專利名稱：一株副干酪乳桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及一株副干酪乳桿菌及其應用方法。
背景技術：
國際營養(yǎng)學界給“益生菌”的定義是指一類有益人類健康的腸道生理細菌， 還常被描述為“良性”或“健康”的細菌。它包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙 岐桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌等細菌。應用于人體的益生菌產品有益 生菌發(fā)酵的乳制品、肉制品、果蔬制品等，醫(yī)藥保健行業(yè)。乳酸菌是益生菌中的主要一 類，具有抗腫瘤、緩解乳糖不耐癥、增強免疫力、降低膽固醇、調整腸道菌群等生理作 用。乳酸菌主要用于發(fā)酵肉制品、發(fā)酵水產品等發(fā)酵食品的生產中，抑制了腐敗菌和致 病菌的生長及毒素的產生，使發(fā)酵食品的保存期大大延長，有利于儲藏和流通，食用安 全性更好，營養(yǎng)成分更豐富。微囊藻毒素(MCs)是由富營養(yǎng)化水體中的銅綠微囊藻、水華魚腥藻、念珠藻等 藍藻產生的一種環(huán)狀七肽物質。微囊藻毒素以動物肝臟為作用靶器官，能夠特異性地抑 制蛋白磷酸酶活性從而誘發(fā)癌癥等一系列病變。由于毒性強、在食物鏈中波及范圍廣以 及具有鮮明的地域特征，微囊藻毒素日益成為危害人類健康的重要殺手。目前，干預 MCs的手段可分為物理防治、化學防治以及生物防治。其中，微生物處理法中部分益生 菌對MCs的干預作用因其安全性(GRAS)而成為真正能夠實現(xiàn)在清除MCs過程中與水 源、食品“零距離”接觸的生物防治劑。同時，由于益生菌定殖人體腸道后在抑制有害 微生物生長、提高人體免疫力、協(xié)助消化和營養(yǎng)吸收等諸多方面發(fā)揮的長期功效，使得 益生菌作為體內MCs “清道夫”的價值更加突出。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一株副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei BBE10-215)。本發(fā)明所提供的副干酪乳桿菌BBE10-215 {Lactobacillusparacasei),已于2010
年7月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址為中國武漢，武漢大學，保藏 編號為CCTCC NO: M 2010169，分類學命名為副干酪乳桿菌(Lactobacillus pamcasei)； 其16SrDNA如核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示，以其16SrDNA全序列為基礎的系統(tǒng)發(fā) 育樹如說明書附圖1所示。本發(fā)明提供了一種所述副干酪乳桿菌的應用，是將培養(yǎng)好的副干酪乳桿菌用于 微囊藻毒素的清除。將培養(yǎng)好的副干酪乳桿菌調整菌濃的比例至適宜范圍，接種至藻毒 素溶液中，室溫下靜止培養(yǎng)或不定時攪拌使溶液混合均勻。所述干酪乳桿菌為從泡菜、臘腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選，其保藏條件如下從 生長良好的平板上取2-3環(huán)益生菌移入MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)20h，取0.7mL移 入盛有0.3mL無菌甘油的甘油管中，放_70°C冰箱保存。所述MRS培養(yǎng)基為葡萄糖20§1^，蛋白胨lOgL—1，牛肉膏l(xiāng)OgL—1，酵母浸出汁5β Λ無水乙酸鈉5§ Λ磷酸二氫鉀ZgL—1，檸檬酸三銨ZgL—1，MgSO4 · 7H20 0.2g L-1, MnSO4 · H2O 0.05g L1, Tween-80 ImL L1, pH5.5。所述干酪乳桿菌培養(yǎng)條件為將甘油管保藏的益生菌接入MRS液體培養(yǎng)基，在 37°C靜置培養(yǎng)20h至對數(shù)中后期，以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基 中，37°C靜置培養(yǎng)20h。在藻毒素濃度為1000 μ g L1的條件下，IO9CFUmI/1的菌體與之共培養(yǎng)24h后， 降解率高達到12% (圖2)。在藻毒素濃度為100 μ g L-1的條件下，菌濃為IO9CFU mL1 的菌體與之共培養(yǎng)24h后，降解率最高達到76%。在藻毒素起始濃度為SOOygI/1的條 件下，菌濃為IO9CFUmI/1的菌體與之共培養(yǎng)24h后，降解率最高達到39%。微囊藻毒素的檢測采用高效液相的方法色譜柱AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 X 150mm, 5.0 μ m)流動相乙腈H2O(0.05% TFA) =40 60 (ν/ν)進樣量20μ 1 ；流速lmL/min ；柱溫40°C檢測器DAD238nm ； MCs 保留時間3.48min本發(fā)明具有藻毒素清除效果好的特點，并且副干酪乳桿菌作為一種益生菌，特 別適合應用于食品領域，使藻毒素得到快速、安全和高效地清除。


圖1 :乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹
具體實施例方式實施例1 副干酪乳桿菌篩選方法從泡菜、臘腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中取一定樣品加入到30mL MRS培養(yǎng)基中富集培 養(yǎng)，37°C培養(yǎng)20h。將培養(yǎng)液梯度稀釋，涂布于添加0.02%溴甲酚紫的MRS平板，37°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取使溴甲酚紫變色圈明顯的的單菌落。反復進行平板劃線分離， 重復三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。鑒定主要通過1)菌落特征觀察用肉眼直接觀察，挑選菌落直徑在1 3_ 之間，圓形隆起，表面光滑或稍粗糙，乳白、灰白或暗黃色等符合乳酸菌菌落特征的菌 株。2)個體形態(tài)觀察用光學顯微鏡革蘭氏染色觀察。挑選革蘭氏陽性、無芽孢菌株。 將滿足鑒定條件的菌株挑出甘油管保藏。以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C 靜置培養(yǎng)20h (對數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌體，再用磷酸 鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌離心2次，調整菌濃在IO9CFU mL1左右。將獲得的菌體重懸于 含藻毒素(MC-LR)濃度為1000 μ g L1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(150r min—1)避光培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC檢 測MC-LR殘存濃度。通過HPLC檢測，篩選到一株具有較強MC-LR清除能力的菌株，通過16SrDNA 序列分析(見核苷酸序列表中SEQ ID NO: 1所示)可知該菌株為副干酪乳桿菌，于2010 年7月7日保藏于菌種保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010169。
實施例2 MC-LR 初始濃度為 100 μ g I/1以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C 靜置培養(yǎng)20h (對數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌體，再用磷酸 鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌離心2次，調整菌濃在IO9CFU ml/1左右。將獲得的菌體重懸于含 MC-LR濃度為IOOygL1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(ISOrmm1)避光 培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC檢測MC-LR 殘存濃度。計算獲得菌株對MC-LR的清除率為76%。實施例3 MC-LR 初始濃度為 500 μ g L—1以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C 靜置培養(yǎng)20h (對數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌體，再用磷酸 鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌離心2次，調整菌濃在IO9CFU ml/1左右。將獲得的菌體重懸于含 MC-LR濃度為500 μ gL—1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(lSOrmiiT1)避光 培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC檢測MC-LR 殘存濃度。計算獲得菌株對MC-LR的清除率為39%。實施例4 MC-LR 初始濃度為 1000 μ g I/1以2%接種量取-70°C甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)。取37°C 靜置培養(yǎng)20h (對數(shù)中后期)的發(fā)酵液，離心IOmin (3200 Xg，4°C )收集菌體，再用磷酸 鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌離心2次，調整菌濃在IO9CFU ml/1左右。將獲得的菌體重懸于含 MC-LR濃度為1000 μ gL 1的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，置于37°C搖床(ISOrmm1)避光 培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后取樣，離心IOmin (12000 Xg，4°C )，取上清液用HPLC檢測MC-LR 殘存濃度。計算獲得菌株對MC-LR的清除率為12%?？梢岳斫獾氖?，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其 發(fā)明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發(fā)明所附的權利要求 的保護范圍。
權利要求
1.一株副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) BBE10-215,保藏編號 CCTCC M 2010169。
2.一種培養(yǎng)權利要求1所述副干酪乳桿菌的方法，是在MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)副干 酪乳桿菌。
3.如權利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于優(yōu)選pH5.5 ；優(yōu)選培養(yǎng)溫度37°C。
4.權利要求1所述干酪乳桿菌的應用，是將培養(yǎng)好的干酪乳桿菌用于微囊藻毒素的清
全文摘要
本發(fā)明公開了一株副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)BBE10-215，已于2010年7月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010169。該菌株具有較高的藻毒素清除效率，將該菌株用于保健食品領域，具有提高人體免疫力、協(xié)助營養(yǎng)消化等諸多方面的功效。
文檔編號C12R1/225GK102021127SQ20101023867
公開日2011年4月20日 申請日期2010年7月28日 優(yōu)先權日2010年7月28日
發(fā)明者吳重德, 堵國成, 張娟, 張茜, 畢潔, 王松, 王淼, 陳堅, 顧磊 申請人:江南大學