專利名稱：一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備及冰鮮保藏的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種冰點活性蛋白酶的制備方法及其應用。
背景技術(shù)：
金槍魚作為一種深海魚類，素來以營養(yǎng)價值高、純天然、無污染而享譽國際市場， 并有"海洋黃金"之稱，肉富含優(yōu)質(zhì)蛋白、高肌內(nèi)脂肪和高維生素A、 D，其氨基酸組成與人體 必需的氨基酸組成相似，因此利用率很高。長期以來，金槍魚一直以凍品的形式出口，隨著 國外消費者對肉制品的需求越來越高，以冰鮮品形式出口的肉質(zhì)食品比例越來越大(羅殷 等，200S)。所謂冰鮮品，是指海產(chǎn)品金槍魚殺后，盡快加工，經(jīng)過預冷、分割、包裝后，迅速冷 卻至肉中心溫度_2 Ot:然后裝入保溫容器的一種肉質(zhì)食品的保鮮產(chǎn)品(趙燕寧，1998)。 冰鮮品與凍品相比，更好的保持了海產(chǎn)品原有的色澤和香味，免去了凍品解凍過程，減少了 肉類的營養(yǎng)成分的損失。在海產(chǎn)品的冰鮮品基礎上，如何增加冰鮮品的風味，提高冰鮮品的 質(zhì)量，是需要解決的關鍵問題。由于冰點活性蛋白酶在(TC及以下的溫度下具有催化效率高 的特點，因此在肉食品和水產(chǎn)品加工等低溫環(huán)境工業(yè)具有廣泛應用前景。但現(xiàn)有方法制備 得到的用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的極端耐受性差，極大的限制了其在金槍魚 類冰鮮品的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有方法制備得到的用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶 的極端耐受性差的問題，而提供了一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備及冰 鮮保藏的方法。 本發(fā)明用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法按照以下步驟進行
—、南極海冰細菌Colwellia sp. NJ341接種于優(yōu)化培養(yǎng)基上，在溫度為7. 5 8. 5t:、轉(zhuǎn)速為180 220r/min的條件下振蕩培養(yǎng)93 100h得到培養(yǎng)液，其中優(yōu)化培養(yǎng)基 按照重量份數(shù)比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的檸檬酸鈉、0. 15 0. 25份的吐 溫_80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陳海水組成，pH 值為7. 5 ; 二、培養(yǎng)液在10000r/min條件下離心10min，然后將上清液和硫酸銨按照2. 5 3.5 : 6. 5 7. 5的重量比混合，在O 0. 5。C條件下靜置7. 5 8. 5h，然后在12000r/min 條件下離心30min，棄去上清液，將離心后的沉淀和50mmol/L、 pH為7. 5的Tris-HCl緩沖 液按照1 : 0. 8 1. 2的重量比混合，在4t:條件下透析7. 5 8. 5h，然后在fC條件下經(jīng) 超濾膜濃縮后即得到用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。 本發(fā)明冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行將金 槍魚清洗干凈，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本發(fā)明的冰點活性蛋白酶，冰點 活性蛋白酶的加入量為210 220U/g魚肉，同時向每克的魚片中加入0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內(nèi)，密封，快速冷卻，放 入-2 (TC冷庫，即實現(xiàn)了對金槍魚的冰鮮保藏。 本發(fā)明制作得到的冰點活性蛋白酶，其最適溫度為34 26°C，在0 l(TC條件能 保持30%以上的相對活力，在NaCl濃度為0 2mol/L的條件下酶的活力保持不變，本發(fā)明 的冰點活性蛋白酶極端耐受性好，使用本發(fā)明冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的金槍魚有明顯 嫩化現(xiàn)象，本發(fā)明冰點活性蛋白酶明顯的抑制了金槍魚的TvB脬值、pH值和菌落總數(shù)的上 升速度，達到保鮮的目的，使用本發(fā)明冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚，與新鮮的金 槍魚肉相比較，谷氨酸和組氨酸含量均增加了 1.5%以上，增加肉類的風味，增鮮作用明顯， 使用本發(fā)明冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚的保鮮期達到50天以上，保鮮期長，由 此可知，使用本發(fā)明的冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚能更好的保持原有的色澤和 香味，免去了凍品解凍過程，減少了肉類的營養(yǎng)成分的損失，在保鮮的基礎上，又能增加冰 鮮品的風味，提高冰鮮品的質(zhì)量。


圖1為用具體實施方式
十制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的大目金槍魚 冰鮮品中揮發(fā)性鹽基氮含量變化圖； 圖2為用具體實施方式
十制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金槍魚 冰鮮品中揮發(fā)性鹽基氮含量變化圖； 圖3為用具體實施方式
十制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的大目金槍魚 冰鮮品中pH變化圖； 圖4為具體實施方式
十制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金槍魚冰 鮮品中pH變化圖； 圖5用具體實施方式
十制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的大目金槍魚冰 鮮品中總菌數(shù)量圖； 圖6為具體實施方式
十制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金槍魚冰 鮮品中總菌數(shù)量圖。
具體實施例方式
本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一 本實施方式用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法 按照以下步驟進行 —、南極海冰細菌Colwellia sp. NJ341接種于優(yōu)化培養(yǎng)基上，在溫度為7. 5 8. 5t:、轉(zhuǎn)速為180 220r/min的條件下振蕩培養(yǎng)93 100h得到培養(yǎng)液，其中優(yōu)化培養(yǎng)基 按照重量份數(shù)比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的檸檬酸鈉、0. 15 0. 25份的吐 溫_80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陳海水組成，pH 值為7. 5 ; 二、培養(yǎng)液在10000r/min條件下離心10min，然后將上清液和質(zhì)量濃度為65% 75%的硫酸銨按照2. 5 3. 5 : 6. 5 7. 5的重量比混合，在0 0. 5"條件下靜置7. 5 8. 5h，然后在12000r/min條件下離心30min，棄去上清液，將離心后的沉淀和50mmol/L、 pH 為7. 5的Tris-HCl緩沖液按照1 : 0. 8 1. 2的重量比混合，在4。C條件下透析7. 5
8. 5h，然后在4t:條件下經(jīng)超濾膜濃縮后即得到用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。 本實施方式步驟三中陳海水是放置15天以上的海水，去除了海水中的部分微生 物和一些代謝產(chǎn)物等。 本實施方式步驟二中超濾膜的分子量為50Kda。 用實施方式冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行 將金槍魚清洗干凈，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本實施方式的冰點活性蛋白 酶，冰點活性蛋白酶的加入量為215U/g魚肉，同時向每克的魚片中加入0. 5 3g的碎冰 和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內(nèi)，密封，快速冷卻，放入 (TC -2t:冷庫，即實現(xiàn)了對金槍魚進行冰鮮保藏。 本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶，其最適溫度為34 26t:，在0 l(TC條 件能保持30%以上的相對活力，在NaCl濃度為0 2mol/L的條件下酶的活力保持不變，本 實施方式的冰點活性蛋白酶耐受性好，使用本實施方式冰點活性蛋白酶對冰鮮保藏后的金 槍魚有明顯嫩化現(xiàn)象，本實施方式冰點活性蛋白酶明顯的抑制了金槍魚的TvB脬值、pH值 和菌落總數(shù)的上升速度，達到保鮮的目的，使用本實施方式冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏 的金槍魚，與新鮮的金槍魚肉相比較，谷氨酸和組氨酸含量均增加了 1.5%以上，增加肉類 的風味，增鮮作用明顯，使用本實施方式冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚的保鮮期 達到50天以上，保鮮期長。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中優(yōu)化培養(yǎng)基 按照重量份數(shù)比由5份的酪蛋白、3. 75份的檸檬酸鈉、0. 2份的吐溫-80、 1份的酵母提取 物、10份的NaCl和1000份的陳海水組成。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一至二不同的是步驟一中在溫度 為『C、轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)96h得到培養(yǎng)液。其它步驟及參數(shù)與具體實施 方式一至二相同。 具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三不同的是步驟二中上清液 和硫酸銨按照3 : 7的重量比混合。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四不同的是步驟二中在0°C 條件下靜置8h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五不同的是步驟二中透析 8h。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至五相同。
具體實施方式
七本實施方式冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照 以下操作進行將金槍魚清洗干凈，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本發(fā)明的冰 點活性蛋白酶，冰點活性蛋白酶的加入量為210 220U/g魚肉，同時向每克的魚片中加入 0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內(nèi)，密封， 快速冷卻，放入_2 ot:冷庫，即實現(xiàn)了對金槍魚的冰鮮保藏。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
七不同的是冰點活性蛋白酶的加入 量為215U/g魚肉。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
七相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
七或八不同的是向每克的魚片中加入2g的碎冰和5g的NaCl。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
七或八相同。
具體實施方式
十本實施方式用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法
按照以下步驟進行 —、南極海冰細菌Colwellia sp. NJ341接種于優(yōu)化培養(yǎng)基上，在溫度為7. 5 8. 5t:、轉(zhuǎn)速為180 220r/min的條件下振蕩培養(yǎng)93 100h得到培養(yǎng)液，其中優(yōu)化培養(yǎng)基 按照重量份數(shù)比由4. 8 5. 2份的酪蛋白、3. 6 3. 9份的檸檬酸鈉、0. 15 0. 25份的吐 溫80、0. 8 1. 2份的酵母提取物、8 12份的NaCl和950 1050份的陳海水組成，pH值 為7.5 ; 二、培養(yǎng)液在10000r/min條件下離心10min，然后將上清液和硫酸銨按照3 : 7的 重量比混合，在0 0. 5t:條件下靜置7. 5 8. 5h，然后在12000r/min條件下離心30min， 棄去上清液，將離心后的沉淀和50mmol/L、pH為7. 5的Tris HC1緩沖液按照1 : 1的重量 比混合，在4t:條件下透析7. 5 8. 5h，然后在4t:條件下經(jīng)超濾膜濃縮后即得到用于金槍 魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。 本實施方式步驟三中陳海水是放置15天以上的海水，去除了海水中的部分微生 物和一些代謝產(chǎn)物等。 本實施方式步驟二中超濾膜的分子量為50Kda。 用實施方式冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行將 大目金槍魚或黃鰭金槍魚清洗干凈，切成3cm 4cm厚的魚片，向魚片中加入本實施方式的 冰點活性蛋白酶，冰點活性蛋白酶的加入量為215U/g魚肉，同時向每克的魚片中0. 2g的碎 冰和0. 03g的質(zhì)量濃度為4%的NaCl，然后按層魚層冰的形式放入塑料薄膜袋內(nèi)，密封，快 速冷卻，放入(TC -21:冷庫，即實現(xiàn)了對金槍魚的冰鮮保藏(得到了金槍魚冰鮮品)。
本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶，其最適溫度為34 26t:，在0 l(TC條 件能保持30%以上的相對活力，O 2麗aCl濃度下酶的活力保持不變，本實施方式的冰點 活性蛋白酶耐受性好，使用本實施方式冰點活性蛋白酶的金槍魚冰鮮品有明顯嫩化現(xiàn)象。
圖1為用本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的大目金槍魚冰鮮 品中揮發(fā)性鹽基氮含量變化圖，圖1中^""^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶制作金槍 魚冰鮮品醫(yī)表示未經(jīng)任何處理的金槍魚；圖2為用本實施方式制作得到的冰點活 性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金槍魚冰鮮品中揮發(fā)性鹽基氮含量變化圖，圖2中^ ^^表 示用實施方式冰點活性蛋白酶制作金槍魚冰鮮品，醫(yī)表示未經(jīng)任何處理的金槍魚； 圖3為用本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的大目金槍魚冰鮮品中pH變 化圖，圖3中^ ^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶制作金槍魚冰鮮品，醫(yī)表示 未經(jīng)任何處理的金槍魚；圖4為用本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃 鰭金槍魚冰鮮品中pH變化圖，圖4中^""^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶制作金槍 魚冰鮮品，醫(yī)表示未經(jīng)任何處理的金槍魚；圖5為用本實施方式制作得到的冰點活 性蛋白酶冰鮮保藏后的大目金槍魚冰鮮品中總菌數(shù)量圖，圖5中》 ^ 表示用實施方式 冰點活性蛋白酶制作金槍魚冰鮮品，墨表示未經(jīng)任何處理的金槍魚；圖6為用本實 施方式制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金槍魚冰鮮品中總菌數(shù)量圖，圖6中 ""^^^表示用實施方式冰點活性蛋白酶制作金槍魚冰鮮品，墨表示未經(jīng)任何處 理的金槍魚
6
從圖1 6中可以看出，大目金槍魚和黃鰭金槍魚在冰點性蛋白酶處理后，能夠較 明顯的抑制TvB脬值、pH值和菌落總數(shù)的上升速度，使用本實施方式制作得到的冰點活性 蛋白酶實現(xiàn)了金槍魚保鮮的目的。 冰點活性蛋白酶對大目金槍魚和黃鰭金槍魚酶解影響如表1所示。 表l
大目金槍魚黃鰭金槍魚氨基酸冰點活性蛋白酶對照冰點活性蛋白酶對照
(%)(。/。)(%)(%)
谷氨酸(Glu)1. 250. 621. 040. 57
甘氨酸(Gly)0. 230. 180. 340. 13
丙氨酸(Ala)0. 400. 260. 280. 24
天冬氨酸(Asp)0. 240. 150. 230. 14
蘇氨酸(Thr)0. 160. 100. 140. 09
絲氨酸(Ser)0. 160. 100. 160. 12
纈氨酸(Val)0. 350. 270. 270. 24
蛋氨酸(Met)0. 520. 370. 480. 33
異亮氨酸(Ile)0. 640. 450. 510. 28
亮氨酸(Leu)0. 380. 250. 420. 27
酪氨酸(Tyr)0. 290. 190. 280. 19
苯丙氨酸(Phe)0. 260. 170. 260. 16
賴氨酸(Lys)0. 310. 200. 370. 21
組氨酸(His)2. 851. 702. 431. 54
精氨酸(Arg)0. 160. 110. 150. 13
脯氨酸(Pro)0. 140. 090. 170. 09
游離氨基酸總量9. 575. 227. 534. 73 注"冰點活性蛋白酶"表示用本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后 的黃鰭金槍魚冰鮮品，"對照"表示未經(jīng)任何處理的金槍魚。 從表1中的數(shù)據(jù)看出，本實施方式制作得到冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金 槍魚冰鮮品中釋放出了更多的游離氨基酸，谷氨酸和組氨酸含量顯著增加，增加肉類的風 味，起到增鮮作用，經(jīng)本實施方式制作得到冰點活性蛋白酶冰鮮保藏后的黃鰭金槍魚冰鮮 品保鮮期為50天，保鮮期長。 使用本實施方式制作得到的冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚更好的保持 原有的色澤和香味，免去了凍品解凍過程，減少了肉類的營養(yǎng)成分的損失，在保鮮的基礎 上，又能增加冰鮮品的風味，提高冰鮮品的質(zhì)量
權(quán)利要求
一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法，其特征在于用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法按照以下步驟進行一、南極海冰細菌Colwellia sp.NJ341接種于優(yōu)化培養(yǎng)基上，在溫度為7.5～8.5℃、轉(zhuǎn)速為180～220r/min的條件下振蕩培養(yǎng)93～100h得到培養(yǎng)液，其中優(yōu)化培養(yǎng)基按照重量份數(shù)比由4.8～5.2份的酪蛋白、3.6～3.9份的檸檬酸鈉、0.15～0.25份的吐溫-80、0.8～1.2份的酵母提取物、8～12份的NaCl和950～1050份的陳海水組成，pH值為7.5；二、培養(yǎng)液在10000r/min條件下離心10min，然后將上清液和硫酸銨按照2.5～3.5∶6.5～7.5的重量比混合，在0～0.5℃條件下靜置7.5～8.5h，然后在12000r/min條件下離心30min，棄去上清液，將離心后的沉淀和50mmol/L、pH為7.5的Tris-HC1緩沖液按照1∶0.8～1.2的重量比混合，在4℃條件下透析7.5～8.5h，然后在4℃條件下經(jīng)超濾膜濃縮后即得到用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法，其 特征在于步驟一中優(yōu)化培養(yǎng)基按照重量份數(shù)比由5份的酪蛋白、3. 75份的檸檬酸鈉、0. 2份 的吐溫80、 1份的酵母提取物、10份的NaCl和1000份的陳海水組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方 法，其特征在于步驟一中在溫度為『C、轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)96h得到培養(yǎng) 液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法，其 特征在于步驟二中上清液和硫酸銨按照3:7的重量比混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或4所述的一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方 法，其特征在于步驟二中在ot:條件下靜置8h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備方法，其 特征在于步驟二中透析8h。
7. 冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法，其特征在于冰點活性蛋白酶對金槍 魚進行冰鮮保藏的方法按照以下操作進行將金槍魚清洗干凈，切成3cm 4cm厚的魚片， 向魚片中加入本發(fā)明的冰點活性蛋白酶，冰點活性蛋白酶的加入量為210 220U/g魚肉， 同時向每克的魚片中加入0. 5 3g的碎冰和0. 02 0. 04g的NaCl，然后按層魚層冰的形 式放入塑料薄膜袋內(nèi)，密封，快速冷卻，放入_2 ot:冷庫，即實現(xiàn)了對金槍魚的冰鮮保藏。
8 根據(jù)權(quán)利要求7所述的冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法，其特征在于 冰點活性蛋白酶的加入量為215U/g魚肉。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的冰點活性蛋白酶對金槍魚進行冰鮮保藏的方法，其特征 在于向每克的魚片中加入2g的碎冰和0. 03g的NaCl。
全文摘要
一種用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的制備及冰鮮保藏的方法，它涉及一種冰點活性蛋白酶的方法及其應用。本發(fā)明解決了現(xiàn)有方法制備得到的用于金槍魚冰鮮保藏的冰點活性蛋白酶的極端耐受性差的問題。方法一、南極海冰細菌Colwellia sp.NJ341接種于優(yōu)化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)得到培養(yǎng)液；二、培養(yǎng)液經(jīng)離心、透析、超濾膜濃縮得到冰點活性蛋白酶；冰鮮保藏的方法向魚片中加入冰點活性蛋白酶，同時加入碎冰和NaCl，密封，冷卻。本發(fā)明方法得到的冰點活性蛋白酶極端耐受性好，使用本發(fā)明的冰點活性蛋白酶進行冰鮮保藏的金槍魚能更好的保持原有的色澤和香味，在保鮮的基礎上，又能增加冰鮮品的風味，提高冰鮮品的質(zhì)量。
文檔編號A23B4/09GK101724616SQ20101030028
公開日2010年6月9日 申請日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者侯艷華, 李寧, 林學政, 沈繼紅, 王全富, 閆培生 申請人:哈爾濱工業(yè)大學