專利名稱：具備抗血管生成活性的白蛋白變異體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白變異體及其制備方法。
背景技術(shù)：
“血管生成” (angiogenesis) —詞于1787年由英國外科醫(yī)生John Hunter首次提 出。由此，人們發(fā)現(xiàn)“血管生成”與胚胎發(fā)育、組織再生以及慢性炎癥有關(guān)[1]。直到1971年 Folkmani證明“血管生成”與腫瘤生長有關(guān)[2]。從此，“抗血管生成”(anti-angiogenesis) 成為一種新的抗腫瘤治療戰(zhàn)略。血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化調(diào)控是血管生成的關(guān)鍵步驟。已證明前者受酪氨酸蛋 白激酶調(diào)節(jié)。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)受體-2(KDR)與VEGF結(jié)合，導(dǎo)致其受體酪氨 酸蛋白激酶活性被活化，從而啟動一系列后續(xù)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路。這一過程對于調(diào)控內(nèi)皮 細(xì)胞前體分化以及原始血管網(wǎng)絡(luò)的形成至關(guān)重要。因此，抑制KDR的活性是抑制血管生成 的關(guān)鍵點(diǎn)之一。[3]臨床實(shí)驗(yàn)中，許多小分子化學(xué)物質(zhì)可特異性抑制KDR酪氨酸蛋白激酶活性，從而 有顯著的抗血管生成效應(yīng)。然而，臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明這些小分子化學(xué)物質(zhì)毒性副作用較大。 最近，有人用中和抗體技術(shù)阻斷KDR的生物學(xué)活性，實(shí)驗(yàn)證明這些抗體有有效的抗血管生 成作用。進(jìn)一步這些抗體已成功用于臨床腫瘤抗血管生成治療[4]。由于噬菌體顯示技術(shù)(phage-display technology)的廣泛應(yīng)用，人們篩選到許多 具有生物學(xué)活性的多肽[5]，其中一些具有十分有效的藥物學(xué)效應(yīng)。然而，由于小肽分子在 體內(nèi)應(yīng)用的局限性，到目前為止很少有小肽藥物的成功上市。但具有藥物效應(yīng)小肽分子的 發(fā)現(xiàn)，也為進(jìn)一步藥物的設(shè)計(jì)和改造提供了非常有用的基本信息?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ATWLPra肽可 以抵抗VEGF在體外刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并且可在動物體內(nèi)完全阻斷VEGF誘導(dǎo)的血 管生成[6]。然而，這一小分子肽在體內(nèi)半衰期短，用于治療腫瘤效果有限。人白蛋白(人血清白蛋白)是血液中最豐富的蛋白質(zhì)之一，大約濃度為50mg/ ml (600PM)，其半衰期約為19天[11，12]。白蛋白對于維持血液的PH，膠體滲透壓有著非 常重要的作用，同時(shí)它也作為體內(nèi)許多代謝物和脂肪酸的載體。許多藥物進(jìn)入體內(nèi)也利用 白蛋白作為運(yùn)送載體。最近，有人成功地利用白蛋白結(jié)合多肽將小肽藥物附著在白蛋白分 子上，從而大大提高了小肽藥物在體內(nèi)的半衰期和藥物療效作用[13]。也有人將多肽藥物 分子直接與白蛋白一起表達(dá)成融合蛋白，從而利用白蛋白在體內(nèi)的特性提高其多肽藥物在 體內(nèi)的半衰期以及生物學(xué)療效[14]。但是，直接將白蛋白進(jìn)行定向化改造使之具有其他的 活性還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的是現(xiàn)有的ATWLPra肽體內(nèi)半衰期短，用量大的問題。解決該問題的技術(shù)方案是提供一種白蛋白變異體。該白蛋白變異體為白蛋白C末 端的KEQLK肽段突變?yōu)閃LPra肽段而得。
其中，所述的白蛋白為人白蛋白。進(jìn)一步的，上述白蛋白變異體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。本發(fā)明還提供了編碼上述的白蛋白變異體的基因。進(jìn)一步的，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。同時(shí)，本發(fā)明提供了含有上述基因的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。為了制備上述的白蛋白變異體，本發(fā)明還提供了一種制備所述白蛋白變異體的方 法。該方法包括以下步驟a、將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘變成編碼氨基 酸肽段WLPra序列的核苷酸序列，得到白蛋白變異體編碼基因序列；b、將白蛋白變異體編碼基因序列到連接到表達(dá)載體中；C、將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主中進(jìn)行表達(dá)得到白蛋白變異體。其中，上述的表達(dá)載體優(yōu)選為真核表達(dá)載體，宿主細(xì)胞優(yōu)選為真核宿主細(xì)胞。其中，上述的將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘變成 編碼氨基酸肽段WLPra序列的核苷酸序列的誘變方式可以使用定點(diǎn)誘變引物進(jìn)行PCR完成 定點(diǎn)誘變。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供上述的白蛋白變異體或表達(dá)載體在制備 抗血管生成藥物中的用途。同時(shí)本發(fā)明提供了一種抗血管生成藥物，該抗血管生成藥物由 上述的白蛋白變異體或表達(dá)載體添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。具體說來，本發(fā)明直接將人白蛋白分子進(jìn)行突變改造，從而附與產(chǎn)生的白蛋白變 異體具有新的生物學(xué)功能。這不同于通過白蛋白結(jié)合分子將外源藥物分子與白蛋白結(jié)合從 而形成一個(gè)“白蛋白藥物”復(fù)合物；或藥物分子與白蛋白融合在一起形成一種化學(xué)融合蛋白 的現(xiàn)有途徑。本發(fā)明主要通過改變白蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)，在白蛋白分子中通過氨基酸殘 基置換突變，從而產(chǎn)生一種新自然界不存在的白蛋白分子。即將白蛋白C末端的氨基酸殘 基KEQLK(人白蛋白在第565位至569位)采用分子突變方法變成WLPPR，從而在白蛋白分 子中產(chǎn)生了一個(gè)新的ATWLPPR功能結(jié)構(gòu)(人白蛋白C末端的KEQLK殘基的兩端分別相鄰的 殘基分別為T和A)。該白蛋白分子保留有白蛋白分子的基本生物學(xué)活性，同時(shí)也具有突變 引入的新的功能結(jié)構(gòu)所帶來的新活性。本發(fā)明的有益效果在于創(chuàng)造性地將人白蛋白進(jìn)行定位突變，從而在其分子中產(chǎn) 生出一段ATWLPra序列。這一白蛋白變異體具有ATWLPra多肽的功能，并且保留了白蛋白的 分子結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致本發(fā)明白蛋白變異體在體內(nèi)有與野生型白蛋白一樣較長半衰期，同時(shí)可 大劑量在體內(nèi)應(yīng)用。這有利于提高ATWLPra的功能作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明ATWLPPR-白 蛋白變異體具有與ATWLPra在體外相同的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用，且前者具有顯著 更強(qiáng)的體內(nèi)抗血管生成作用。這一 ATWLPPR-白蛋白變異體為抗血管生成藥物的制備提供 了一種新的有效選擇


圖1為PHIL-D2質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)簡2為人白蛋白變異體分離純化電泳圖譜。Lane 1 :DEAE離子交換層析純化樣品； Lane2 抗白蛋白抗體親和層析純化樣品
圖3為ATWLPI3R肽及白蛋白變異體對VEGF與Huvec細(xì)胞結(jié)合的抑制作用。VEGF 可與Huvec細(xì)胞表面VEGF受體結(jié)合。結(jié)合在細(xì)胞表面的VEGF可用細(xì)胞放射結(jié)合測定方法 (見材料和方法)用特異性125I-標(biāo)記的VEGF抗體檢測之。其抗體結(jié)合的量(O.D.)可直接 反映出VEGF結(jié)合在細(xì)胞表面的量。將ATWLPra肽和白蛋白變異體與Huvec細(xì)胞溫育，可明 顯抑制后續(xù)的VEGF與Huvec細(xì)胞的結(jié)合作用。圖4為ATWLPI3R肽及白蛋白變異體對VEGF誘導(dǎo)Huvec細(xì)胞增殖效應(yīng)的抑制作用 結(jié)果。VEGF在體外明顯誘導(dǎo)Huvec細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖作用。其細(xì)胞增殖作用可用摻入的 3H TdR量計(jì)量之。ATWLPI3R肽和白蛋白變異體可明顯抑制VEGF誘導(dǎo)Huvec細(xì)胞中3H_TdR 的摻入量。
圖5為用western-blot結(jié)果表明ATWLPPR-白蛋白變異體對VEGF細(xì)胞信 號傳導(dǎo)的抑制作用。其中+表示這一道用了這種處理，-表示這一道沒有用這種處 理，1道為ATWLPra多肽預(yù)先處理Huvec細(xì)胞，然后用VEGF刺激后的樣品；2道為 ATffLPPR-HAS(ATWLPPR-白蛋白變異體)預(yù)先處理Huvec細(xì)胞，然后用VEGF刺激后的樣品； 3道為ATWLPPR-HAS (ATWLPPR-白蛋白變異體)預(yù)先處理Huvec細(xì)胞，然后用VEGF刺激的樣 品；4道為沒有加活性物質(zhì)處理，也沒有用VEGF刺激的對照樣品。Al為用磷酸化的KDR(Try 1054/1059)單克隆抗體與樣品反應(yīng)的結(jié)果，1、2、4道中 反應(yīng)信號弱，表明磷酸化的KDR少，而第3道信號強(qiáng)，表明KDR被磷酸化。A2為用KDR抗體與各樣品反應(yīng)的結(jié)果，表明各道中均有KDR。A的結(jié)果表示ATWLPI3R白蛋白變異體明顯抑制KDR (血管內(nèi)皮生長因子受體2， VEGF受體2)的酪氨酸磷酸化作用。第Bl行為用磷酸化的-Akt(Ser473)單克隆抗體與樣品反應(yīng)的結(jié)果，1、2、4道中反 應(yīng)信號基本沒有，表明KDR未被磷酸化，而第3道信號強(qiáng)，表明Akt被磷酸化。第B2行為用Akt的抗體與各樣品反應(yīng)的結(jié)果，表明各道中均有Akt。B的結(jié)果表明ATWLPra白蛋白變異體完全抑制了活化AKT (蛋白激酶B)的形成；第Cl行為用磷酸化的-MAPK(Thr202/Tyr204)單克隆抗體與樣品反應(yīng)的結(jié)果，1、 2、4道中反應(yīng)信號基本沒有，表明KDR被磷酸化少，而第3道信號強(qiáng)，表明Akt被磷酸化。第C2行為用MAPK的抗體與各樣品反應(yīng)的結(jié)果，結(jié)果表明各道中均有MAPK。C的結(jié)果表示ATWLPI3R白蛋白變異體有效地抑制了 MAPK蛋白激酶 (mitogen-activatedprotein kinases促分裂素原活化蛋白激酶)的活化。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖，進(jìn)一步說明而不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常 規(guī)條件，例如Sambrook, Russell的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(New York =Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中，所用質(zhì)粒PCRScript、載體PHIL D2購自于Invitrogen公司，菌株 Pichia Pastoris購自于Invitrogen公司。其余化學(xué)試劑均為市售分析純。下述實(shí)施例中，“SEQ ID NO :1”單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解1其為“SEQ IDNO 1所示序列”的簡稱。
實(shí)施例一本發(fā)明ATWLPPR-白蛋白變異體表達(dá)載體的構(gòu)建和蛋白質(zhì)合成與純化從人肝細(xì)胞中分離出mRNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用PCR方法在人白蛋白特異 性引物介導(dǎo)下合成人白蛋白cDNA。將PCR產(chǎn)物克隆到PCRScript質(zhì)粒中。測定插入的人白蛋白cDNA的全長序列，序列為SEQ ID NO. 1所示。進(jìn)一步進(jìn)行體 外誘變。先合成寡聚核苷酸引物5，GAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAtggctgccaccgcgaGCTGTTATGGATGATTTCGCAG CTTTTGTAGAG 3，(SEQ ID NO :5)。同時(shí)合成與之配對的一互補(bǔ)序列引物作為引物對。用前述克隆了人白蛋白cDNA 的PCRScript質(zhì)粒作為模板，在這兩個(gè)引物介導(dǎo)下進(jìn)行定點(diǎn)誘變。如上述SEQ ID NO. 3中 小寫字母所示，將白蛋白中的原來的編碼序列AAAGAGGCAACTGAA(編碼KEQLK)被突變成了 tggctgccaccgcga (WLPPR) o/^Stratagene ^W] StJ Quick ChangeMutagenesis 試劑盒按照說明書進(jìn)行。將篩選到含變異體分子的質(zhì)粒進(jìn)行序列分析，證明原白蛋白相應(yīng) 序列已突變成為WLPra的序列，測序確認(rèn)ATWLPra白蛋白變異體全長cDNA編碼序列如SEQ ID NO 2 所示。
在完成上述突變實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)一步將編碼該白蛋白變異體的cDNA克隆到酵母表達(dá) 載體中去。首先，合成2個(gè)寡聚脫氧核苷酸其序列作為引物，其序列分別為上游引物5，ATCGTTCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC3，(SEQ ID NO 6)；下游引物5，CGATGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTG3，(SEQ ID NO :7)。然后用上述ATWLPra白蛋白變異體cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。在該合引物對 中分別引進(jìn)了上游CSP451酶切點(diǎn)和下游EcoRI酶切點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行CSP451和EcoRI 雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物克隆到PHIL-D2質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)簡圖見圖1)中。將含有插入序列的PHIL-D2質(zhì)粒進(jìn)行序列分析證明PCR方法沒有在ATWLPPR-白 蛋白變異體序列中引入新的突變，確認(rèn)插入的序列為目標(biāo)序列(SEQ ID N0:3)。然后按 InVitrogen公司的pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)試劑盒操作手冊，在酵母中表達(dá)ATWLPPR-白蛋白 變異體蛋白。將含有ATWLPPR-白蛋白變異體的酵母裂解物配制于0. IM磷酸鹽緩沖液(PH6. 8)， 置4°C離心(10000gX30分鐘)除去沉淀物，取上清上樣于DEAE-S印hadex A-50柱。用8 倍柱體積的0. IM磷酸鹽緩沖液洗滌DEAE-S印hadex A-50柱。然后用0. IM磷酸鹽緩沖液 含IOOmM至0. 5MNacl鹽梯度洗脫之，收集洗脫樣品。將收集峰樣品上樣于10% SDS-PAGE gel電泳，然后用Western blot方法用白蛋白抗體檢測含白蛋白的蛋白收集峰。將收集 的含白蛋白樣品的洗脫峰樣品匯集在一起，針對TBS緩沖液透析。然后上樣于抗白蛋白抗 體-Si^pharose 4B柱進(jìn)行親和層析。用8倍柱體積的0. 1 % Tween-TBS緩沖液洗滌該柱，然 后用TBS (含0.2M甘氨酸-HCL(PH2.5))洗脫蛋白，收集蛋白洗脫峰。將親和層析分離純化 的ATWLPra白蛋白變異體進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果如圖2所示，該白蛋白變異體的純 度> 95%。實(shí)施例二、本發(fā)明的ATWLPPR-白蛋白變異體的功效驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)( 一 ) ATffLPPR 多肽由 Syma-Genosys (Woodland_TX)公司合成。ATWLPPR-白蛋白 變異體由實(shí)施例一制備。
(二)HUVEC細(xì)胞增殖試驗(yàn)Huvec細(xì)胞購自 Cell Applications Inc. (San Diego, CA)。將Huvec細(xì)胞以1500細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞置37°C CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)16小時(shí)后，加入不同濃度的合成ATWLPra多肽或ATWLPra白蛋白變異體，然后加入2ng/ ml VEGF。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，加入3H-TdR。6小時(shí)后，收獲細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)計(jì)測定摻入 的3H-TdR量。mH-3T3細(xì)胞作為對照。
(三)多肽競爭抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn)將VEGF受體2(KDR)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后 的KDR-293細(xì)胞接種于96孔板中(1 X IO4細(xì)胞/孔)，置37°C培養(yǎng)過夜。用10%甲醇固定 細(xì)胞(20°C15分鐘)。用0.2%甘氨酸PBS處理細(xì)胞(室溫15分鐘)一次。再用PBS洗二 次。然后加入不同濃度的ATWLPI3R肽或ATWLPI3R白蛋白變異體，同時(shí)加入0. Ing/孔VEGF。 置37°C溫育2小時(shí)(Hr)，用PBS洗滌之。用1251-標(biāo)記的抗VEGF抗體測定結(jié)合于細(xì)胞上 的VEGF量。(四)VEGF細(xì)胞信號傳導(dǎo)的抑制作用將Huvec細(xì)胞置IOOmm直徑培養(yǎng)板中培養(yǎng)， 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到75%時(shí)，改用無血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)16小時(shí)，然后加入2 X ICT4M的 合成ATWLPI3R肽或ATWLPI3R白蛋白變異體，30分鐘后加入100ng/ml VEGF刺激5分鐘。將 細(xì)胞用冷PBS洗2次，加入Iml Lamilli電泳上樣液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解物，超聲處理 后，再煎沸5分鐘。將細(xì)胞裂解物上樣于12% SDS PAGE膠中電泳，然后進(jìn)行Western Blot 分析試驗(yàn)。用抗磷酸化AKT(Thr 473)抗體(購自Upstate)和抗磷酸化MAPK(Thr218/ Tyr220)抗體(購自SantCruz公司)檢測VEGF刺激AKT和MAKP活化情況。用抗磷酸化 KDR (Tyr 1054/1059)抗體檢測KDR的酪氨酸磷酸化作用。(五)家兔“角膜口袋”血管生成試驗(yàn)(Corneal pocket assay)將 Hydrogel 水凝膠(1x2mm)置于載玻片上，加入2μ 1 PBS(其中含有25yg BSA),2pmol VEGF和 30nmolATWLPra多肽或ATWLPra白蛋白變異體。將其置入新西蘭家兔角膜中。12天后直接 用裂隙燈檢測新生血管的形成作用?！?+ ”表示新生血管小于Imm長，“++”表示新生血管Imm 長，“+++”表示新生血管1-2_長，“++++”表示新生血管> 2mm長。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果( 一 ) ATffLPPR-白蛋白變異體對VEGF與KDR結(jié)合的競爭性抑制作用。在KDR轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞表面表達(dá)有大量的KDR蛋白。作為VEGF的受體，KDR可 特異性與VEGF進(jìn)行高親和力結(jié)合。在加入VEGF之前，如果先用ATWLPra白蛋白變異體處 理KDR轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，則可顯著抑制后續(xù)加入的VEGF與KDR的結(jié)合。結(jié)果如圖3所 示，隨著加入ATWLPPR-白蛋白變異體濃度的增加，其抑制作用相應(yīng)增強(qiáng)。ATWLPra多肽在抑 制VEGF與其受體KDR結(jié)合過程中的作用相似。( 二 ) ATWLPPR-白蛋白變異體對VEGF刺激體外Huvec細(xì)胞增殖的抑制作用。Huvec細(xì)胞表面表達(dá)有特異性KDR分子，VEGF通過與KDR結(jié)合從而刺激Huvec細(xì)胞 DNA合成和增殖。用3H-TdR摻入方法可定量測定DNA合成及細(xì)胞增殖的程度。將ATWLPI3R 肽或ATWLPPR-白蛋白變異體預(yù)先處理Huvec細(xì)胞，結(jié)果VEGF刺激Huvec細(xì)胞增殖的程度明 顯被抑制。如圖4所示，其抑制效應(yīng)與ATWLPra肽和白蛋白變異體濃度成正比，并且ATWLPra 肽與白蛋白變異體對VEGF刺激的Huvec細(xì)胞增殖作用的抑制效應(yīng)非常相似。(三)ATWLPPR白蛋白變異體對VEGF刺激的細(xì)胞信號傳導(dǎo)的抑制作用。VEGF與KDR結(jié)合后，首先誘導(dǎo)KDR 二聚體化(dimerization)，從而激活其酶氨酸蛋白激酶活性，催化KDR的酪氨酸自身磷酸化(autophosphorylation)以及下游底物分子 的酪氨酸磷酸化。已證明有二條主要細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路對VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生 成作用至關(guān)重要一是AKT蛋白激酶的活化；另一是MAPK蛋白激酶的活化。二者對于內(nèi)皮 細(xì)胞的移動、分化、抗凋亡(anti-apoptosis)以及細(xì)胞增殖調(diào)控有著關(guān)鍵作用。[7-10]將ATWLPI3R肽或白蛋白變異體預(yù)先處理Huvec細(xì)胞，然后用VEGF刺激之，其不同 分子的磷酸化程度可用不同的特異性磷酸化抗體分子測定之，結(jié)果如圖5所示，VEGF刺激 的KDR酶氨基酸1054和1059 (Tyr 1054和Tyr 1059)的磷酸化作用被明顯抑制。Tyr 1054 和Tyrl059位于KDR的蛋白激酶調(diào)控區(qū)域，其磷酸化對KDR的活化和蛋白激酶活性至關(guān)重 要。其Tyrl054和Tyrl059的磷酸化程度可反映出KDR的酶活性。與此相對應(yīng)，KDR下游 的AKT和MAPK蛋白激酶活化也都受到了 ATWLPI3R肽和其白蛋白變異體處理的抑制。AKT蛋 白Thr473的磷酸化是AKT激酶活化必需的一步。AKT的Thr473磷酸化程度是其酶活性的 一個(gè)指標(biāo)。MAPK激酶的活化需要其Thr218和Tyr220磷酸化，這二個(gè)氨基酸殘基的磷酸化 程度也直接反映了 MAPK蛋白激酶活性。如圖5所示，在ATWLPra肽和白蛋白變異體處理的 細(xì)胞中AKT Thr473和MAPK Thr218/Tyr220磷酸化程度明顯低于未處理的對照組。這表明 這二條信號傳導(dǎo)通路都被肽或白蛋白變異體處理抑制。(四)ATWLPPR白蛋白變異體在體內(nèi)的血管生成抑制作用用家兔角膜“口袋”試驗(yàn)(corneal pocket assay)來檢測ATWLPI3R白蛋白變異體 在體內(nèi)的血管生成抑制作用。由于置入家兔角膜的膠中含有VEGF，在VEGF的作用下可誘導(dǎo) 角膜形成新生血管。如果膠中同時(shí)加入有同劑量的ATWLPra肽或其白蛋白變異體，則VEGF 誘導(dǎo)的血管生成作用被明顯地抑制。這證明了該白蛋白變異體在體內(nèi)能有效地抑制血管的生成。同時(shí)表1顯示，白蛋 白變異體的抑制作用比ATWLPra肽更有效表1 =ATWLPra肽及白蛋白變異體對家兔角膜血管生成的抑制作用 實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明新合成的白蛋白變異體具有ATWLPra肽分子相同的血管生成抑 制作用。它可以在體外抑制VEGF與其特異性受體分子KDR的結(jié)合。阻斷VEGF-KDR介導(dǎo)的 細(xì)胞信號傳導(dǎo)作用，抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用。同時(shí)，它在體內(nèi)家兔角膜血 管生成實(shí)驗(yàn)中可明顯抑制血管的生成。參考文獻(xiàn)UGarmeliet, P =Nature Med. 6 :389_395，20002, Folkman, J :N. Engl. J. Med. 285 1182-1186，19713、Bold, G. et al J. Med. Chem. 43 :2310_2323，20003、Davis, D. W et al =Biotech. 34 1048-1063，2003
4, Lei,H et al J. Biol Chem. 277 :43137_43142，20025>Binetruy-Tournaire, R, et al =EMBOJ. 19 :1525—1533，20006、Meyer，M et al :EMBD. J. 18 :363_374，19997、Karkkainem, M. J. &Retrova，T. Oncogene 19 :5598-5605，20008、Kroll，J&ffaltenberger, J. J. Biol. Chem. 272 :32501_32527，19979、Dougher-Vermazen, M. et al :Biochem. Biophys. Res. Comm. 205 :728-738,199910、Peters, T. Jr :Adv. Protein Chem. 37 161-245，1985 11、Peters, T. Jr :A11 About Albumin, Academic Press,Inc. San Diego, CA12、Dennis, M.S. et al J. Biol. Chem. 277 :35035_35043，200213、Syed, S.et al =Blood 89 :3243_3252，1997.SEQUENCE LISTING<110>成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司<120>具備抗血管生成活性的白蛋白變異體及其制備方法<130>A100010k<160>7<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>1830<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080
aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500
tgcacagaat ccttggtgaa caggcgtcca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680cccaaggcaa caaaagaggc aactgaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa1830<210>2<211>609<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Lys Trp Val Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala151015Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala202530His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu354045lie Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val505560Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp65707580Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp859095Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala100105110Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln115120125His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val130135140Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys145150155160Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165170175Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys180185190Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu195200205Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys210215220 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val225230235240Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser245250255Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly260265270Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie275280285Cys Glu Asn Gln Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu290295300Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp305310315320Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser325330335Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly340345350Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val355360365Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys370375380Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu385390395400Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu lie Lys Gln Asn Cys405410415Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu420425430Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val435440445Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His450455460Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val465470475480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg485490495Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe500505510Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala515520525Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lie Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu530535540
Arg Gln lie Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys545550555560Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala565570575Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe580585590Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly595600605Leu<210>3<211>1830<212>DNA<213>artificial<220><223>artificial<400>3atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900
gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320 caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgtcca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680cccaaggcaa catggctgcc accgcgagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa1830<210>4<211>609<212>PRT<213>artificial<220><223>artificial<400>4Met Lys Trp Val Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala151015Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala202530His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu354045lie Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val505560Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp65707580Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp859095Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala100105110Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln115120125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130135140Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys145150155160Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro165170175Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys180185190Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu195200205Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys210215220Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val225230235240Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser245250255Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly260265270Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie275280285Cys Glu Asn Gln Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu290295300Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp305310315320Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser325330335Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly340345350Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val355360365Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys370375380Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu385390395400Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu lie Lys Gln Asn Cys405410415Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu420425430Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435440445Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450455460Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val465470475480Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg485490495Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe500505510Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala515520525Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp lie Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu530535540Arg Gln lie Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys545550555560Pro Lys Ala Thr Trp Leu Pro Pro Arg Ala Val Met Asp Asp Phe Ala565570575Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe580585590Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly595600605Leu<210>5<211>78<212>DNA<213>artificial<220><223>artificial<400>5gagcttgtga aacacaagcc caaggcaaca tggctgccac cgcgagctgt tatggatgat 60ttcgcagctt ttgtagag78<210>6<211>35<212>DNA<213>artificial<220><223>artificial<400>6atcgttcgaa atgaagtggg taacctttat ttccc35
<210>7<211>31<212>DNA<213>artificial
<220><223>artificial<400>7cgatgaattc ttataagcct aaggcagctt g31.
權(quán)利要求
白蛋白變異體，其特征在于由白蛋白C末端的KEQLK肽段突變?yōu)閃LPPR肽段而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白變異體，其特征在于所述的白蛋白為人白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白變異體，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO. 4所 示。
4.編碼權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的白蛋白變異體的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
6.含有權(quán)利要求4或5所述基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求6所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
8.制備權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的白蛋白變異體的方法，其特征在于包括以下步驟a、使用定點(diǎn)誘變引物將白蛋白編碼基因序列中編碼肽段KEQLK序列的核苷酸序列誘 變成編碼氨基酸肽段WLPra序列的核苷酸序列，得到白蛋白變異體編碼基因序列；b、將白蛋白變異體編碼基因序列到連接到表達(dá)載體中； C、將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主中進(jìn)行表達(dá)得到白蛋白變異體。
9.權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的白蛋白變異體或權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體在制備抗 血管生成藥物中的用途。
10.抗血管生成藥物由權(quán)利要求1所述的白蛋白變異體或權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體 添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而成。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體屬于蛋白質(zhì)藥物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有的ATWLPPR肽在體內(nèi)半衰期短，用量大。解決該問題的技術(shù)方案是提供一種白蛋白變異體。該白蛋白變異體將白蛋白C末端的KEQLK肽段突變?yōu)閃LPPR肽段后得到的變異體。該人白蛋白變異體完全保留有人白蛋白的功能，同時(shí)具有了新的ATWLPPR序列功能。體外實(shí)驗(yàn)證明，該白蛋白變異體在體外可明顯抑制VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和移動，其效率同小肽相當(dāng)。然而注射到動物體內(nèi)其抑制家兔角膜血管生成作用的效率與相同濃度的小肽相比，前者是后者的40-60倍。該人白蛋白變異體可作為一種高效新型的抗血管生成藥物。
文檔編號C12R1/84GK101875693SQ201010300590
公開日2010年11月3日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者吳炯, 易興旺, 白敏 申請人:成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司