一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳桿菌在農(nóng)業(yè)、食品領(lǐng)域具有重大的經(jīng)濟(jì)意義以及對(duì)動(dòng)物和人體健康公認(rèn)的重要 性，越來越引起人們的關(guān)注。幾個(gè)世紀(jì)以來，乳桿菌作為重要的益生菌已廣泛地應(yīng)用于食品 及飲料加工業(yè)，其生物學(xué)特性為棒狀，厭氧或微需氧，屬易生菌。以乳桿菌作為發(fā)酵菌的食 品工業(yè)所創(chuàng)造出的經(jīng)濟(jì)價(jià)值占全球總的發(fā)酵類食品的20%。同時(shí)乳桿菌也被廣泛用于腸、 肉類食品的加工和保鮮。乳桿菌通過重建腸道菌群平衡，從而有利于人類及某些動(dòng)物宿主 恢復(fù)并提高健康狀態(tài)。
[0003] 由于乳桿菌廣泛的工業(yè)用途和在醫(yī)學(xué)上的重要意義，對(duì)乳桿菌分子遺傳學(xué)研究成 為焦點(diǎn)，特別是利用基因工程技術(shù)，以乳桿菌為載體攜帶外源基因（如抗原、酶、小肽分子 等)到人和動(dòng)物體內(nèi)直接產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。乳桿菌的遺傳操作的先決條件是建立方便和可 靠的轉(zhuǎn)化方法。目前乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 最早出現(xiàn)，但具有繁瑣、耗時(shí)和不穩(wěn)定的缺點(diǎn)而被摒棄，一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法取代了 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，但是仍然不十分完善，尤其是重復(fù)性不好，轉(zhuǎn)化率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，以克服傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化重復(fù)性不 好，轉(zhuǎn)化率低的問題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化 方法，方法包括了干酪乳桿菌培養(yǎng)、干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)，具體步驟為：
[0006] 干酪乳桿菌培養(yǎng)：
[0007] A.從低溫冷凍冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳桿菌菌種，在MRS固體培養(yǎng)基 上劃線，37 °C厭氧倒置培養(yǎng)；
[0008] B.用無菌的接菌環(huán)挑取在MRS上生長好的菌落至試管里MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜 止培養(yǎng)過夜；
[0009] C.第二日將前一天生長好的菌液lmL轉(zhuǎn)接到50mL MRS液體里，37°C靜止生長至菌 液600nm處紫外吸收值為0.5-0.6時(shí)，準(zhǔn)備干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化；
[0010] 干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化：
[0011] D.將干酪乳桿菌移入50mL離心管里，放到冰盒里靜置20分鐘后，放到提前預(yù)冷到4 。(:離心機(jī)中5000r/min，5分鐘，棄掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀 懸浮于EPWB溶液中，放到提前預(yù)冷到4°C的離心機(jī)中5000r/min，5分鐘，棄掉水相，留下菌 體，此步驟重復(fù)3次，用40mL EPB溶液洗滌菌體一次，棄上清；
[0012] E.菌體用400yL的EPB溶液重懸，分裝500-300μ!7支(現(xiàn)用現(xiàn)配），用于電轉(zhuǎn)；
[0013] F.質(zhì)粒DNAlyg加入到之前制備好的干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混合，冰浴10 分鐘；
[0014] G.將質(zhì)粒與干酪乳桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷的2mm電擊杯中，冰浴10分鐘；
[0015] H.用濾紙將電轉(zhuǎn)化杯表面擦干，放入電轉(zhuǎn)儀中，調(diào)節(jié)電壓2.3kV、電阻200Ω、電容 25yF，脈沖時(shí)間約為4-5ms;
[0016] I.向電擊杯中快速加入900yL的含有0.5%甘氨酸的MRS，輕輕地用移液器吹吸混 合后移到一個(gè)無菌的Eppendorf管中，放到提前調(diào)至37°C的80-100rpm/min搖床內(nèi)孵育1.5-3小時(shí)；
[0017] 轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)：
[0018] J.孵育后的混合液離心，留下l〇〇yL上清，重新懸浮;然后涂布于含有選擇壓力的 MRS瓊脂平板上，37 °C無氧倒置培養(yǎng)24-36小時(shí)。
[0019 ] 其中，MRS培養(yǎng)基為莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基，EPWB溶液為:NaH2P〇4〇. 6mmo 1 /L 和MgCl20. lmmol/L配置而成，Era溶液為EPWB溶液基礎(chǔ)上加入0.3mol/L蔗糖，調(diào)節(jié)pH為7.4， 并滅菌4°C保存。
[0020] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0021] 1.本發(fā)明公開了干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化的具體方法和步驟，克服了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化重復(fù)性 不好，轉(zhuǎn)化率低的問題。2.經(jīng)過合理優(yōu)化的干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，可以應(yīng)用于多種不同外 源DNA表達(dá)，潛在的推動(dòng)了生物藥物基因的高效表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0023] 實(shí)施例1
[0024]本發(fā)明公開了一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，方法包括了干酪乳桿菌培養(yǎng)、干酪乳 桿菌電轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)，具體步驟為：
[0025]干酪乳桿菌培養(yǎng)：
[0026] A.從低溫冷凍冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳桿菌菌種，在MRS固體培養(yǎng)基 上劃線，37°C厭氧倒置過夜；
[0027] B.用無菌的接菌環(huán)挑取在MRS上生長好的菌落至3-5mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37°C 靜止培養(yǎng)過夜；
[0028] C.第二日將前一天生長好的菌液lmL轉(zhuǎn)接到50mL的MRS液體里，37°C靜止生長至菌 液600nm處紫外吸收值為0.5-0.6時(shí)，準(zhǔn)備干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化；
[0029]干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化：
[0030] D.將干酪乳桿菌移入50mL離心管里，放到冰盒里靜置20分鐘后，放到提前預(yù)冷到4 。(:離心機(jī)中5000r/min，5分鐘，棄掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀 懸浮于EPWB溶液中，放到提前預(yù)冷到4°C的離心機(jī)中5000r/min，5分鐘，棄掉水相，留下菌 體，此步驟重復(fù)3次，用40mL EPB溶液洗滌菌體一次，棄上清；
[0031] E.菌體用400yL的EPB溶液重懸，分裝50-300μLν支(現(xiàn)用現(xiàn)配），用于電轉(zhuǎn)；
[0032] F.質(zhì)粒DNAlyg加入到之前制備好的干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混合，冰浴10 分鐘；
[0033] G.將質(zhì)粒與干酪乳桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷的2mm電擊杯中，冰浴10分鐘，
[0034] H.用濾紙將電轉(zhuǎn)化杯表面擦干，放入電轉(zhuǎn)儀中，調(diào)節(jié)電壓2.3kV、電阻200Ω、電容 25yF，脈沖時(shí)間約為4-5ms;
[0035] I.向電擊杯中快速加入900yL的含有0.5%甘氨酸的MRS，輕輕地用移液器吹吸混 合后移到一個(gè)無菌的Eppendorf管中，放到提前調(diào)至37°C的80-100rpm/min搖床內(nèi)孵育1.5-3小時(shí)；
[0036]轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)：
[0037] J.孵育后的混合液離心，留下100yL上清，重新懸浮細(xì)菌，然后涂布于含有選擇壓 力的MRS瓊脂平板上，37°C無氧倒置培養(yǎng)24-36小時(shí)；其中，MRS培養(yǎng)基為莫匹羅星鋰鹽改良 MRS培養(yǎng)基，EPWB溶液為:NaH2P〇4〇. 6mmol/L和MgCl20. lmmol/L配置而成，EPB溶液為EPWB溶 液基礎(chǔ)上加入0.3mol/L蔗糖，調(diào)節(jié)pH為7.4，并滅菌4°C保存。
[0038] 工作原理：
[0039] 利用高壓脈沖電流可以使細(xì)胞壁發(fā)生瞬間的可逆性穿孔，外源DNA穿過細(xì)胞膜而 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，經(jīng)過一定條件復(fù)蘇后，細(xì)胞膜上的孔徑將重新封閉，防止胞內(nèi)物質(zhì)外流，然 而由于乳桿菌屬于革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁厚，外源DNA很難進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致電轉(zhuǎn)效率低，重復(fù) 性不高，限制了對(duì)其基因水平的研究。經(jīng)過試驗(yàn)反復(fù)摸索之后，確立了電擊后的乳酸菌需要 在補(bǔ)充0.3mol/L蔗糖的MRS培養(yǎng)液中，37°C靜止培養(yǎng)1.5-3小時(shí)，再涂布平板的關(guān)鍵步驟建 立，有效的減少電擊后細(xì)胞在MRS培養(yǎng)基中破裂的情況。
[0040] 實(shí)施例2
[0041] 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募胺椒?為了對(duì)比實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化前后乳桿菌電轉(zhuǎn)化率變化，其中優(yōu)化后 的操作方法如實(shí)施例1所述，優(yōu)化前的操作方法如下：
[0042] 將乳桿菌單菌落接入MRS培養(yǎng)液中，37°C靜置培養(yǎng)過夜后，以2%接種量接入20m 1 MRS培養(yǎng)液中，37 °C靜置培養(yǎng)約4h左右，至培養(yǎng)液液600nm處紫外吸收值0.15-0.18，離心收 集菌體，用等體積的冰冷電擊緩沖液洗滌細(xì)胞2次。培養(yǎng)物懸浮于200μ1電擊緩沖液中。 [0043] 取ΙμL質(zhì)粒DNA與40μ1的冰冷細(xì)胞懸浮液混合后，移入電擊杯中置冰上5min，設(shè)置 電壓1175kV，電阻100Ω，電容25yF，然后釋放電脈沖，電擊完畢向杯子中加入400μ1的MRS培 養(yǎng)液，再吸入微量離心管中，37°C靜止培養(yǎng)2~3h，取100μΙ涂布在含氯霉素的MRS平板上，培 養(yǎng)24-36h，具體操作參考《微生物技術(shù)》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊。
[0044] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0045] 表1優(yōu)化前后轉(zhuǎn)化率對(duì)照表
[0046]
[0047]注:轉(zhuǎn)化率為每單位質(zhì)量DNA分子獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)，單位為轉(zhuǎn)化子數(shù)每微克DNA分子。 [0048]如表1所示，通過多次實(shí)驗(yàn)后對(duì)比優(yōu)化前后的平均轉(zhuǎn)化率可以發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化 率較優(yōu)化前的轉(zhuǎn)化率有50多倍的提高，克服了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法重復(fù)性不好，轉(zhuǎn)化率低的問 題。
[0049]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的方法包括了干酪乳桿菌培養(yǎng)、干酪 乳桿菌電轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)，具體步驟為： 干酪乳桿菌培養(yǎng)： A. 從低溫冷凍冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳桿菌菌種，在MRS固體培養(yǎng)基上劃 線，37 °C厭氧倒置培養(yǎng)； B. 用無菌的接菌環(huán)挑取在MRS上生長好的菌落至試管里MRS液體培養(yǎng)基中，37°C靜止培 養(yǎng)過夜； C. 第二日將前一天生長好的菌液lmL轉(zhuǎn)接到50mL MRS液體里，37°C靜止生長至菌液 600nm處紫外吸收值為0.5-0.6時(shí)，準(zhǔn)備干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化； 干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化： D. 將干酪乳桿菌移入50mL離心管里，放到冰盒里靜置20分鐘后，放到提前預(yù)冷到4°C離 心機(jī)中5000r/min，5分鐘，棄掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀懸浮 于EPWB溶液中，放到提前預(yù)冷到4°C的離心機(jī)中5000r/min，5分鐘，棄掉水相，留下菌體，此 步驟重復(fù)3次，用40mL EPB溶液洗滌菌體一次，棄上清； E. 菌體用400yL的EPB溶液重懸，分裝500-300μ!7支(現(xiàn)用現(xiàn)配），用于電轉(zhuǎn)； F. 質(zhì)粒DNAlyg加入到之前制備好的干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混合，冰浴10分鐘； G. 將質(zhì)粒與干酪乳桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷的2mm電擊杯中，冰浴10分鐘； H. 用濾紙將電轉(zhuǎn)化杯表面擦干，放入電轉(zhuǎn)儀中，調(diào)節(jié)電壓2.3kV、電阻200Ω、電容25yF， 脈沖時(shí)間約為4_5ms; I. 向電擊杯中快速加入900yL的含有0.5 %甘氨酸的MRS，輕輕地用移液器吹吸混合后 移到一個(gè)無菌的Eppendorf管中，放到提前調(diào)至37°C的80-100rpm/min搖床內(nèi)孵育1.5-3小 時(shí)； 轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)： J. 孵育后的混合液離心，留下l〇〇yL上清，重新懸浮;然后涂布于含有選擇壓力的MRS瓊 脂平板上，37 °C無氧倒置培養(yǎng)24-36小時(shí)。2.如權(quán)利要求1所述的一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述的MRS培養(yǎng)基為 莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基，所述的EPWB溶液為:NaH2P〇4 0.6mmol/L和MgCl2 0. lmmol/L 配置而成，所述的溶液為EPWB溶液基礎(chǔ)上加入0.3mol/L蔗糖，調(diào)節(jié)pH為7.4，并滅菌4°C 保存。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，包括了干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化的具體方法和步驟，克服了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化重復(fù)性不好，轉(zhuǎn)化率低的問題，經(jīng)過合理優(yōu)化的干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，可以應(yīng)用于多種不同外源DNA表達(dá)，潛在的推動(dòng)了生物藥物基因的高效表達(dá)。
【IPC分類】C12N15/74
【公開號(hào)】CN105567725
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610053312
【發(fā)明人】余麗蕓, 侯喜林
【申請(qǐng)人】黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年1月27日