專利名稱：一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及預防艾滋傳播的制藥領域，具體地，涉及硝酸鑭和來源于青陽參的β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物配制而成的復方制劑。
背景技術：
性傳播疾病(sexually transmitted disease，STD)已經成為我國和全球的生殖健康和衛(wèi)生防疫的難題。僅以美國為例，在前十位常見疾病中，STD就有五種。每年的新病例有1200萬，僅1994年的預防開支達到170億美元左右，由此可見它的危害。在其他國家，特別是發(fā)展中國家(包括中國)，STD引起的危害和損失也是很大的。據我國權威部門公布的材料，我國性病的年增長率超過30％，艾滋病和艾滋病毒感染者的增長率，1999年比1998年分別增長105％和250％。
在20多種性傳播疾病當中，危害最大的是艾滋病。到2002年底，全球已死亡艾滋病人3000萬人，僅2002年就死亡310萬人，有4200萬人感染上了艾滋病毒，2002年就有500萬新感染者，每天有約一萬五千人新感染上艾滋病毒，其中婦女約占總數(shù)的44％。由同性或異性性傳播引起的感染者占80-90％。雖然已有高效聯(lián)合療法(雞尾酒療法)可以減少發(fā)病率和死亡率，但還不能治愈。所需要的醫(yī)療費用更是絕大部分發(fā)展中國家的患者無法承受的開支。根據消滅天花和脊髓灰質炎的經驗，即使將來研制出高效艾滋病疫苗，其他防治方法也還需要繼續(xù)使用至少五十年。已有研究表明，其它的性傳播疾病會增加艾滋病毒感染的機會，所以針對殺其它STD病原體的殺微生物劑的使用，除了直接減少這些疾病的發(fā)生之外，還會間接地阻止艾滋病毒的性傳播。因此，目前的主攻方向是研制出高效、價廉和安全的針對艾滋病毒的殺微生物劑。由此可見，研制出實用的殺微生物劑是社會十分迫切需要的。
鑒于殺微生物劑在減少性傳播所引起的HIV感染以及其它性傳播病原體引起的疾病的發(fā)生方面可能會發(fā)揮重要作用，聯(lián)合國艾滋病總署，美國國立衛(wèi)生研究院，疾病控制中心，美國避孕研究與發(fā)展計劃(CONRAD)以及許多非政府組織，多種私人基金會都特別強調殺微生物劑的研究，某些大的制藥公司也逐步更多地投入資金和參與這類研究。由洛氏基金會資助，1999年3月29-4月2日在意大利召開的避孕研究與發(fā)展的公立和私立機構合作會議上，有好幾個報告專門闡述了殺微生物劑的重要性和最新研究進展。2000年1月13-14日，美國國立衛(wèi)生研究院的變態(tài)反應與傳染病研究所召開了關于局部使用的殺微生物劑臨床前評價的學術討論會。2000年3月13日-16日在美國首都華盛頓附近的Alexandria，2002年5月在比利時分別召開了題為Microbicides 2000和2002的大型國際性學術討論會，每次參加人數(shù)達600多，來自全世界好幾十個國家的代表出席了會議。聯(lián)合國艾滋病總署的主任PeterPiot專程出席并做了報告。我國的艾滋病毒感染的態(tài)勢十分嚴峻。采取有效措施，減少像我國這樣一個具有世界最多人口的發(fā)展中國家的HIV感染的傳播，是十分緊迫的任務。如前所述，我們不能坐等有效的HIV疫苗來阻止和消滅HIV-1的傳播。即使已有這種疫苗，艾滋病的流行也仍然至少會持續(xù)50年左右。脊髓灰質炎和天花的實例就已經證明這一點。因此，我們不能等到像目前有些發(fā)展中國家那樣，HIV感染已經成災，已經成為國家的嚴重社會和經濟問題之后再來頭痛醫(yī)頭，腳痛醫(yī)腳。我們必須積極研究新的能夠減少或阻止HIV-1傳播的藥物或制劑，使之造福于社會和我們整個民族的未來。
目前還沒有一種殺微生物劑上市，正在研究之中的殺微生物劑至少有60種以上，按照作用機理可分為五類(1)直接殺死或滅活病毒和細菌的制劑；(2)抑制病毒進入粘膜細胞的制劑；(3)抑制病毒與細胞融合的制劑；(4)抑制HIV與細胞融合之后的病毒活性或復制；(5)作為賦形劑的聚合物。其中有30來種是既具有抗微生物的活性，又有避孕或殺精子的活性，有的主要起避孕或殺精子作用，有16種只具有抗微生物的活性，4種具有機械屏障作用。在這些殺微生物劑當中，有3種進入臨床III期試驗，4種進入II期試驗，16種進入了I期臨床試驗。在臨床前研究階段的有33種，其中已做過動物試驗的有28種，其余5種只有體外試驗資料。特別值得指出的是，最新研究資料證明，以表面活性劑和去污劑組成的殺微生物劑(如壬丙醇等)會增加艾滋病毒性傳播的機會。學術界已經公認這類制劑應該禁止使用。在我國，至今還未見類似的研究。
本發(fā)明所說的新型殺微生物劑是一個復方制劑，主要組成成分是化合物硝酸鑭和來源于青陽參的β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物，硝酸鑭分子量小，來源豐富，對人艾滋病毒及其它某些性傳播病原體引起的疾病有很好的抑制作用，治療指數(shù)達到700～900，而β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物是來源于一種特產植物青陽參，分子量為2萬左右的多糖，我們的研究結果表明，它對人艾滋病毒的抑制活性(治療指數(shù)TI值)大于1000，它能與HIV-1 GP120的V3區(qū)結合，從而阻止病毒與宿主細胞結合。本發(fā)明使用復方可以通過多靶點作用，增強藥物抗病原體的的綜合力量和互補作用，達到增強藥效的目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種預防艾滋病毒性傳播的新型殺微生物劑。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種預防艾滋病毒性傳播的新型殺微生物劑在阻止艾滋病毒性傳播中的應用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種預防艾滋病傳播的新型殺微生物劑在阻止HSV性傳播中的應用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種預防艾滋病傳播的新型殺微生物劑阻止白色念珠菌性傳播中的應用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種預防艾滋病傳播的新型殺微生物劑阻止性傳播疾病病原體通過生殖道傳播中的應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了下面的方案一種預防艾滋病傳播的新型殺微生物劑，是用硝酸鑭和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物作為原料，以重量比為0.1∶1～1000∶1配制而成。
為了更好的了解本發(fā)明的實質性內容，下面用實驗來說明本發(fā)明在阻止性傳播疾病病原體通過生殖道傳播的有益效果。
1、新型殺微生物劑體外抗HIV-1病毒活性檢測的實驗方法先進行病毒感染性的滴定，在96孔板上，將病毒做倍比稀釋，設置梯度，并且每個梯度設置多個孔形成一組，同時設置對照組。每孔加入適當?shù)募毎?2×104/孔)，使每孔的終體積為200μl。37℃，5％CO2培養(yǎng)。第三天補加新鮮完全培養(yǎng)基100μl，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中病毒誘導的細胞致病變效應(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞體的形成來確定；按Reed & Muench方法計算病毒的TCID50(50％ Tissue culture infectious dose)。用MTT方法測定細胞存活和增殖。取適量的細胞與不同濃度的樣品溶液混合，放置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天或者五天，測定細胞毒性IC50(50％ inhibition concentration)。然后在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測樣品用培養(yǎng)基進行倍比稀釋，設置適當?shù)南♂尪?，每?00μl，設多個重復孔，同時設置正常細胞對照。對于病毒感染的細胞。每孔加適當?shù)募毎缓竺靠准尤脒m量的病毒上清，每孔的終體積為200μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。感染后第3天觀察樣品對合胞體形成的影響。在倒置顯微鏡下，計數(shù)病毒誘導細胞形成的合胞體數(shù)。通過計算得到新型殺微生物劑的治療指數(shù)。
(3)通過計算得出新型殺微生物劑的細胞毒性IC50(對50％的宿主細胞產生毒性的樣品的濃度)；EC50為具有50％合胞體形成抑制率的樣品濃度。治療指數(shù)TI值(therapeutic index)為IC50/EC50的比值。
2、MTT法測定新型殺微生物劑體外對白色念珠菌的抑制作用取待試的新型殺微生物劑體10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培養(yǎng)基，充分混合后，使?jié)舛葹?0mg/ml，過濾除菌，置4℃保存；首先將待試藥新型殺微生物劑體稀釋至合適的濃度(96孔培養(yǎng)板)同時設置陰性對照和空白對照。每系列孔(除空白和生長對照系列外)取100μl給下一孔，最終留100μl，余下的棄去。用頭孢菌素作陽性對照，濃度稀釋同待測新型殺微生物劑體的稀釋；用沙保氏培養(yǎng)基把白色念珠菌懸液濃度從4.5×106cfu/ml調到4.5×105cfu/ml，將稀釋好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；接種菌液后，培養(yǎng)板于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，觀察生長情況。待陰性對照孔生長良好后，把板1000rpm離心10min。吸出150μl培養(yǎng)基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃溫箱4小時，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；培養(yǎng)板37℃放置12小時后，用酶標儀于波長595nm，參考波長655nm下，測定OD值。通過計算得到樣品新型殺微生物劑體對白色念珠菌的抑制活性。
抑制率(％)＝(1-實驗孔OD值/對照孔OD值)×1003、PRA法測定新型殺微生物劑體外對HSV病毒的抑制作用將Vero細胞懸液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；待細胞單層鋪滿24孔板后，每孔加200μl病毒上清或培養(yǎng)基，輕搖，使病毒稀釋液和細胞單層充分接觸，37℃，5％CO2孵育1小時；用RPMI1640對藥物作兩倍稀釋，設置阿昔洛韋做陽性對照；棄培養(yǎng)基，加入PBS洗板；加入未凝固的瓊脂糖覆蓋培養(yǎng)基(A、B混和液)，每孔1ml。加入稀釋好的待測藥液，每孔0.5ml，其中第6孔(病毒生長孔)和第12孔(細胞生長孔)不加；置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。然后用2％甲醛固定細胞10min；加入700μl龍膽紫染液，染色20min；用自來水輕輕洗滌3次，倒置涼干，在倒置顯微鏡下計數(shù)空斑。通過計算得到樣品新型殺微生物劑體對HSV病毒的抑制活性。
4、MTT法檢測新型殺微生物劑體外對Vero細胞的毒性作用在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測化合物用培養(yǎng)基2倍稀釋。作7個稀釋度，每孔100μl，設兩個重復孔。同時設置不含化合物的細胞對照組和空白組及阿昔洛韋陽性對照；離心(1000rpm，10min)，用完全培養(yǎng)基重懸后每孔加入100μl(4×105/well)懸液；置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。然后將96孔細胞培養(yǎng)板低速離心，取150μl培養(yǎng)上清，加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育過夜；用酶標儀測定各孔的OD值。通過計算得到樣品新型殺微生物劑在體外對細胞的存活率的影響，了解其毒性作用。
名詞解釋TCID50(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培養(yǎng)細胞出現(xiàn)CPE的病毒上清稀釋度；IC50對50％的宿主細胞產生毒性的樣品的濃度；EC50具有50％合胞體形成抑制率的樣品的濃度；治療指數(shù)(therapeutic index，TI值)為IC50/EC50的比值，治療指數(shù)達到100以上的化合物則視為有抗病毒活性。
具體實施例方式下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質內容，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
實施例1β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物的制備方法根據已公開專利98118102.3方法制備，取青陽參(Cynanchum otophyllum)植物的根500克，粉碎成粉末后用熱水(94℃)浸提2-3次，合并浸提液，冷卻靜置4小時，離心沉淀(4000次/分)，傾瀉出上層液，沉淀物除去棄之。上層液用其2-3倍體積的甲醇加入，搖動攪拌即有白色絮狀的多糖沉淀，放置過夜，上層液澄清，下層沉淀緊密。用吸液管吸去上層液，下層沉淀離心分離，棄去上層液，下層沉淀物轉移至抽濾漏斗抽氧過濾，濾出的沉淀先用丙酮洗滌，后用乙醚洗滌及壓濾，沉淀物在真空干燥器內(器內有五氧化二磷吸溫劑)抽氣真空干燥6小時，就得白色多糖10克。
實施例2新型殺微生物劑體外抗HIV作用檢測的實驗在96孔培養(yǎng)板上，將HIV-1(H9/HIV-1IIIB，由英國MRC惠贈，按常規(guī)方法復蘇，培養(yǎng)，收集，分裝和凍存)貯存液作5倍稀釋，共8梯度，每個梯度設6孔，同時設置對照組。每孔加入C8166細胞(為T淋巴細胞系，由英國Medical ResearchCouncil(MRC)，AIDS Reagent Project惠贈)50μl(2×104/孔)，每孔終體積為200μl。37℃，5％CO2培養(yǎng)。第三天補加新鮮完全培養(yǎng)基(RPMI-1640)100μl，第七天在倒置顯微鏡下觀察每孔中病毒誘導的細胞致病變效應(Cytopathic effect，CPE)，以每孔是否有合胞體的形成來確定；按Reed & Muench方法計算病毒的TCID50(50％Tissue culture infectious dose)，即引起50％培養(yǎng)細胞出現(xiàn)CPE的病毒上清稀釋度。再將96孔細胞培養(yǎng)板低速離心后，小心吸去150μl上清，然后每孔加5mg/ml MTT溶液(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)；SDS(Sodium Dodecyl sulfate)；DMF(N，N’-Dimethyl formamine)20μl，37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4小時，每孔加100μl 20％SDS-50％DMF，37℃孵育過夜，用Bio-Rad 3550 ELISA儀(測定波長為595nm；參考波長為655nm)檢測。取4×105/ml C8166細胞懸液100μl與不同濃度的樣品溶液混合，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天或五天，然后測定其細胞毒性IC50(50％ inhibitionconcentration)。在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測樣品用培養(yǎng)基進行5倍稀釋，共八個稀釋度，每孔100μl，設2個重復孔，同時設置正常細胞對照。對于HIV感染的細胞。每孔加4×105/ml的C8166細胞80μl，然后每孔加入20μl HIV-1上清，每孔的終體積為200μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。感染后第3天觀察樣品對合胞體形成的影響。在倒置顯微鏡下，計數(shù)HIV-1誘導C8166細胞形成的合胞體數(shù)。EC50(50％ effective concentration)為抑制合胞體形成達50％時的樣品的濃度。得到以下的結果合胞體形成法測新型殺微生物劑的抗HIV-1IIIB作用和MTT法測對C8166細胞的毒性作用

實施例3新型殺微生物劑對HSV-1的抑制作用和對Vero細胞的毒性作用一、PRA法測定新型殺微生物劑對HSV-1的抑制作用1、將Vero細胞懸液加入24孔板(2-4×105/well)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；2、待細胞長成致密單層，鋪滿24孔板板底后，快速融解HSV-1，然后每孔加200μl病毒上清或培養(yǎng)基，輕晃板，使病毒稀釋液和細胞單層充分接觸，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1小時；
3、另一塊板中用RPMI1640對藥物作兩倍稀釋，用阿昔洛韋做陽性對照；4、小心吸出培養(yǎng)基(注意不要碰壁)，每孔加入1mlPBS輕輕洗板一次；5、加入未凝的覆蓋培養(yǎng)基(A、B混和液)，每孔1ml。及時加入稀釋好的待測藥液，每孔0.5ml，6孔(病毒生長孔)和12孔(細胞生長孔)不加；ARPMI1640+2％FCS 12ml37℃水浴保溫B1％瓊脂糖(現(xiàn)配) 13ml60℃水浴保溫6、置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。第三天移出培養(yǎng)基，并每孔加入1ml2％甲醛固定細胞，10min；7、加入700μl龍膽紫染液，染色20min；8、移出染液，用自來水輕輕洗滌3次，倒置涼干，在倒置顯微鏡下計數(shù)空斑。
根據下例公式計算化合物對HSV-1的抑制率

二、MTT法檢測新型殺微生物劑對Vero細胞的毒性作用1、在96孔平底培養(yǎng)板上，將待測新型殺微生物劑用培養(yǎng)基進行2倍稀釋。共7個稀釋度，每孔100μl，設兩個重復孔。同時設置不含新型殺微生物劑的細胞對照組和空白組及阿昔洛韋陽性對照；2、離心Vero細胞(1000rpm，10min)，用完全培養(yǎng)基重懸后每孔加入100μl(4×105/well)懸液；3、置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)三天。第三天將96孔細胞培養(yǎng)板低速離心后，吸取150μl培養(yǎng)上清，再加入25μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時左右，加入20％SDS-50％DMF(pH4.7)，孵育過夜；4、用酶標儀測定各孔的OD值，根據下面公式計算出細胞存活率

得到以下的試驗結果表1 新型殺微生物劑對HSV-1的抑制作用和對Vero細胞的毒性作用

實施例4MTT法測定新型殺微生物劑對白色念珠菌的抑制作用1、取待新型殺微生物劑10mg，用100μl DMSO助溶后，滴加900μl沙保氏培養(yǎng)基，充分混合后，使?jié)舛葹?0mg/ml，過濾除菌，置4℃保存；2、待試新型殺微生物劑使用前稀釋至合適的濃度(96孔培養(yǎng)板)注第8孔加不含藥的沙保氏培養(yǎng)基100μl，作陰性對照；3、第9孔加200μl生理鹽水，作空白對照，設三孔重復。每系列孔(除空白和生長對照系列外)取100μl給下一孔，最終留100μl，余下的棄去。
4、用頭孢菌素作陽性對照，濃度稀釋同待測藥物稀釋；5、用沙保氏培養(yǎng)基把菌懸液濃度從4.5×106cfu/ml調到4.5×105cfu/ml，將稀釋好的菌液加入板中，每孔100μl，第9孔不加；6、接種菌液后，培養(yǎng)板于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，觀察生長情況。待陰性對照孔生長良好后，把板1000rpm離心10min。吸出150μl培養(yǎng)基。每孔各加5mg/ml的MTT(含1mM甲萘醌)25μl，放入37℃溫箱4小時，然后各孔加20％SDS-50％DMF(pH4.7)100μl；7、培養(yǎng)板37℃放置12小時后，用酶標儀于波長595nm，參考波長655nm下，測定OD值。根據下面公式計算出化合物對白色念珠菌的抑制作用；8、抑制率(％)＝(1-實驗孔OD值/對照孔OD值)×1009、MIC90＝抑制率高于90％的濃度-(抑制率高于90％的濃度-抑制率低于90％的濃度)×(高于90％的抑制率-90)/(高于90％的抑制率-低于90％的抑制率)得到以下結果MTT法測定新型殺微生物劑對白色念珠菌的抑制作用

權利要求
1.一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，是用硝酸鑭和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物作為原料，以重量比為1∶1000至1000∶1配制而成。
2.權利要求1所述的一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，硝酸鑭和β-D-(1-4)-葡聚糖硫酸酯化合物為藥效部分，按藥效部分與賦型劑重量比為1∶100～1∶1000000的比例加入賦型劑，制成片劑、乳劑、膠囊、凝膠。
3.權利要求1所述的一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，在抗艾滋病毒傳播中的應用。
4.權利要求1所述的一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，在抗HSV傳播中的應用。
5.權利要求1所述的一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，在抗白色念珠菌傳播中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預防人艾滋病毒和其它病原體性傳播的新型殺微生物劑，具體地，是硝酸鑭和來源于青陽參的β－D－(1－4)－葡聚糖硫酸酯化合物配制而成的復方制劑。此復方制劑可用于預防人艾滋病毒、HSV、白色念珠菌的性傳播，而且毒性小、應用廣，是優(yōu)良的殺微生物劑。
文檔編號A01N59/16GK1533778SQ0312116
公開日2004年10月6日 申請日期2003年3月31日 優(yōu)先權日2003年3月31日
發(fā)明者賁昆龍 申請人:昆明中海潮生物工程有限公司