專利名稱：一種富含油脂新月菱形藻及其優(yōu)化培養(yǎng)基和規(guī)?；囵B(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，主要涉及到一株可用于開發(fā)生物柴油的富含油脂新月菱形藻藻種及優(yōu)化培養(yǎng)基和該藻種的規(guī)?；囵B(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
生物柴油(脂肪酸甲酯)，是一種可生物降解、無毒的可再生環(huán)保燃料能源，受到世界的廣泛關(guān)注。由于石油資源的枯竭以及環(huán)保法規(guī)加強(qiáng)，世界各國(guó)積極開展對(duì)生物柴油的研制和生產(chǎn)。目前，生物柴油主要是以植物和動(dòng)物脂肪酸為原料來生產(chǎn)的。例如，在美國(guó)，主要是以大豆、棕櫚、菜籽、動(dòng)物脂肪酸、玉米油、麻瘋樹為原來，東南亞國(guó)家則以一些熱帶植物的種子為原料。但是，由上述原料生產(chǎn)的生物柴油尚不能滿足當(dāng)前車用燃料需求量的一小部分，同時(shí)，使用植物原料在所有國(guó)家中均存在種植過程中產(chǎn)生的土地資源緊缺的問題，特別在我國(guó)人多地少的情況下，這個(gè)問題尤為突出。因此發(fā)現(xiàn)、開發(fā)新的生物柴油原料資源迫在眉睫，而且具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。微藻源油脂特點(diǎn)在于不需要利用大量的農(nóng)業(yè)產(chǎn)品為原料，而且可用海水作為天然培養(yǎng)基進(jìn)行大量繁殖。由微藻產(chǎn)生的油脂性質(zhì)更接近植物油脂，易于后續(xù)的加工，而且比陸生植物單產(chǎn)油脂高出幾十倍，因此具有非常大的開發(fā)潛力。20世紀(jì)80年代，美國(guó)的研究人員首次從不同類型微藻中篩選出生長(zhǎng)快、適應(yīng)能力強(qiáng)、含油量高的藻株，在Roswell等地建造室外養(yǎng)殖池進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將從藻類中提取的脂類用于內(nèi)燃機(jī)燃料的生產(chǎn)。目前通過篩選和改良，部分微藻品種的含油量已超過細(xì)胞干重的50%，產(chǎn)量能達(dá)到50g/(m2d)，每桶生物柴油的成本平均為94$。目前其價(jià)格雖不能與傳統(tǒng)柴油競(jìng)爭(zhēng)，但是隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，成本正逐漸降低，據(jù)推測(cè)至2010年以微藻為來源的生物柴油將具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。新月菱形藻(Nitzschia closterium)屬于硅藻門、羽紋綱、雙菱形目。新月菱形藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力之一，可以作為甲殼類、雙殼類和仔魚的餌料，在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。據(jù)報(bào)道，新月菱形藻的總脂肪含量為_50%，而且富含多種不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是開發(fā)開發(fā)生物質(zhì)能源和保健食品的理想材料。做為一種新型能源型生物，新月菱形藻在天然海水中的密度很低，遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)對(duì)其資源開發(fā)及利用的需要。實(shí)現(xiàn)新月菱形藻的高密度培養(yǎng)將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。因此新月菱形藻的優(yōu)良藻種選育、大規(guī)模養(yǎng)殖以及胞內(nèi)、外物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用成為當(dāng)今海洋微藻生物技術(shù)中急需解決的重要內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有微藻培養(yǎng)技術(shù)的不足，提供一種富含油脂的新月菱形藻及其規(guī)?；囵B(yǎng)方法。本發(fā)明技術(shù)方案包括新月菱形藻優(yōu)異藻種的篩選；
培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化；規(guī)?；囵B(yǎng)方法?，F(xiàn)分別說明如下1.新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6 藻種的篩選1.1藻株的命名和保藏本發(fā)明提供的藻株分類命名為新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6.該藻株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為 CGMCC No. 3747，保藏日期為2010年4月21日，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。1.2本發(fā)明所述的新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6藻種的篩選步驟如下采集青島棧橋附件的帶泥沙的海水，利用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)分離，獲得一株細(xì)胞呈紡錘形的藻種；再利用紫外線誘變技術(shù)對(duì)該藻種進(jìn)行紫外誘變，利用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，篩選生長(zhǎng)快速、油脂含量高的藻株，最終獲得保藏號(hào)為CGMCC No. 3747的新月菱形藻 (Nitzschia closterium)BC6。培養(yǎng)篩選新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的f/2培養(yǎng)基組成如下NaNO3 74. 8mg, NaH2PO4 4. 4mg, Na2SiO3 · 9H20 8. 4-16. 7mg, f/2 微量元素溶液 lml, f/2維生素溶液lml，定容到1000ml。121°C滅菌20min備用。上述f/2 培養(yǎng)基中，f/2 微量元素溶液=ZnSO4 · 4H20 23mg, MnCl2 · 4H20 178mg, CuSO4 · 5H20 IOmg, FeC6H5O7 · 5H20 3. 9g, Na2MoO4 · 2H20 7. 3mg, CoCl2 · 6H20 12mg, Na2EDTA 4. 35g，定容到 IOOOml0上述f72培養(yǎng)基中，f72維生素溶液維生素B120. 5mg,維生素Bl IOOmg,維生素 H 0. 5mg，定容到 IOOOml01. 3新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的生物特征如下該藻細(xì)胞呈紡錘形，中央膨大，兩端細(xì)長(zhǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)40-50 μ m，寬3-5 μ m，有硅質(zhì)細(xì)胞壁，中央有一細(xì)胞核，有2片黃褐色的色素體，位于細(xì)胞中央細(xì)胞核的兩側(cè)。該藻種在顯微鏡下的培養(yǎng)形態(tài)如圖1所示。2.適宜于新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的篩選優(yōu)化；為了進(jìn)一步提高新月菱形藻的生長(zhǎng)速度及油脂含量，本發(fā)明人對(duì)培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方進(jìn)行了篩選研究，優(yōu)化了最佳培養(yǎng)條件，并篩選了適用于新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的自養(yǎng)培養(yǎng)基和異養(yǎng)培養(yǎng)基配方，現(xiàn)分述如下2. 1適宜于新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的最佳培養(yǎng)發(fā)酵條件培養(yǎng)溫度范圍1546°C，在最佳培養(yǎng)溫度20°C時(shí)，藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率最高；初始pH范圍6. 5-8. 5，在最適pH值7. 5時(shí)，藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率最大；光照強(qiáng)度范圍54 μ mol · m_2 · s—1 108 μ mol · m_2 · s—1，在光照強(qiáng)度為 54 μ mo 1 · πΓ2 · S—1時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛，細(xì)胞生物量達(dá)到最大。2. 2適用于新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的自養(yǎng)培養(yǎng)基組成NaNO3 74. 8mg 120mg，最佳用量為 105mg, NaH2PO4 4. 5mg, Na2SiO3 · 9H2050mg 150mg，最佳用量為 IOOmg, FeC6H5O7 · 5H20 3mg,維生素 BP20 μ g，維生素 B12 0. 22 μ g,NaC13. 6g，將上述物質(zhì)溶解在IOOOml人工海水中；所述人工海水的組成為=MgCl2 4. 98g， KBr 0. 096g, NaF 0. 003g, SrCl2 0. 024g, H3BO3 0. 026g, NaHCO3 0. 192g, CaCl2 1. 102g, KCl 0. 664g, Na2SO4 3. 917g，NaCl 23. 476g，溶于 IL 蒸餾水中；用 0. Imol .171 的 HCl 和 / 或 NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為7. 5。2. 3適用于新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的異養(yǎng)培養(yǎng)基在自養(yǎng)培養(yǎng)基中加入0. 重量份數(shù)的葡萄糖，獲得異養(yǎng)培養(yǎng)基。上述優(yōu)選培養(yǎng)基同最初分離培養(yǎng)用的f/2培養(yǎng)基相比，Na2SiO3 · 9H20由原來的 8. 4-16. 7mg · Γ1 提高至Ij IOOmg · Γ1，NaNO3 由 74. 8mg · Γ1 提高至Ij 105mg · Γ1，NaCl 添力口量為 27g · L-1。2. 4不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果對(duì)比在培養(yǎng)發(fā)酵過程中，使用本發(fā)明優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，新月菱形藻能夠更好的生長(zhǎng)。對(duì)新月菱形藻的生長(zhǎng)密度及油脂含量測(cè)定結(jié)果表明在優(yōu)化自養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，最大比生長(zhǎng)速率達(dá)到0. 117-(1"1 ；最高細(xì)胞密度可達(dá)16. 9X IO5 -πιΓ1, 比優(yōu)化前增長(zhǎng)了 2. 2倍；油脂含量達(dá)到55%。在優(yōu)化異養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，最高比生長(zhǎng)速率達(dá)到0. 15 .(Γ1，最大細(xì)胞生長(zhǎng)密度為16. 6X IO5-Hir1 ；油脂含量達(dá)到65%。。而在f/2培養(yǎng)基中，新月菱形藻最大比生長(zhǎng)速率為0. 074 · cf1，細(xì)胞生長(zhǎng)密度最高達(dá)到7. 6 X IO5 ^mr1 ； 油脂含量為觀 50%。3.新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6的規(guī)?；囵B(yǎng)方法3. 1采用自養(yǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)——光合自養(yǎng)培養(yǎng)新月菱形藻新月菱形藻接種密度為2. 5X IO5細(xì)胞· πιΓ1，新月菱形藻與自養(yǎng)培養(yǎng)基體積比為1 10，初始？!1控制在7.5，培養(yǎng)溫度為201，光照強(qiáng)度為討1111101*111_2*8_1，通氣量為 5L· HiirT1，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3. 2自養(yǎng)培養(yǎng)液中新月菱形藻的細(xì)胞濃縮 自養(yǎng)培養(yǎng)液自然沉淀后，高速離心，棄上清液，保留自養(yǎng)細(xì)胞沉淀。3. 3采用異養(yǎng)培養(yǎng)基規(guī)?；囵B(yǎng)將3. 2得到的自養(yǎng)細(xì)胞，重新懸浮于異養(yǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞初始密度為IOX IO5 個(gè)/ml。異養(yǎng)培養(yǎng)開始時(shí)，調(diào)整氧飽和度達(dá)到100%，溫度18-22°C，通氣速率150-250L/ h，異養(yǎng)培養(yǎng)體系的pH控制在6. 5-8的范圍之內(nèi)，攪拌速度為120r/min，光照強(qiáng)度為 Μμπιο ·πΓ2 · s—1。當(dāng)細(xì)胞密度超過100g/L時(shí)，終止培養(yǎng)。異養(yǎng)規(guī)模化培養(yǎng)時(shí)間介于 200-300h 之間。3. 4藻細(xì)胞收集、干燥及存放采用固-液分離技術(shù)從異養(yǎng)培養(yǎng)液中收集藻細(xì)胞，包括藻細(xì)胞的自然沉淀、過濾、 離心和冷凍干燥；藻細(xì)胞以固體干粉形式存放。4.新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6藻細(xì)胞中的油脂提取及應(yīng)用采用溶劑浸提法提取藻細(xì)胞中的油脂，所得油脂用于制備生物柴油等燃料油。


圖1是新月菱形藻在f/2培養(yǎng)基中的培養(yǎng)形態(tài)。
圖2是最佳培養(yǎng)條件下新月菱形藻在三種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。圖3是三種培養(yǎng)基培養(yǎng)新月菱形藻藻體中油脂的含量。其中，1 :F/2培養(yǎng)基；2 優(yōu)化培養(yǎng)基自養(yǎng)培養(yǎng)；3 優(yōu)化培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)圖4是不同培養(yǎng)溫度對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響。圖5是不同初始PH值對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響。圖6是不同光照強(qiáng)度對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響。圖7是不同NaNO3含量對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響。圖8是不同NaCl含量對(duì)新月菱形藻生長(zhǎng)的影響。圖9是5L生物反應(yīng)器中異養(yǎng)轉(zhuǎn)化后微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)通過列舉實(shí)施例方式，對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案予以詳細(xì)說明。實(shí)施例1新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6藻株的篩選及生物特征1. 1新月菱形藻BC6藻種分離如下采集青島棧橋附件的帶泥沙的海水，利用m培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)分離，獲得一株細(xì)胞呈紡錘形的藻種，該藻種在顯微鏡下初步鑒定為新月菱形藻；利用紫外線誘變技術(shù)對(duì)該藻種進(jìn)行紫外誘變，利用m培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，篩選生長(zhǎng)快速、油脂含量高的藻株，最終獲得一株新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6 ；利用f/2對(duì)該藻種進(jìn)行培養(yǎng)、保存；并在 CGMCC 保藏，保藏號(hào) CGMCC No. 3747。1. 2該藻細(xì)胞呈紡錘形，中央膨大，兩端細(xì)長(zhǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)40-50 μ m，寬3-5 μ m,有硅質(zhì)細(xì)胞壁，中央有一細(xì)胞核，有2片黃褐色的色素體，位于細(xì)胞中央細(xì)胞核的兩側(cè)。圖1所示為在顯微鏡下該藻種在f/2培養(yǎng)基中的培養(yǎng)形態(tài)。實(shí)施例2培養(yǎng)液中新月菱形藻BC6細(xì)胞數(shù)量和比生長(zhǎng)速率的測(cè)定方法用比色法測(cè)定生物量，建立細(xì)胞個(gè)數(shù)與吸光度關(guān)系曲線2. 1吸光值的測(cè)定取新鮮培養(yǎng)液，3500rpm離心15min，棄上清液，以無菌f/2培養(yǎng)基懸浮，再次離心，定容到一定的濃度，用721型分光光度計(jì)在0D_nm波長(zhǎng)下測(cè)定新月菱形藻的吸光值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。2. 2細(xì)胞計(jì)數(shù)取Iml藻液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，加入2-5滴0. 1 %的碘液，殺死游動(dòng)的藻細(xì)胞，于顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。2. 3比生長(zhǎng)速率的測(cè)定利用下式計(jì)算比生長(zhǎng)速率μ = (InNt-InN0)/t式中μ為比生長(zhǎng)速率，t為培養(yǎng)天數(shù)(d)，N0為培養(yǎng)開始時(shí)藻體的吸光值，Nt為培養(yǎng)t天后藻體的吸光值。實(shí)施例3新月菱形藻BC6的培養(yǎng)條件優(yōu)化，按以下步驟進(jìn)行3. 1新月菱形藻BC6接種密度為2. 5 X IO5細(xì)胞μΓ1，按新月菱形藻BC6與培養(yǎng)基體積比為1 5的接種比例接種新月菱形藻BC6到含有f/2培養(yǎng)基的三角瓶中，分別選取
715°C、20°C、23°C、26°C、30°C 為處理溫度，pH 值為 7. 5，光照強(qiáng)度為 54 μ mo 1 · m_2 · s-1 光暗比為12h/12h，每天搖動(dòng)3次條件下進(jìn)行不充氣培養(yǎng)。每2天取樣一次，連續(xù)觀測(cè)10d，測(cè)定不同溫度對(duì)新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)影響。每組分設(shè)2個(gè)平行組，以下同。結(jié)果見圖4，新月菱形藻BC6在15-26°C均能正常生長(zhǎng)。培養(yǎng)溫度在20°C時(shí)，其生長(zhǎng)密度明顯高于其他溫度，在前5d就表現(xiàn)出較高的生長(zhǎng)速度，比生長(zhǎng)速率均保持在0. 1 .d-1 以上，第6d時(shí)可獲得最高比生長(zhǎng)速率0. 1127 · cT1，此后仍能以較快速度生長(zhǎng)，到第IOd時(shí)比生長(zhǎng)速率還可高達(dá)0. 07 .^10當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到30°C時(shí)，前5d藻細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)，但此后并沒有明顯的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而且比生長(zhǎng)速率雖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降。由此可以認(rèn)為這種新月菱形藻BC6在低溫范圍有利于生長(zhǎng)，在培養(yǎng)溫度為20°C時(shí)可獲得最大的比生長(zhǎng)速率和最高的吸光值，而高溫(30°C )最終對(duì)生長(zhǎng)不利。3. 2根據(jù)實(shí)驗(yàn)3. 1選擇溫度為200C，初始pH值為5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0，其他見
3. 1，測(cè)定不同初始pH對(duì)新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)影響。結(jié)果見圖5，初始pH在6. 5-8. 5范圍內(nèi)藻細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，最適pH值為7. 5，比生長(zhǎng)速率最大可達(dá)0. 125 · Cf1 ；而pH值過低或過高都會(huì)降低藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，藻細(xì)胞基本處于抑制狀態(tài)。雖然初始PH值為5. 0-9. 0，但是在生長(zhǎng)過程中，培養(yǎng)液PH值會(huì)逐漸升高，到第 5d培養(yǎng)結(jié)束pH值上升到5. 5-9. 5，因此在第5d需再次調(diào)節(jié)pH值，直到培養(yǎng)結(jié)束。3. 3根據(jù)實(shí)驗(yàn)3. 1和3. 2選擇溫度為20°C，pH為7. 5，光照強(qiáng)度為Mymol ·πΓ2 .s—1、 108 μ mo 1 ·πΓ2 · S-1、162 μ mo 1 · πΓ2 · s"\216ymol · πΓ2 · s、其他見 3. 1，測(cè)定不同光照強(qiáng)度對(duì)新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)影響。結(jié)果見圖6，在Mymol · m_2 · s^-lOSymol · m_2 · s—1光強(qiáng)范圍內(nèi)，新月菱形藻 BC6均能保持正常生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置光照強(qiáng)度為M μ mol · m_2 · s—1時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛，細(xì)胞生物量達(dá)到最大1. 31 X IO61Iir1,比生長(zhǎng)速率達(dá)到最0. 1 · Cf1。當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到 162 μ mol ·πΓ2 · s^-216ymol · m_2 · s-1時(shí)，接種后前4天的生長(zhǎng)速度未有顯著變化，但在 5天后即表現(xiàn)出明顯的受抑狀態(tài)，比生長(zhǎng)率隨光照強(qiáng)度的增加呈下降趨勢(shì)，說明新月菱形藻 BC6對(duì)強(qiáng)光耐受力較弱，因此培養(yǎng)時(shí)取M μ mol · m_2 · s—1為宜。實(shí)施例4新月菱形藻BC6的培養(yǎng)基優(yōu)化篩選，按以下步驟進(jìn)行4. 1在溫度為20°C、初始pH為7. 5、光照強(qiáng)度為54 μ mol ·πΓ2 ·。、、其他與3. 1相同的條件下，在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，以NaNO3為氮源，改變培養(yǎng)基中的NaNO3量為 Omg · lA45mg · 1^、74· 8mg · r\l05mg · r\l20mg · L—1，測(cè)定不同濃度的 NaNO3 對(duì)新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)影響。結(jié)果見圖7，當(dāng)NaNO3含量在74. 8_105mg · Γ1時(shí)，可獲得較高藻體濃度，尤其是當(dāng)含量達(dá)到105mg · Γ1時(shí)，比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值0. 1217 · cf1。但藻體濃度并不是隨著氮濃度的升高而升高，當(dāng)NaNO3含量達(dá)到120mg -Γ1時(shí)，藻體生長(zhǎng)開始出現(xiàn)抑制作用，但不十分明顯，比生長(zhǎng)速率仍可達(dá)到0. 088 · cf1。當(dāng)NaNO3低于74. Smg · L—1時(shí)，藻體生長(zhǎng)速度降低，當(dāng)含氮量為Omg · L—1時(shí)，藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率下降至0. 0587 · d—1，三角瓶中藻體顏色逐漸變白， 而且在顯微鏡下可以觀察到藻體細(xì)胞稀少，很多藻體已死亡。由此可見，氮源濃度是影響新月菱形藻生長(zhǎng)得關(guān)鍵因素。因此認(rèn)為，最適合的NaNO3添加量為105mg · L—1。4. 2在溫度為20°C、初始pH為7. 5、光照強(qiáng)度為54 μ mol · m_2 · s_\其他與3. 1相同的條件下，在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，改變培養(yǎng)基中的Na2SiO3 ·9Η20添加量，測(cè)定不同濃度的Na2SiO3 · 9Η20對(duì)新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)影響。試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)Na2SiO3 · 9Η20含量在50mg 150mg · Γ1時(shí)，可獲得較高藻體濃度，尤其是當(dāng)含量達(dá)到IOOmg · Γ1時(shí)，比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，因此認(rèn)為，最適合的 Na2SiO3 · 9Η20 添加量為 IOOmg · L—1。4.3.在溫度為20°C、初始ρΗ為7. 5，光照強(qiáng)度為Mymol ·πΓ2…1，其他與3. 1相同的條件下，在培養(yǎng)基其他成分不變的情況下，變化培養(yǎng)基中的NaCl含量為Og-L-1UOg化―1、 23. 4g · r\27g · L-1JOg · L—1，測(cè)定不同濃度的NaCl對(duì)新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)影響。結(jié)果見圖8，在23. 4g_30g之間均能正常生長(zhǎng)，其中在NaCl添加量為27g · Γ1時(shí)， 藻體細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛，最大比生長(zhǎng)速率達(dá)到0. 1164 · cf1，當(dāng)NaCl添加量為Og時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，藻體顏色加深，呈片狀，并貼在瓶壁上。按照上述實(shí)驗(yàn)方式，本發(fā)明人對(duì)培養(yǎng)基其余組分也進(jìn)行了篩選優(yōu)化，從而優(yōu)選出一種適用于新月菱形藻BC6的培養(yǎng)基，即本發(fā)明所公開的自養(yǎng)培養(yǎng)基，其組成如下NaNO3 74. 8mg 120mg, NaH2PO4 4. 5mg, Na2SiO3 ‘ 9H20 50mg 150mg, FeC6H5O7 · 5H20 3mg,維生素 B1 220 μ g,維生素 B12 0. 22 μ g, NaC13. 6g，將上述物質(zhì)溶解在 1000ml人工海水中；所述人工海水的組成為=MgCl2 4. 98g，KBrO. 096g, NaF 0. 003g, SrCl2 0. 024g, H3BO3 0. 026g, NaHCO3 0. 192g, CaCl2L 102g, KCl 0. 664g, Na2SO4 3. 917g, NaCl 23. 476g，溶于IL蒸餾水中；用0. Imol · L—1的HCl和/或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為 7. 5。其中，NaN0374.8mg 120mg，最佳用量為 105mg, Na2SiO3 ·9Η20 50mg 150mg · Λ 最佳用量為IOOmg · ΙΛ NaCl最佳用量為27g · L—1。本發(fā)明所述異養(yǎng)培養(yǎng)基組成為在自養(yǎng)培養(yǎng)基中加入0. 重量份數(shù)的葡萄糖， 即獲得異養(yǎng)培養(yǎng)基。實(shí)施例5.新月菱形藻BC6在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)密度及油脂含量測(cè)定對(duì)比5. 1新月菱形藻BC6生長(zhǎng)速率在溫度20°C、初始pH 7. 5，光照強(qiáng)度M μ mol ·πΓ2 -s"1的條件下，利用f/2培養(yǎng)基、 自養(yǎng)培養(yǎng)基和異養(yǎng)培養(yǎng)基分別培養(yǎng)新月菱形藻BC6，采用比生長(zhǎng)速率測(cè)定新月菱形藻BC6 分別在三種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，同時(shí)對(duì)三種培養(yǎng)基中的藻體進(jìn)行油脂含量的測(cè)定。新月菱形藻BC6的生長(zhǎng)狀況見圖2。在自養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，第2-5天的比生長(zhǎng)速率均保持在0. 1 · cf1以上，其最大比生長(zhǎng)速率出現(xiàn)在第2天，達(dá)到0. 117 .d-1 ；6-10天，細(xì)胞密度持續(xù)增長(zhǎng)，到第10天時(shí)仍未到達(dá)平臺(tái)期。最高細(xì)胞密度可達(dá)16. 9 X IO51Iir1,比優(yōu)化前增長(zhǎng)了 2. 2倍。在異養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞生長(zhǎng)比自養(yǎng)更迅速，第2天比生長(zhǎng)速率就達(dá)到0. 126 · cT1，第3天達(dá)到最高為0. 15 · cf1，在4、5、6、7 天分別為0. 139 · cf1、?！?128 · cf1、。· 114 · d—1、?！?1 · cf1，雖然比生長(zhǎng)速率均保持在0. 1 · cf1 以上，但細(xì)胞密度增長(zhǎng)速度趨于緩慢，到第10天時(shí)最大細(xì)胞密度為16. 6X IO5 · πιΓ1. f/2 培養(yǎng)基中，新月菱形藻在第6d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第8d后達(dá)到平穩(wěn)期，其最大比生長(zhǎng)速率為 0. 074 · cf1，細(xì)胞生長(zhǎng)密度最高達(dá)到7. 6 X IO5Iiir105. 2新月菱形藻BC6油脂含量對(duì)藻體進(jìn)行油脂含量測(cè)定。取培養(yǎng)IOd的藻液500ml，3500rpm，離心15min，收集藻體，真空冷凍干燥藻體，用研缽充分研磨，取藻粉稱重，采用溶劑浸提法，提取溶劑為石油醚、乙醚混合液(體積比為2 1)，將研磨后的藻粉加入提取溶劑，40°C條件下，浸提證。 期間振蕩混勻，待提取結(jié)束，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鉀溶液沉淀藻細(xì)胞，靜置一段時(shí)間后，混合液在6000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集上清液于恒重離心管中，于60°C水浴迅速蒸去多余溶劑，稱重，計(jì)算油脂含量。結(jié)果見圖3，利用三種培養(yǎng)基培養(yǎng)新月菱形藻，發(fā)現(xiàn)藻體中油脂含量不同，其中在異養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的新月菱形藻含油量最高，達(dá)到65% ；其次為自養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)的新月菱形藻，油脂含量達(dá)到；用普通m培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)其油脂含量?jī)H為 50%。實(shí)施例6.新月菱形藻BC6的規(guī)?；囵B(yǎng)方法6. 1光合自養(yǎng)培養(yǎng)新月菱形藻BC6新月菱形藻BC6接種密度為2. 5 X IO5細(xì)胞· ml—1，按新月菱形藻BC6與培養(yǎng)基體積比為1 10的接種比例接種新月菱形藻到裝有自養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，初始PH控制在 7. 5，培養(yǎng)溫度為20°C，光照強(qiáng)度為M μ mol · m_2 · s—1，通氣量為5L · mirT1，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。6. 2新月菱形藻BC6的細(xì)胞濃縮由于新月菱形藻比重較大，首先采用自然沉淀的方法將自養(yǎng)培養(yǎng)好的新月菱形藻 BC6靜置5h，然后采用高速離心技術(shù)，4000r/min離心lOmin，離心后棄上清液，保留自養(yǎng)細(xì)胞沉淀。6. 3新月菱形藻BC6的規(guī)?；愷B(yǎng)培養(yǎng)將收集得到的自養(yǎng)細(xì)胞，重新懸浮于異養(yǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞初始密度為IOX IO5個(gè) /ml。異養(yǎng)培養(yǎng)可在不同容積的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，本實(shí)施例是在5L生物反應(yīng)器中進(jìn)行。 異養(yǎng)培養(yǎng)之前，組裝好溫度、PH、溶氧電極(校正)和消泡電極，加入異養(yǎng)培養(yǎng)基并高壓滅菌。異養(yǎng)培養(yǎng)條件設(shè)定如下發(fā)酵開始時(shí)，調(diào)整罐壓、空氣流量及轉(zhuǎn)速使初始氧飽和度達(dá)到 100%，溫度18-22°C，通氣速率150-250L/h，補(bǔ)加酸堿溶液將發(fā)酵體系的pH控制在6. 5-8 的范圍之內(nèi)，攪拌速度為120r/min，保留光照，光照強(qiáng)度為M μ mol · m_2 · s—1。每天定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞密度。當(dāng)細(xì)胞密度超過100g/L時(shí)，終止培養(yǎng)?？偖愷B(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間介于200-300h 之間。為了防止自養(yǎng)培養(yǎng)和細(xì)胞濃縮過程可能引起的雜菌污染，在異養(yǎng)培養(yǎng)液中添加抗生素抑制雜菌生長(zhǎng)，主要添加鏈霉素，使用濃度為0. lg/L。6. 4藻細(xì)胞收集與干燥及油脂的提取從發(fā)酵液中收集藻細(xì)胞主要采用固-液分離技術(shù)分離，包括藻細(xì)胞的自然沉淀、 過濾、離心和干燥。分離得到的藻細(xì)胞主要以冷凍干燥方式干燥，固體形態(tài)(干粉)存放。實(shí)施例7采用溶劑浸提法提取藻細(xì)胞中的油脂取新月菱形藻BC6干粉，研磨粉碎后，加入石油醚、乙醚等提取溶劑，40°C條件下， 浸提證。期間振蕩混勻，待提取結(jié)束，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鉀溶液沉淀藻細(xì)胞，靜置一段時(shí)間后，混合液在6000rpm轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集上清液于恒重離心管中，在60°C水浴迅速蒸去多余溶劑，所得油脂用于制備生物柴油。
權(quán)利要求
1.一種富含油脂新月菱形藻，其分類命名為新月菱形藻(Nitzschia closterium) BC6 ；該藻株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 3747，保藏日期為2010年4月21日。
2.如權(quán)利要求1所述新月菱形藻BC6的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下操作步驟優(yōu)化培養(yǎng)條件；優(yōu)化篩選自養(yǎng)培養(yǎng)基和異養(yǎng)培養(yǎng)基；采用自養(yǎng)培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)和采用異養(yǎng)培養(yǎng)基規(guī)?；囵B(yǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述新月菱形藻BC6的規(guī)?；囵B(yǎng)方法，其特征在于所說的優(yōu)化培養(yǎng)條件如下培養(yǎng)溫度范圍15j6°C，在最佳培養(yǎng)溫度20°C時(shí)，藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率最高；初始pH范圍6. 5-8. 5，在最適pH值7. 5時(shí)，藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率最大；光照強(qiáng)度范圍 54 μ mol · πΓ2 · s^-108 μ mol · πΓ2 · s—1，在光照強(qiáng)度為 54 μ mol · πΓ2 · s"1 時(shí)，藻細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛，細(xì)胞生物量達(dá)到最大。
4.如權(quán)利要求2所述新月菱形藻BC6的規(guī)?；囵B(yǎng)方法，其特征在于所說的優(yōu)化培養(yǎng)條件如下最佳培養(yǎng)溫度20°C ；最適PH值7. 5 ；最佳光照強(qiáng)度為M μ mol · m_2 · s—1。
5.如權(quán)利要求2所述新月菱形藻BC6的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于所說的優(yōu)化篩選的自養(yǎng)培養(yǎng)基的組成如下NaNO3 74. 8mg 120mg, NaH2PO4 4. 5mg, Na2SiO3 · 9H20 50mg 150mg, FeC6H5O7 · 5H20 3mg,維生素B1 220 μ g,維生素B12O. 22 μ g, NaCl 3. 6g，將上述物質(zhì)溶解在1000ml人工海水中；所述人工海水的組成為=MgCl2 4. 98g，KBrO. 096g, NaF 0. 003g, SrCl2 0. 024g, H3BO3 0. 026g, NaHCO3 0. 192g, CaCl2L 102g, KCl 0. 664g, Na2SO4 3. 917g, NaCl 23. 476g，溶于 IL 蒸餾水中；用0. Imol · L—1的HCl和/或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為7. 5。
6.如權(quán)利要求5所述新月菱形藻BC6的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于所說的優(yōu)化篩選的自養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化組成如下NaNO3 105mg, NaH2PO4 4. 5mg, Na2SiO3 · 9H20 IOOmg, FeC6H5O7 · 5H20 3mg,維生素 B1 220 μ g，維生素B12 0. 22 μβ，Νεια3.6β，將上述物質(zhì)溶解在1000ml人工海水中；所述人工海水的組成為MgCl2 4. 98g, KBr 0. 096g, NaF 0. 003g, SrCl2 0. 024g, H3BO3 0. 026g, NaHCO3 0. 192g, CaCl2 1. 102g, KCl 0. 664g, Na2SO4 3. 917g, NaCl 23. 476g，溶于 IL 蒸餾水中；用 0. Imol · L—1的HCl和/或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為7. 5。
7.如權(quán)利要求2所述新月菱形藻BC6的規(guī)模化培養(yǎng)方法，其特征在于所說的優(yōu)化篩選的異養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為在自養(yǎng)培養(yǎng)基中加入0. 重量份數(shù)的葡萄糖。
8.如權(quán)利要求2所述新月菱形藻BC6的規(guī)?；囵B(yǎng)方法，其特征在于所說的自養(yǎng)培養(yǎng)過程如下新月菱形藻接種密度為2. 5X IO5細(xì)胞^mr1,新月菱形藻與自養(yǎng)培養(yǎng)基體積比為 1 10，初始pH控制在7.5，培養(yǎng)溫度為20°C，光照強(qiáng)度為Mymol ·πΓ2 · s—1，通氣量為 5L · HiirT1，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；然后，自養(yǎng)培養(yǎng)液自然沉淀后，離心分離，保留自養(yǎng)藻細(xì)胞沉淀。
9.如權(quán)利要求2所述新月菱形藻BC6的規(guī)?；囵B(yǎng)方法，其特征在于所說的異養(yǎng)規(guī)?；囵B(yǎng)過程如下將自養(yǎng)藻細(xì)胞重新懸浮于異養(yǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞初始密度為10X IO5個(gè)/ml。異養(yǎng)培養(yǎng)開始時(shí)，調(diào)整氧飽和度達(dá)到100%，溫度18-22°C，通氣速率150-250L/h，異養(yǎng)培養(yǎng)體系的pH控制在6. 5-8的范圍之內(nèi)，攪拌速度為120r/min，光照強(qiáng)度為54 μ mo 1 ·πΓ2…1。當(dāng)細(xì)胞密度超過100g/L時(shí)，終止發(fā)酵?？偖愷B(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間介于200-300h之間；采用固-液分離技術(shù)從異養(yǎng)培養(yǎng)液中收集藻細(xì)胞，冷凍干燥；以固體干粉形式存放。
10.如權(quán)利要求1所述新月菱形藻BC6的應(yīng)用，其特征在于采用溶劑浸提法提取藻細(xì)胞中的油脂，所得油脂用于制備生物柴油。
全文摘要
本發(fā)明屬于可再生生物能源領(lǐng)域，涉及一種可用于開發(fā)生物柴油的富含油脂新月菱形藻藻種及優(yōu)化培養(yǎng)基和該藻種的規(guī)?；囵B(yǎng)方法。所述藻種為新月菱形藻(Nitzschia closterium)BC6，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.3747；所述優(yōu)化培養(yǎng)基為本發(fā)明人優(yōu)選自養(yǎng)培養(yǎng)基和異養(yǎng)培養(yǎng)基；所述規(guī)?；囵B(yǎng)方法包括光合自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)規(guī)模化培養(yǎng)。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，比生長(zhǎng)速率大，細(xì)胞密度高，油脂含量達(dá)到65％。
文檔編號(hào)C12N1/12GK102408994SQ20101023817
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者任艷, 宋莉璐, 張廣志, 張新建, 李紀(jì)順, 楊合同, 趙曉燕, 黃玉杰 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心