專利名稱：乙型肝炎核心抗原的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎核心抗原的融合蛋白、含有所述蛋白的顆粒、編碼所述蛋白的核酸分子、生產(chǎn)所述蛋白的方法、包含所述蛋白的藥用組合物以及所述蛋白在預(yù)防和治療接種中的運用。
由于HBcAg蛋白的分子結(jié)構(gòu)，使得該蛋白自動裝配成顆粒，因此HBcAg是一種用于呈遞表位的優(yōu)良載體。每個顆?；蛘哂?80個單體多肽拷貝形成，或者由240個單體多肽拷貝形成。在所述單體于宿主細胞中達到合適的濃度時，所述單體形成一種直徑大約27nm的顆粒。結(jié)構(gòu)研究表明由殘基68至殘基90構(gòu)成的區(qū)域內(nèi)的氨基酸，在所述顆粒表面上形成一種突起結(jié)構(gòu)，稱為e1環(huán)。兩個單體通過二硫鍵連接而形成一種二聚體突起，最為暴露的氨基酸位于位置80(在e1環(huán)的中心)。
EP-A-421635(The Wellcome Foundation Limited)描述了允許插入外源表位到e1環(huán)而不改變該蛋白形成顆粒之潛能的HBV核心基因的修飾。在這個位點的插入，允許在由所述蛋白二聚體形成的每個突起的尖端上，最大限度地暴露所插入的表位。由于每個顆粒有大約180個或240個單體拷貝，因而每個顆粒能夠呈遞180個或240個所關(guān)注(of interest)表位的拷貝。
因此，本發(fā)明提供一種包含HBcAg串聯(lián)拷貝的蛋白。該蛋白通常是一種包含二個HBcAg拷貝的二聚體?？梢詫⒁环N異源表位插入到一個或更多個HBcAg拷貝的e1環(huán)中。所述蛋白裝配成顆粒；所述顆粒在其表面上呈遞在e1環(huán)中插入的異源表位，并且在人和動物的預(yù)防接種和治療接種方面是有用的。發(fā)明詳述所述蛋白本發(fā)明蛋白的基本構(gòu)件是HBcAg，該HBcAg具有183個或185個氨基酸(aa)，所述氨基酸數(shù)取決于HBV的亞型。在SEQ ID No.2中顯示了加上29個氨基酸前序列的、awy亞型之183個氨基酸的蛋白序列。成熟的HBcAg從位置30的Met殘基延續(xù)到C-末端盡頭的Cys殘基，從位置1至29的序列是一種前序列。
所述蛋白通常僅包含構(gòu)成一個二聚體的二個HBcAg拷貝，因為HBcAg二聚體形成核心顆粒的結(jié)構(gòu)構(gòu)件。但是，該蛋白可以包含另外的HBcAg拷貝。因此，該蛋白可包含2至8個拷貝或2至4個拷貝的HBcAg。使用多于二個的拷貝則增加所述系統(tǒng)的靈活性，例如，使用三個拷貝則允許三種不同的拷貝被插入到本發(fā)明蛋白中的三個e1環(huán)中，并因此擴大由本發(fā)明的蛋白所引起的免疫應(yīng)答的范圍。
通常以頭尾相接方式將所述HBcAg單位連接在一起，即將一個單位的C-末端連接到鄰近單位的N-末端上?？梢酝ㄟ^共價鍵(例如肽鍵)直接連接所述的單位，但最好用一種接頭連接它們，所述接頭隔開相鄰近的單位，且因此防止破壞鄰近單位包裝的任何問題。在下面討論該接頭的性質(zhì)。
本發(fā)明蛋白中的一個或更多個HBcAg單位可以是天然全長的HBcAg。但是，通常至少有一個單位是HBcAg的修飾形式，例如，通過在e1環(huán)中插入一個異源表位而修飾的HBcAg。在按照本發(fā)明的二聚體中，可以修飾一個HBcAg單位，而另一單位可以是天然的HBcAg。
通常，選擇任何修飾而使得不影響HBcAg的構(gòu)象及其裝配成顆粒的能力。在所述蛋白中的、對于保持該蛋白構(gòu)象不重要的位點上，進行這樣的修飾，例如，在e1環(huán)、C-末端和/或N-末端上。HBcAg的e1環(huán)可容許插入例如1至120個氨基酸，而不破壞該蛋白的顆粒形成能力。
可以通過取代、插入、缺失或延伸，來修飾HBcAg序列。插入、缺失或延伸的規(guī)模例如可以是1至200個氨基酸、3至100個氨基酸或6至50個氨基酸。在HBcAg序列長度的范圍內(nèi)，取代可涉及多達例如1、2、5、10、20或50個氨基酸的許多氨基酸。延伸可以發(fā)生在HBcAg的N-末端或C-末端。缺失可以發(fā)生在所述蛋白的N-末端、C-末端或在內(nèi)部位點。可以在該蛋白序列中的任何位置進行取代。也可以在該蛋白序列中的任何點進行插入，但一般在該蛋白表面暴露的區(qū)域例如e1環(huán)中進行。插入的序列可攜帶異源表位。對于每個HBcAg單位，可進行多過一種的修飾。因此，進行末端延伸或缺失并且還進行內(nèi)部插入，則是可能的。例如，可在C-末端進行截短而在e1環(huán)中可進行插入。
取代一般會是保守的，且可以例如按照下表進行；在該表中，在第二欄中的同一框中的氨基酸且最好是在第三欄中的同一行中的氨基酸，可以被相互取代。
優(yōu)選本發(fā)明蛋白中的HBcAg序列的每個部分與天然HBcAg蛋白之相應(yīng)序列具有至少70％的序列同一性，所述天然HBcAg蛋白例如具有SEQ ID No.2中所示序列的蛋白。更優(yōu)選所述同一性為至少80％、至少90％、至少97％、至少98％或至少99％。測定蛋白序列(和核酸序列)同一性的方法是本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的。例如，UWGCG軟件包提供BESTFIT程序(Devereux等，(1984)Nucleic Acids Research 12，第387-395頁)。類似的，可以用PILEUP和BLAST算法來排齊序列(例如，如同在Altschul S.F.(1993)J. Mol.Evol.36290-300和Altschul S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215403-10中描述的)。
所述HBcAg的e1環(huán)是在位置68至90處，可以在這些位置之間的任何地方插入異源表位。優(yōu)選在位置69至90、71至90或75至85的區(qū)域中插入表位。更優(yōu)選的是在氨基酸殘基79和80之間、或在殘基80和81之間插入表位。當(dāng)插入一種異源表位時，可以保留HBcAg的全序列；或者，可以缺失掉e1環(huán)序列的全部或部分，且用異源序列來取代。因此，可以用異源表位取代氨基酸殘基69至90、71至90或75至85。在異源表位取代e1環(huán)序列的情況下，該表位通常不比它所取代的序列短。
HBcAg之C-末端的截短通常不會超過氨基酸144，因為如果進行任何進一步的截短，則顆?？赡懿恍纬?。因此，缺失的氨基酸可以包括例如氨基酸144至C-末端氨基酸(氨基酸183或185)、氨基酸150至C-末端氨基酸、氨基酸164至C-末端氨基酸或氨基酸172至C-末端氨基酸。HBcAg的C-末端結(jié)合DNA，且因此C-末端的截短，則減少或完全除去來自HBcAg及HBcAg雜種蛋白之制備物的DNA。
本發(fā)明的蛋白形成顆粒，所述顆粒最好類似由天然HBcAg形成的顆粒。本發(fā)明的顆粒一般直徑至少為10nm的，例如，直徑為10-50nm或直徑為20-40nm，但最好其直徑約為27nm(這是天然HBcAg顆粒的大小)。它們包含多個HBcAg單位，例如，從150個至300個單位，但通常將它們選定為大約180個或大約240個單位(這些是天然HBcAg顆粒中的單位數(shù))。在本發(fā)明的蛋白為一種二聚體的情況下，這意味著所述顆粒中的蛋白單體數(shù)可以是從75到150，但通常是大約90或約120。
在鄰近的HBcAg單位之間的接頭一般是一條長度至少1.5nm(15)的氨基酸鏈，例如，1.5-10nm、1.5-5nm或1.5-3nm。它可以包含例如4至40個氨基酸或10至30個氨基酸，優(yōu)選包含15到21個氨基酸。所述接頭通常是柔性的。該接頭中的氨基酸可包括例如甘氨酸、絲氨酸和/或脯氨酸，或者，例如可完全由甘氨酸、絲氨酸和/或脯氨酸組成。一種優(yōu)選的接頭包含一個或更多個的序列GlyGlySer(GGS)的重復(fù)?；蛘撸鼋宇^可包含一個或更多個GlyPro(GP)二肽重復(fù)。所述重復(fù)數(shù)可以例如是從1至18，優(yōu)選從3到12。在GGS重復(fù)的情況下，已發(fā)現(xiàn)使用5、6或7個重復(fù)，則允許形成顆粒。該接頭可以相當(dāng)于抗體的鉸鏈區(qū)，有人認為這個鉸鏈區(qū)在抗體的抗原結(jié)合域與尾域之間提供一個柔性接合點。
正如上面表明的，可以將一種異源表位插入到本發(fā)明蛋白中的一個或更多個HBcAg拷貝中，優(yōu)選插入到e1環(huán)中?！爱愒础北砦皇且环N正常情況下不位于其在HBcAg中所處位置的表位；它通常來自一種不同于HBcAg的蛋白，但是，它可以來自HBcAg中的不同的位置。所述表位包括一種引起免疫應(yīng)答的氨基酸序列。該表位可以是構(gòu)象表位或線性表位。它可以例如是在6至120個氨基酸、6至50個氨基酸或6至20個氨基酸的序列中。本發(fā)明的一個主要優(yōu)點是本發(fā)明允許在大序列上攜帶的表位被插入到e1環(huán)中；例如在來自30至120個氨基酸、40至120個氨基酸或60至120個氨基酸的序列上。
本發(fā)明的蛋白可包含不止一種異源表位，例如多達2、3、5或8種異源表位，而在這種情況下，則所述的表位可以存在于相同或不同的HBcAg單位中。在每個HBcAg單位之中可以插入不止一個拷貝的表位，例如可插入2至8個拷貝。在本發(fā)明蛋白中有兩個或更多個的異源表位的情況下，所述表位可以來自相同或不同的生物，且可以來自相同或不同的蛋白。
所述表位可以是一種T-細胞表位或B-細胞表位。如果它是一種T-細胞表位，則它可以是一種細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)表位或是一種T-輔助細胞(Th)表位(例如一種Th1或Th2表位)。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述表位中的一種為T-輔助細胞表位且另一種是B-細胞表位或CTL表位。T-輔助細胞表位的存在增強對B-細胞表位或CTL表位的免疫應(yīng)答。
表位的選擇取決于所希望接種以預(yù)防的疾病。該表位例如可以來自一種病原生物、一種癌相關(guān)抗原或一種變應(yīng)原。所述病原生物可以例如是一種病毒、一種細菌或一種原生動物。
其表位可以被插入的病原體的實例，包括甲型肝炎病毒(HAV)、HBV、HCV、流感病毒、口蹄疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、單純皰疹病毒、狂犬病毒、貓白血病病毒、人免疫缺陷病毒1型(HIV1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人鼻病毒、登革病毒、黃熱病毒、人乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒、惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)(瘧疾的病因)以及細菌，所述細菌例如分枝桿菌屬(Mycobacteria)、博德特氏菌屬(Bordetella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、弧菌屬(Vibrio)、嗜血菌屬(Haemophilus)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)和布魯氏菌屬(Brucella)。具體地講，所述細菌可以是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriatuberculosis)-結(jié)核病的病因、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)或副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)-百日咳的病因、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)-幾種動物物種中的沙門氏菌病的病因、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)-人傷寒的病因、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)-人類食物中毒的病因、豬霍亂沙門菌(Salmonella choleraesuis)-豬沙門氏菌病的病因、都柏林沙門氏菌(Salmonella dublin)-牛、尤是在新生小牛的系統(tǒng)性和腹瀉性疾病的病因、大腸桿菌(Escherichia coli)-人類食物中毒的病因、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)-腦膜炎的病因、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)-淋病的病因、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)-人類中從胃腸炎到致死性敗血癥性疾病之范圍內(nèi)的一系列疾病的病因以及流產(chǎn)布魯菌(Brucella abortus)-牛中流產(chǎn)和不育的病因以及人類中稱為波狀熱病癥的病因。
供本發(fā)明之用的候選表位的實例包括來自下面抗原的表位HIV抗原gp 120、gp 160、gag、pol、Nef、Tat以及Ref；瘧疾抗原CS蛋白和子孢子表面蛋白2；流感抗原HA、NP和NA；皰疹病毒抗原EBVgp340、EBV gp85、HSV gB、HSV gD、HSV gH、HSV早期蛋白產(chǎn)物、巨細胞病毒gB、巨細胞病毒gH以及IE蛋白，gP72；人乳頭瘤病毒抗原E4、E6和E7；呼吸道合胞病毒抗原F蛋白、G蛋白以及N蛋白；，百日咳博德特氏菌的百日咳毒素(pertactin)抗原；腫瘤抗原癌CEA、癌相關(guān)粘蛋白、癌P53、黑素瘤MPG、黑素瘤P97、MAGE抗原、癌Neu癌基因產(chǎn)物、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺相關(guān)抗原、ras蛋白、以及myc；以及家塵螨(house dust mite)變應(yīng)原。
特別優(yōu)選的表位是來自HBV的前S1區(qū)、前S2區(qū)、S區(qū)或核心抗原的那些表位。將整個前S1區(qū)和/或整個前S2區(qū)插入到HBcAg中是可能的，但通常僅插入所述區(qū)域之一的一部分。所插入的部分在長度方面一般為至少6個氨基酸，例如，從6至120個氨基酸、從20至80個氨基酸或從20至50個氨基酸。該插入片段可包含例如在前S1位置1-9、10-19、20-29、30-39、40-49、50-59、60-69、70-79、80-89、90-99、100-109或110-119的殘基，或者可包含例如在前S2位置120-129、130-139、140-149、150-159、160-169或170-174的殘基。特別優(yōu)選的插入片段是前-S1殘基20-47和前-S2殘基139-174。制備本發(fā)明的蛋白一般用重組DNA技術(shù)來制造本發(fā)明的蛋白。本發(fā)明包括編碼本發(fā)明蛋白的核酸分子(例如DNA或RNA)，例如一種表達載體?？梢杂貌僮骱怂岬囊阎夹g(shù)來制備所述的核酸分子。一般而言，制備編碼兩個HBcAg單位的分開的兩個DNA構(gòu)成物，然后，通過重疊PCR，將其結(jié)合在一起。
通過在表達所述蛋白的條件下，培養(yǎng)含有編碼該蛋白之核酸分子的宿主細胞，且回收所述的蛋白，則可生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。合適的宿主細胞包括例如大腸桿菌的細菌、酵母、哺乳動物細胞及其它真核細胞，所述其它真核細胞例如昆蟲Sf9細胞。
按照本發(fā)明的、構(gòu)成載體的核酸分子可以例如是質(zhì)?；虿《据d體。它們可包含一個復(fù)制起始點、一個用于所述蛋白編碼序列表達的啟動子、一個例如增強子的啟動子的調(diào)節(jié)物、一個轉(zhuǎn)錄終止信號、一個翻譯起始信號和/或一個翻譯終止信號。所述載體也可以包含一種或更多種選擇標記基因，在細菌質(zhì)粒的情況下例如一種氨芐青霉素抗性基因，或者，在哺乳動物載體的情況下例如新霉素抗性基因。可以在體外使用載體，例如，用于生產(chǎn)RNA或用來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。也可以使該載體適應(yīng)于在體內(nèi)使用；例如用于基因療法的方法或DNA接種。
可挑選與所述表達載體設(shè)計用于的宿主細胞相容的啟動子、增強子和其它調(diào)節(jié)表達的信號。例如，可使用原核啟動子，特別是那些適合于用于大腸桿菌菌株(例如大腸桿菌HB101)的啟動子?？梢允褂庙憫?yīng)周圍環(huán)境(例如厭氧條件)的變化而被誘導(dǎo)其活性的啟動子。最好可使用htrA或nirB啟動子。特別可使用這些啟動子，在例如用作疫苗的一種減毒細菌中表達所述的蛋白。如果在哺乳動物細胞中進行本發(fā)明蛋白的表達，不論體外還是體內(nèi)進行，則可以使用哺乳動物的啟動子。也可以使用組織特異性啟動子，例如肝細胞特異性啟動子。同樣可以使用病毒啟動子，所述病毒啟動子例如莫洛尼鼠類白血病病毒的長末端重復(fù)序列(MMLVLTR)、勞斯肉瘤病毒(RSV)的LTR啟動子、SV40的啟動子、人巨細胞病毒(CMV)的IE啟動子、單純皰疹病毒的啟動子以及腺病毒的啟動子。所有這些啟動子在本技術(shù)領(lǐng)域中是容易得到的。
使用用于純化蛋白的常規(guī)技術(shù)，可純化按照本發(fā)明的蛋白。例如可以以純化了的、純的或分離的形式，提供所述的蛋白。為了用于疫苗，通常必須以高標準的純度來提供該蛋白；例如，以它構(gòu)成所述蛋白構(gòu)成制劑中蛋白的80％以上、90％以上、95％以上或98％以上的標準提供。然而，可能理想的是將所述蛋白與最終的疫苗制劑中的其它蛋白混合。預(yù)防疾病的接種本發(fā)明蛋白的主要用途是作為治療性或預(yù)防性疫苗。本發(fā)明包括一種包含本發(fā)明蛋白、一種本發(fā)明的顆?；虮景l(fā)明核酸分子以及一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥用組合物(例如一種疫苗組合物)。
預(yù)防性接種的原理是在宿主中誘發(fā)免疫應(yīng)答，以致于在該宿主中產(chǎn)生一種免疫學(xué)記憶。這意味著如果使宿主暴露于該致病性強的病原體，則該宿主發(fā)動一種有效的(保護性的)免疫應(yīng)答，即一種滅活和/或殺死該病原體的免疫應(yīng)答。本發(fā)明能夠構(gòu)成一種防備一系列疾病和病癥的預(yù)防性疫苗的基礎(chǔ)，所述疾病和病癥例如HBV、HAV、HCV、流感性感冒、口蹄疫、脊髓灰質(zhì)炎、皰疹、狂犬病、艾滋病、登革熱、黃熱病、瘧疾、結(jié)核病、百日咳、傷寒、食物中毒、腹瀉、腦膜炎及淋病。挑選本發(fā)明蛋白中的表位，以便與所述疫苗計劃提供的保護所針對的疾病相稱。
治療性接種的原理是刺激宿主的免疫系統(tǒng)，以減輕或根除疾病或病癥。有許多可能對治療性接種敏感的疾病和病癥，例如包括慢性HBV和慢性HCV的慢性病毒病、癌癥以及變態(tài)反應(yīng)；所述變態(tài)反應(yīng)例如哮喘、特異性變態(tài)反應(yīng)、濕疹、鼻炎及食物過敏反應(yīng)。
如果被感染宿主的免疫系統(tǒng)沒能清除掉病毒，則產(chǎn)生慢性病毒??；從而使該病毒可以在宿主中持續(xù)存在很長時期?？梢赃\用本發(fā)明來誘導(dǎo)慢性感染個體的免疫系統(tǒng)，以便清除該病毒。例如，據(jù)認為患有慢性肝炎的患者有不適當(dāng)?shù)腡-細胞反應(yīng)，且激發(fā)適當(dāng)?shù)腡-細胞反應(yīng)則能清除該病毒。因此，為了用本發(fā)明治療慢性病毒性肝炎，可以將T-細胞表位插入到本發(fā)明的蛋白中，所述T-細胞表位例如來自HBV之前S1區(qū)和前S2區(qū)的T-細胞表位。
類似地，在癌癥的情況下，認為增強對腫瘤抗原的T-細胞應(yīng)答可幫助免疫系統(tǒng)破壞該腫瘤。相信過敏性疾病至少部分是由于一種失衡的T-細胞反應(yīng)所引起，在所述T-細胞反應(yīng)中，炎性Th2反應(yīng)超過拮抗性的Th1反應(yīng)；且相信因此可通過增強Th1反應(yīng)，來治療過敏反應(yīng)。按照本發(fā)明，通過使用包含一種激發(fā)Th1反應(yīng)之異源表位的蛋白，可以實現(xiàn)這一點。
可供包含在本發(fā)明藥用組合物中的合適載體和稀釋劑，是等滲鹽水溶液；例如磷酸緩沖鹽溶液。該組合物通常會包含一種佐劑，例如氫氧化鋁?？梢砸杂糜谧⑸涞囊后w形式來配制該組合物。所述組合物包含預(yù)防或治療有效量的該蛋白、顆粒或核酸。一般而言，按體重計以0.1-200μg、優(yōu)選1-100μg、更優(yōu)選10-50μg的劑量，給予所述蛋白或顆粒。用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，或使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的載體，可直接給予作為裸露核酸構(gòu)成物的本發(fā)明核酸。所給予的核酸量一般在1μg至10mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選從100μg至1mg的范圍內(nèi)。可以按單劑量方案，或可按多劑量方案，例如按2至32劑或按4至16劑，來給予該疫苗。上述的給予途徑和給予的劑量僅僅作為一種指導(dǎo)，且該途徑和劑量終究可以由醫(yī)師自行處理。實驗部分圖2構(gòu)建異源串聯(lián)核心和同源串聯(lián)核心的示意圖。線條表示所述蛋白的一級結(jié)構(gòu)。在HBcAg(氨基酸1-144)的裝配域內(nèi)，指出了e1環(huán)(黑色矩形)以及參與二聚體內(nèi)接觸(淺陰影)和二聚體間接觸(黑色陰影)的區(qū)域。用+代表富含精氨酸的核酸結(jié)合域。以箭頭形式表示引物(表1)。
圖3來自同源串聯(lián)核心顆粒之蔗糖密度梯度分離部分的12％SDS-PAGE。
圖4具有一種包含5個GGS重復(fù)之接頭的、異源串聯(lián)核心顆粒的電子顯微照片。
圖5顯示異源串聯(lián)核心在大腸桿菌中有效表達的蛋白質(zhì)印跡。所述的核心分別包含作為接頭的5個GGS重復(fù)、6個GGS重復(fù)、7個GGS重復(fù)(GGS5、GGS6和GGS7)。
圖6串聯(lián)核心顆粒的冷凍電子顯微鏡術(shù)結(jié)果。圖6(a)顯示與天然顆粒(中間的顆粒)相比的串連核心顆粒(左邊的顆粒)。圖6(a)的右邊部分顯示串聯(lián)核心顆粒中核心抗原的C-末端部分。圖6(b)顯示串聯(lián)核心顆粒結(jié)構(gòu)的一部分與天然顆粒相符合。
方法HBV核心顆粒結(jié)構(gòu)的研究暗示或許可以使用至少1.5nm(15)的柔性接頭來連接二聚體對中的二個蛋白，而不破壞其結(jié)構(gòu)的完整性(

圖1)。因此，通過重疊PCR來制備構(gòu)成物；在所述構(gòu)成物中，上游的核心蛋白被截短到殘基149，然后，借助于5、6或7個拷貝的GlyGlySer(GGS)重復(fù)序列，將其連接到一個下游拷貝上(圖2)。該下游拷貝或者是全長的核心蛋白，或者在氨基酸149處被截短而除去富含Arg之C-末端區(qū)域。表1給出了用來構(gòu)建各種各樣串聯(lián)的HBV核心的寡核苷酸序列。
將構(gòu)成物克隆到ptrc99A表達載體中，且將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109中，并用IPTG誘導(dǎo)。然后，通過離心收獲細胞，將其重懸浮PBS中，并超聲處理二次。使含有所表達的可溶性串聯(lián)核心之裂解液達到30％的硫酸銨飽和度，并通過離心收集沉淀的蛋白；將收集的蛋白重懸浮于PBS中，且對著磷酸緩沖鹽溶液透析。將澄清的裂解液裝填在15-45％的線性蔗糖梯度上，并在4℃以28,000rpm離心達4小時。從離心管的底部將梯度分級分離成2ml的等分試樣，并通過SDS-PAGE和使用抗HBV核心蛋白的單克隆第一抗體(mAb13)之蛋白質(zhì)印跡，來分析它們。
把HBV核心顆粒的制備物點樣在包碳載網(wǎng)上，用乙酸雙氧鈾將其負染色，并用透射電鏡術(shù)觀察。運用冷凍電子顯微鏡術(shù)來確定所述核心顆粒的結(jié)構(gòu)。表1用于將串聯(lián)的HBV核心基因克隆到ptrc99A中的寡核苷酸引物的序列
aNcoI限制酶切位點用粗體表示。bHindIII限制酶切位點用粗體表示。結(jié)果具有5、6或7個GGS拷貝的串聯(lián)HBV核心蛋白全都得以成功地表達，且顯示它們以所期望的遷移率在聚丙烯酰胺凝膠中遷移。每種蛋白裝配成核心顆粒，正如由其在蔗糖密度梯度中的沉降(圖3)以及其在電子顯微鏡中的外觀(圖4)所證明的。所述顆粒保持了其抗原特性，正如由其在ELISA和蛋白質(zhì)印跡方面的反應(yīng)性(圖5)所表明的。而且，在冷凍電子顯微術(shù)方面，由串聯(lián)核心蛋白所形成的顆粒結(jié)構(gòu)與天然核心顆粒的結(jié)構(gòu)是不能區(qū)別的(圖6)。
序列表<110>細胞技術(shù)藥品歐洲有限公司(MEDEVA EUROPE LIMITED)<120>乙型肝炎核心抗原的融合蛋白<130>N79405A<160>2<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>639<212>DNA<213>乙型肝炎病毒<220><221>CDS<222>(1)..(639)<400>1atg caa ctt ttt cac ctc tgc cta atc atc tct tgt tca tgt cct act 48Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15gtt caa gcc tcc aag ctg tgc ctt ggg tgg ctt tgg ggc atg gac atc 96Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30gac cct tat aaa gaa ttt gga gct act gtg gag tta ctc tcg ttt ttg 144Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45cct tct gac ttc ttt cct tca gta cga gat ctt cta gat acc gcc tca 192Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60gct ctg tat cgg gaa gcc tta gag tct cct gag cat tgt tca cct cac 240Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80cat act gca ctc agg caa gca att ctt tgc tgg ggg gaa cta atg act 288His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95cta gct acc tgg gtg ggt gtt aat ttg gaa gat cca gcg tct aga gac 336Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110cta gta gtc agt tat gtc aac act aat atg ggc cta aag ttc agg caa 384Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125ctc ttg tgg ttt cac att tct tgt ctc act ttt gga aga gaa aca gtt 432Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140ata gag tat ttg gtg tct ttc gga gtg tgg att cgc act cct cca gct 480Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160tat aga cca cca aat gcc cct atc cta tca aca ctt ccg gag act act 528Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175gtt gtt aga cga cga ggc agg tcc cct aga aga aga act ccc tcg cct 576Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190cgc aga cga agg tct caa tcg ccg cgt cgc aga aga tct caa tct cgg 624Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205gaa tct caa tgt tag 639Glu Ser Gln Cys210<210>2<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>2Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210
權(quán)利要求
1.一種蛋白，該蛋白包含乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的串聯(lián)拷貝。
2.一種權(quán)利要求1的蛋白，所述蛋白是兩個HBcAg拷貝的二聚體。
3.一種權(quán)利要求1或2的蛋白，其中所述HBcAg拷貝中的一個或更多個在e1環(huán)中具有一個異源表位。
4.一種權(quán)利要求3的蛋白，其中所有的HBcAg拷貝都在e1環(huán)中具有異源表位。
5.一種權(quán)利要求4的蛋白，其中所有所述拷貝都在e1環(huán)中具有同樣的異源表位。
6.一種權(quán)利要求4的蛋白，其中每個拷貝在e1環(huán)中具有一個不同的異源表位。
7.一種權(quán)利要求3至6中任一項的蛋白，其中所述異源表位或每個異源表位來自乙型肝炎病毒(HBV)的前S1區(qū)或前S2區(qū)。
8.一種權(quán)利要求3至7中任一項的蛋白，其中所述異源表或每個異源表位在e1環(huán)中具有一個10至120個氨基酸殘基的異源序列中。
9.一種上述權(quán)利要求中任一項的蛋白，其中所述HBcAg拷貝中的一個或更多個在C-末端截短。
10.一種上述權(quán)利要求中任一項的蛋白，其中HBcAg的所述串連拷貝用一個接頭連接。
11.一種權(quán)利要求10的蛋白，其中所述接頭至少長1.5nm。
12.一種權(quán)利要求10或11的蛋白，其中所述接頭包含序列GlyGlySer(GGS)的多個拷貝。
13.一種權(quán)利要求12的蛋白，其中所述接頭包含5、6或7個拷貝的序列GGS。
14.一種顆粒，所述顆粒包含上述權(quán)利要求中任一項的蛋白的多個拷貝。
15.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1至13中任一項的蛋白。
16.一種權(quán)利要求15的核酸分子，所述核酸分子為一種表達載體。
17.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求15或16的核酸分子。
18.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1至13中任一項的蛋白的方法，所述方法包括在所述蛋白得以表達的條件下，培養(yǎng)含有編碼所述蛋白之核酸分子的宿主細胞；并回收所述的蛋白。
19.一種藥用組合物，所述組合物包括權(quán)利要求1至13中任一項的一種蛋白、權(quán)利要求14的一種顆?；驒?quán)利要求15或16的一種核酸分子以及一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
20.供人體或動物體的預(yù)防性接種或治療性接種方法之用的權(quán)利要求1至13中任一項的一種蛋白、權(quán)利要求14中的一種顆?；蛘邫?quán)利要求15或16中的一種核酸分子。
21.供人體或動物體抗HBVV的預(yù)防性接種或治療性接種方法之用的權(quán)利要求20的一種蛋白、顆粒或核酸分子。
22.權(quán)利要求1至13中任一項的一種蛋白、權(quán)利要求14中的一種顆?；蛘邫?quán)利要求15或16中的一種核酸分子用于生產(chǎn)用于人體或動物體抗HBV的預(yù)防接種或治療接種的藥物的用途。
23.一種對受治療者進行預(yù)防性接種或治療性接種的方法，該方法包括給予該受治療者權(quán)利要求1至13中任一項的一種蛋白、權(quán)利要求14的一種顆?；蛘邫?quán)利要求15或16的一種核酸分子。
全文摘要
乙型肝炎病毒(HBV)的殼體由單一種類的、自動裝配成顆粒的、稱為核心抗原(HBcAg)的蛋白構(gòu)成。該顆粒是高免疫原性的，且如果將該表位插入到所述顆粒的稱為“e1環(huán)”的表面暴露區(qū)域，則能夠?qū)愒幢砦怀蔬f給免疫系統(tǒng)。所述顆粒的結(jié)構(gòu)構(gòu)件是緊緊相聯(lián)的HBcAg二聚體，在所述二聚體中，鄰近的e1環(huán)是緊密并列的。因此提出如果以單體核心蛋白的形式存在，則插入到e1環(huán)中的序列在構(gòu)象上被限制在裝配出的顆粒中。本發(fā)明試圖通過共價連接核心蛋白為串聯(lián)重復(fù)的形式，例如共價連接為二聚體形式，以便在每個拷貝中能獨立地進行插入，從而來解決這個問題。對于將大序列插入到e1環(huán)中，這是特別有用的；因為它允許將這樣的序列插入到每個串聯(lián)重復(fù)之核心蛋白的僅一個重復(fù)中，從而在裝配中減少潛在的構(gòu)象沖突。另一方面，可以將不同的序列插入到串聯(lián)重復(fù)的每個e1環(huán)中，如此增加HBcAg顆粒作為表位遞送系統(tǒng)的的靈活性。
文檔編號C12N15/09GK1441807SQ01810688
公開日2003年9月10日 申請日期2001年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月7日
發(fā)明者A·格欣, R·吉伯特, D·斯圖爾特, D·羅蘭德斯 申請人:利茲創(chuàng)新有限公司大學(xué)