DNA模板PCR產(chǎn)物；4 淮北病人濾紙血跡瘧原蟲DNA模板PCR產(chǎn)物；5 馬 來絲蟲DNA模板PCR產(chǎn)物；6 馬來絲蟲DNA模板PCR產(chǎn)物(當?shù)谝惠哖CR循環(huán)次數(shù)過多，在 第二輪PCR產(chǎn)物中會出現(xiàn)第一輪PCR的條帶431bp)。圖2是采用本發(fā)明的試劑盒檢測黃病毒屬病毒(乙型腦炎病毒、登革熱病毒1-4 型、黃熱病毒)；M =DNA分子標準Marker I ；K 陰性對照(ddH20PCR產(chǎn)物)；1 乙型腦炎病毒cDNA 模板PCR產(chǎn)物(當?shù)谝惠哖CR循環(huán)次數(shù)過多，在第二輪PCR產(chǎn)物中會出現(xiàn)第一輪PCR的條
8帶260bp) ；2 乙型腦炎病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；3 乙型腦炎病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；4 乙型腦炎病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；5 登革熱I型病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；6 登革熱II型 病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；7 登革熱III型病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；8 登革熱IV型病毒cDNA 模板PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式下面實施例進一步對本發(fā)明進行說明。下面實施例中采用的樣本、動物及試劑如下感染馬來絲蟲的蚊蟲樣品來自中國疾控中心寄生蟲研究所，蚊蟲黃病毒屬病毒培 養(yǎng)液來自第二軍醫(yī)大學流行病教研室，斯氏按蚊第二軍醫(yī)大學原生物教研室飼養(yǎng)，惡性瘧 原蟲樣本為本教研室采自云南和海南的瘧原蟲培養(yǎng)品，間日瘧原蟲樣本為本教研室采自淮 北間日瘧病人濾紙血樣，約氏瘧原蟲為第二軍醫(yī)大學原生物教研室液氮保存的約氏瘧原蟲 樣品，小鼠由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供的昆明小白鼠。分子生物學試劑組織DNA提取試劑盒、DNA分子標準Marker I (北京天根)，脫 氧核苷三磷酸(dNTP)、ExTaq DNA 聚合酶、Loading buffer (TaKaRa), Quant cDNA 第一鏈合 成試劑盒(QIAGEN)，瓊脂糖(西班牙)，小牛血消蛋白BSA、核酸染料GoodView(北京索萊 寶)，雙蒸水(上海生工)，引物由上海生工合成。聚合酶鏈式反應(50 μ L體系)試劑含有10倍聚合酶鏈式反應緩沖液(含 MgCl2)、特異引物均為10 μ M、dNTP (2. 5mM each)、小牛血清蛋白BSA(5mg/ml)和滅茵雙蒸 水，EXTaq 酶。10倍PCR Buffer的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。實施例1本發(fā)明一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，含有如下引物1)檢測黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測瘧原蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)檢測瘧原蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測馬來絲蟲第一輪PCR的引物
上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測馬來絲蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。進一步的，所述的黃病毒屬病毒包括乙型腦炎病毒、或者登革熱病毒1型、或者登 革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒4型、西尼羅病毒和黃熱病毒。進一步的，所述的瘧原蟲屬包括惡性瘧原蟲、或者間日瘧原蟲、或者諾氏瘧原蟲、 或者卵形瘧原蟲、或者三日瘧原蟲。進一步的，所述的試劑盒中還含有聚合酶鏈式反應試劑。進一步的，所述的試劑盒中還含有陰性質控標準品。進一步的，所述的試劑盒中還含有陽性標準品。進一步的，所述的陰性質控標準品為滅菌ddH20。進一步的，所述的陽性標準品為乙型腦炎cDNA、或者登革熱病毒cDNA、或者間日 瘧原蟲DNA、或者惡性瘧原蟲DNA。進一步的，所述的聚合酶鏈式反應試劑中各組份為1) 10倍聚合酶鏈式反應緩沖液；2)四種脫氧核糖核苷酸，四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為2. 5mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的濃度為5mg/ml ；4) EXTaq 酶，EXTaq 酶的濃度為 5U/μ L ；5)滅菌雙蒸水。進一步的，所述的10倍聚合酶鏈式反應緩沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。進一步的，所述的試劑盒中的所有的引物的濃度均為ΙΟμΜ。實施例2本發(fā)明還提供了一種檢測蚊傳病原體的方法，包括一個提取蚊蟲核酸的步驟，還 包括一個將提取的核酸在PCR擴增儀上進行擴增的步驟，還包括一個將擴增的產(chǎn)物進行電 泳檢測的步驟，還包括確定蚊傳病原體具體種類的測序步驟。進一步的，在一個將提取的核酸在PCR擴增儀上進行擴增的步驟中，1)檢測黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測瘧原蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，0137]下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；
0138]4)檢測瘧原蟲第二輪PCR的引物
0139]上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，
0140]下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；
0141]5)檢測馬來絲蟲第一輪PCR的引物
0142]上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，
0143]下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；
0144]6)檢測馬來絲蟲第二輪PCR的引物
0145]上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，
0146]下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。
0147]實施例3檢測蚊蟲攜帶瘧原蟲屬(惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、卵形瘧 原蟲、三日瘧原蟲和馬來絲蟲)的步驟如下描述
0148]a.提取核酸取單只蚊蟲(斯氏按蚊)放入1. 5ml離心管中研磨至其被完全碾成 粉末，使用天根DNA提取試劑盒DP304 (北京天根)，按說明提取DNA。
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158]
0159]
0160] 0161] 0162] 0163]
b. PCR擴增
第一輪PCR條件
IOXBuffer
dNTP (2. 5mM)
BSA(5mg/ml)
FP(IOyM)
RP(IOyM)
DNA模板
EXTaq
ddH20
PCR循環(huán)參數(shù) 1. 94 0C
5 μ L 4μ L 1 μ L
各IyL(絲蟲瘧原蟲第-各IyL(絲蟲瘧原蟲第-1. 5μ L 0. 4μ L(2U) 34. 1 μ L
“輪PCR引物) -輪PCR引物)
0164] 5
94 0C 56 0C 72 0C
4Min 25Sec 20Sec 50Sec
go to step 2 29_33times
5Min
0165]6. 72 °C
0166]第二輪PCR條件
0167]IOXBuffer
0168]dNTP (25mM)
0169]BSA(5mg/ml)
0170]FP(IOyM)
0171]RP(IOyM)
0172]DNA模板(第一輪PCR產(chǎn)物)
0173]EXTaq
5 μ L 4μ L 1 μ L
各IyL(絲蟲瘧原蟲第: 各IyL(絲蟲瘧原蟲第:
1 μ L 0. 4μ L(2U)輪PCR引物) 輪PCR引物)
11
dNTP (2. 5mM)4 μ LBSA(5mg/ml)1 μ LFP :malm(10yM)1 μ LRP :Rcfm9279-9301(10yM)1 μ LcDNA 模板l.OyLEXTaq0. 3μ L(l. 5U)ddH2036. 7μ LPCR循環(huán)參數(shù)1. 94 °C4Min2. 94 °C25Sec3. 53 °C25Sec4. 72 °C30Sec5. go to step 225_30times6. 72 °C5Min第二輪PCR條件IOXBuffer5μ LdNTP (25mM)4 μ LBSA(5mg/ml)1 μ LFP :R9102-9123(10uM)1 μ LRP :Rcfm9279-9301(10yM)1 μ L模板(第一輪PCR產(chǎn)物)IyLEXTaq0. 3μ L(l. 5U)ddH2036. 7 μ Ltotal50 μ LPCR循環(huán)參數(shù)1. 94 °C4Min2. 94 °C25Sec3. 53 °C20Sec4. 72 °C30Sec5. go to step 2 32_34times6. 72 °C5Min上面所述的引物具體為黃病毒屬病毒的第一輪PCR引物特異引物malm 5' -AACATGTTGGGRAARAGAGAGAA-3‘特異弓丨物Rcfm9279-9301:5'-GTGTCCCAKCCKGCKGTRTCATC-3 ‘黃病毒屬病毒的第二輪PCR引物特異引物R9102-9123 :5' -ATYTGGTWYATGTGGYTTGGAG-3‘
特異弓丨物 Rcfm9279-9301:5'-GTGTCCCAKCCKGCKGTRTCATC-3 ‘c.電泳和觀察配制1. 5-2%的瓊脂糖凝膠，取5-10μ L擴增后的樣品，在紫外燈
13下觀察，檢測是否有一條約200bp的核酸條帶，如果有一 200bp的核酸條帶，說明蚊蟲攜帶 黃病毒屬病毒(乙型腦炎病毒、登革熱病毒1-4型、黃熱病毒)，反之則沒有。若要確定黃病 毒屬病毒的類型，割膠純化，以第二輪PCR上游引物測序(此片斷測序易成功)，對于多重黃 病毒屬病毒同時感染不宜直接測序的情況，可克隆測序解決。如圖2所示。
權利要求
一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于含有如下引物1)檢測黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO2所示；2)檢測黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO4所示；3)檢測瘧原蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO6所示；4)檢測瘧原蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO7所示或如SEQ ID NO8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO9所示；5)檢測馬來絲蟲第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO11所示；6)檢測馬來絲蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO13所示。
2.如權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 黃病毒屬病毒包括乙型腦炎病毒、或者登革熱病毒1型、或者登革熱病毒2型、或者登革熱 病毒3型、或者登革熱病毒4型、西尼羅病毒和黃熱病毒。
3.如權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 瘧原蟲屬包括惡性瘧原蟲、或者間日瘧原蟲、或者諾氏瘧原蟲、或者卵形瘧原蟲、或者三日 瘧原蟲。
4.如權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中還含有聚合酶鏈式反應試劑。
5.如權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中還含有陰性質控標準品。
6.如權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中還含有陽性標準品。
7.如權利要求5所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 陰性質控標準品為滅菌ddH20。
8.如權利要求6所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 陽性標準品為乙型腦炎cDNA、或者登革熱病毒cDNA、間日瘧原蟲DNA、惡性瘧原蟲DNA。
9.如權利要求4所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的聚 合酶鏈式反應試劑中各組份為1)10倍聚合酶鏈式反應緩沖液；2)四種脫氧核糖核苷酸，四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為2.5mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的濃度為5mg/ml；4)EXTaq 酶，EXTaq 酶的濃度為 5U/ μ L ；5)滅菌雙蒸水。
10.如權利要求9所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 10倍聚合酶鏈式反應緩沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。
11.如權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中的所有的引物的濃度均為10 μ M。
12.—種檢測蚊傳病原體的方法，其特征在于包括一個提取蚊蟲核酸的步驟，還包括 一個將提取的核酸在PCR擴增儀上進行擴增的步驟，還包括一個將擴增的產(chǎn)物進行電泳檢 測的步驟，還包括確定蚊傳病原體具體種類的測序步驟。
13.如權利要求12所述的一種檢測蚊傳病原體的方法，其特征在于 在一個將提取的核酸在PCR擴增儀上進行擴增的步驟中，1)檢測黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID Ν0:1所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 3所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測瘧原蟲第一輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 5所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)檢測瘧原蟲第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測馬來絲蟲第一輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID N0:10所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測馬來絲蟲第二輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 12所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO: 13所示。
14.權利要求1所述的一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒在檢測乙型腦炎病毒、 或者登革熱病毒1型、或者登革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒4型、或 者西尼羅病毒和黃熱病毒/惡性瘧原蟲、或者間日瘧原蟲、或者諾氏瘧原蟲、或者卵形瘧原 蟲、或者三日瘧原蟲/馬來絲蟲、或班氏絲蟲中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，所述的試劑盒中包括六對特異的引物，本發(fā)明還提供了一種檢測蚊傳病原體的方法，采用PCR擴增的產(chǎn)物進行電泳，通過PCR擴增片段的長度來檢測和鑒定是否存在乙型腦炎病毒、登革熱病毒、黃熱病毒、惡性瘧原蟲、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲、馬來絲蟲、班氏絲蟲等病原體。本發(fā)明能同時檢測各種已報道的蚊傳病原體，以及可能從境外輸入的黃熱病毒和西尼羅病毒，而且快速、準確、靈敏，本發(fā)明可以應用于多種樣品的檢測，如蚊蟲、病人血液、組織液等。本發(fā)明為我國蚊媒病防治工作提供一種低廉高效的早期監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)蚊媒病流行的方法。
文檔編號C12Q1/70GK101979665SQ201010508779
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權日2010年10月15日
發(fā)明者周正斌, 朱淮民 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學