專利名稱：一種低溫α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種低溫α-半乳糖苷酶GalA17 及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α -半乳糖苷酶或蜜 二糖酶(a -D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22)是一種外切型糖苷酶，能夠催化α _D_半乳糖苷類化合物中的α _D_半乳糖殘基 的水解。這類糖苷包括半乳糖寡糖(如蜜二糖、棉子糖和水蘇糖)、分支多糖(如半乳甘露 聚糖)和半乳糖脂(Margolles-Clark E, et al. Eur J Biochem, 1996,240(1) :104_11·)。目前，已通過多種純化技術(shù)從真菌、細(xì)菌、酵母、植物和人中分離得到α-半乳糖 苷酶。不同來源的α-半乳糖苷酶其理化性質(zhì)存在極大的差異。植物來源的α-半乳糖苷 酶根據(jù)其作用PH的不同分為酸性α-半乳糖苷酶和堿性α-半乳糖苷酶。真菌和酵母來 源的α-半乳糖苷酶的作用最適ρΗ在3. 0-6.0之間，而細(xì)菌來源的α-半乳糖苷酶則比真 菌有更高的最適PH(5. 0-7. 5)(李孝輝等，微生物學(xué)通報(bào)，2002，29 :71_74.)。根據(jù)氨基酸序 列相似性，α-半乳糖苷酶被劃分到四個(gè)不同的糖苷水解酶家族中，即4家族，27家族，36 家族和57家族。研究最多的α -半乳糖苷酶分布于27家族和36家族，真菌來源的α -半 乳糖苷酶多數(shù)屬于27家族，而36家族的α-半乳糖苷酶多數(shù)來源于細(xì)菌(Henrissat，et al.Biochem J,1993，293 :781_788·)。棉籽糖家族寡糖(RFOs，主要是棉籽糖和水蘇糖)是食品和飼料中(特別是豆類) 的抗?fàn)I養(yǎng)因子。外源α-半乳糖苷酶的添加可以經(jīng)濟(jì)有效地去除這種抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外， 食品及飼料工業(yè)中還要求添加的α-半乳糖苷酶對(duì)各種α-半乳糖苷類寡糖都要具有較高 的水解能力，而以前報(bào)道的α-半乳糖苷酶不能水解多種底物，在應(yīng)用上各具有其局限性。 不同來源的微生物α“半乳糖苷酶根據(jù)其性質(zhì)特性的不同被應(yīng)用于不同的領(lǐng)域。本發(fā)明得到了一個(gè)來源于天牛胃腸道共生菌Flavobacterium sp. TW7的α -半 乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶具有低溫特性，作用ρΗ范圍較廣，良好的抗蛋白酶 能力，較好的水解各種底物的能力，該酶作為一種新型的酶制劑，可廣泛的應(yīng)用于飼料、食 品、醫(yī)藥等行業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的低溫α -半乳糖苷酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述低溫α -半乳糖苷酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述耐低溫α “半乳糖苷酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述低溫α-半乳糖苷酶的應(yīng)用。本發(fā)明從天牛腸道分離菌(Flavobacterium sp. TN17,其保藏號(hào)為CGMCCNo. 4009)中分離得到一種新的低溫α -半乳糖苷酶GalA17。根據(jù)本發(fā)明的低溫α-半乳糖苷酶GalA17，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示:mkkhitnlrqsfgiaffνlasycspvsaqqiisvktksnalvlqvtpgkelntiyIgeklandfdyvki qgqfkqgtdysgiynaaytpsgsknllepaiavthadgntsldlIyvdhktttvstgvsqteitlkdnvypievhlf iqsyydtdiieqwttikhaekgnitlnkyasanlylkgynnfylnqyhgdwakemqpeesklthgikvldtklgsra nlfqpsvfmvsldkpateddgkvlfaglewsgnfrtdieIdplnnlrvisginnaaaayslakntvfttpkfwytls skgkghasrnlhdwsrnykildgkgsrltllnnweatyfnfdedklkvliadskklgvdmfllddgwfgnnfprnnd daalgdwdvnkkklpngigtlvktakdnqvkfgiwiepemvnpasdlykkhpewivkqpgrtehyfrnqlvldlsnp kvqdfvygvvdnlftenpelayikwdcnaviynayssnlkdkqnnfytdyvtglykvlerirvkyptvpmmlcsggg grvdyaamkyftefwpsdntdplervymqweysyfypaltiaahvtdwgkqpikyrtdvammgrlgfdivvkdlnek dltfaqqaiknynalsntiwqgdqyrlqnpwgndaasvmfvnksgneavvfsysvnsryeagthlpiklkglqagqn ykveeinvypdkkpwetatysgdflmqvginpnvnstntsvvlkitka其中，該酶基因編碼734個(gè)氨基酸，N端28個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列“mkkh itnlrqsfgiaffvlasycspvsa" (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的低溫α -半乳糖苷酶GalA17的理論分子量為80. OkDa，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示qqiisvktksnalνlqvtpgkelntiylgeklandfdyvkiqgqfkqgtdysgiynaaytpsgsknlIe paiavthadgntsldlIyvdhktttvstgvsqteitlkdnvypievhlfiqsyydtdiieqwttikhaekgnitlnk yasanIylkgynnfylnqyhgdwakemqpeesklthgikvldtklgsranlfqpsvfmvsldkpateddgkvlfagl ewsgnfrtdieIdplnnlrvisginnaaaayslakntvfttpkfwytlsskgkghasrnlhdwsrnykildgkgsrl tllnnweatyfnfdedklkvliadskklgvdmfllddgwfgnnfprnnddaalgdwdvnkkklpngigtlvktakdn qvkfgiwiepemvnpasdlykkhpewivkqpgrtehyfrnqlvldlsnpkvqdfvygvvdnlftenpelayikwdcn aviynayssnlkdkqnnfytdyvtglykvlerirvkyptvpmmlcsggggrvdyaamkyftefwpsdntdplervym qweysyfypaltiaahvtdwgkqpikyrtdvammgrlgfdivvkdlnekdltfaqqaiknynalsntiwqgdqyrlq npwgndaasvmfvnksgneavvfsysvnsryeagthlpiklkglqagqnykveeinvypdkkpvvetatysgdfImq vginpnvnstntsvvlkitka本發(fā)明的0-半乳糖苷酶6&認(rèn)17的最適？!1值為5.5，最適溫度為451，在 30°C-50°C間均具有55%以上的酶活力；用胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、膠原蛋白酶處理60分 鐘，酶活性維持在90% ；具有多種底物的降解能力。本發(fā)明提供了編碼上述低溫α-半乳糖苷酶GalA17。具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID NO. 4所示
ATGAAAAAACACATTACCAATTTAAGGCAATCTTTTGGGATCGCATTTTTTGTGCTGGCGAG TTATTGCAGCCCGGTTTCGGCGl CAACAAATTATCTCAGTAAAAACAAAAAGTAATGCGCTTGTTTTGCAAGT TACTCCCGGAAAAGAGTTGAACACTATTTACTTAGGAGAAAAATTAGCCAATGATTTTGATTATGTAAAAATACAAG GACAGTTCAAACAAGGAACAGATTATTCAGGAATTTACAATGCAGCATATACACCATCTGGTTCTAAAAACTTATTA GAACCTGCAATTGCAGTAACACACGCTGACGGAAATACTTCGCTGGATTTATTATACGTAGATCAIAAAACGACTAC GGTAAGTACAGGAGTTTCTCAAACTGAAATTACCTTAAAAGACAATGTTTATCCAATTGAGGTTCATTTGTTTATTC AGTCTTACTATGATACTGATATTATAGAGCAATGGACAACGATTAAACATGCTGAAAAAGGAAATATTACTTTAAACAAATATGCTTCGGCTAATTTATATCTTAAAGGATATAACAATTTCTATTTGAATCAATATCACGGAGACTGGGCAAA AGAAATGCAGCCTGAAGAAAGCAAATTAACTCACGGAATTAAAGTGTTAGAIACTAAATTAGGTTCACGTGCGAATT TGTTTCAGCCTTCAGTATTTATGGTTTCTTTAGACAAACCAGCTACAGAAGATGACGGAAAAGTGTTATTTGCAGGT TTAGAATGGTCAGGAAATTTCCGTACAGATTTAGAATTAGATCCATTAAATAATCTTCGTGTTATTTCTGGTATTAA IAATGCAGCGGCAGCTTATTCTTTAGCTAAAAACACTGTATTTACAACTCCAAAATTTTGGTAIACTTTATCTTCTA AAGGAAAAGGACATGCAAGCCGTAACTTACACGACTGGTCAAGAAATTAIAAAATATTAGACGGAAAAGGAAGCCGT TTAACTTTGCTAAACAACTGGGAAGCTACTTATTTTAATTTTGATGAAGATAAACTAAAAGTGCTTATCGCTGAIAG TAAAAAACTTGGCGTTGATATGTTCTTATTAGATGACGGATGGTTCGGAAACAATTTTCCTCGTAACAATGACGACG CAGCTCTTGGAGACTGGGACGTAAACAAAAAGAAATTACCAAACGGAATCGGTACTTTGGTAAAAACAGCTAAAGAC AATCAGGTAAAATTCGGAATCTGGATTGAGCCGGAAATGGTAAACCCAGCGAGTGATTTGTATAAAAAACATCCGGA ATGGATTGTGAAACAACCGGGAAGAACGGAGCATTATTTCCGTAATCAATTGGTTTTAGATTTATCAAACCCTAAAG TTCAGGATTTTGTTTACGGAGTTGTAGACAATCTTTTTACAGAAAACCCGGAATTGGCGTATATCAAATGGGATTGT AATGCAGTAATTTACAACGCATATTCAAGCAATTTAAAAGACAAACAAAACAATTTCTATACAGATTATGTAACAGG ATTGTAIAAAGTTTTAGAGCGTATTCGTGTAAAATACCCTACAGTACCTATGATGCTTTGCTCTGGTGGTGGTGGTA GAGTAGATTATGCTGCAATGAAATACTTTACAGAATTCTGGCCAAGTGAIAACACAGATCCTTTAGAAAGAGTATTA TGCAATGGGAATACTCGTATTTTTACCCGGCTTTGACCATCGCAGCTCACGTAACAGATTGGGGAAAACAACCTATA AAATACCGTACAGATGTTGCCATGATGGGAAGATTAGGTTTTGATATTGTGGTAAAAGATTTAAACGAGAAAGATTT GACTTTTGCTCAACAAGCGATCAAAAATTATAATGCATTAAGCAACACAATCTGGCAAGGAGATCAATACCGTTTGC AAAATCCTTGGGGTAATGACGCGGCGTCTGTAATGTTTGTAAACAAAAGCGGAAACGAAGCAGTTGTATTTAGTTAT TCTGTTAATTCAAGATACGAAGCAGGAACACATCTTCCTATAAAATTAAAAGGATTACAAGCAGGACAAAACTATAA AGTAGAAGAAATCAACGTATATCCGGATAAAAAGCCTGTGGTAGAAACTGCGACTTATTCTGGTGATTTTTTAATGC AGGTTGGTATCAACCCGAATGTAAATTCTACTAATACGAGCGTTGTTTTAAAAATTACAAAGGCCTAA本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了 α -半乳糖苷酶基因galA17，DNA全序列分析 結(jié)果表明，α-半乳糖苷酶GalA17結(jié)構(gòu)基因galA17全長(zhǎng)2205bp。其中，信號(hào)肽的核苷酸序 列為ATGAAAAAACACATTACCAATTTAAGGCAATCTTTTGGGATCGCATTTTTTGTGCTGGCGAGTTATTGC AGCCCGGTTTCGGCG(SEQ ID NO. 5)。將α-半乳糖苷酶基因galA17序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行 BLAST比對(duì)。該基因與Pedobacter sp. BAL39來源的潛在α -半乳糖苷酶(EDM38577)具有 最高的一致性，為66. 6% ；與確證活性的Carnobacterium piscicola BA來源GH36 α -半 乳糖苷酶(AAL27305)的一致性為30. 1%。說明GalA17是一種新的α -半乳糖苷酶。本發(fā)明還提供了包含上述低溫α-半乳糖苷酶基因galA17的重組載體，優(yōu)選為 pET_galA17。將本發(fā)明的α -半乳糖苷酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之 間，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā) 明的α -半乳糖苷酶基因插入到質(zhì)粒pET_22b(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間， 得到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-galA17。本發(fā)明還提供了包含上述低溫α -半乳糖苷酶基因galA17的重組菌株，優(yōu)選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21/galA17。本發(fā)明還提供了一種制備低溫α -半乳糖苷酶GalA17的方法，包括以下步驟
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α -半乳糖苷酶表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的α -半乳糖苷酶GalA17。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21/galA17。本發(fā)明還提供了上述α-半乳糖苷酶GalA17的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個(gè)新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶最適ρΗ在 中性范圍(ΡΗ5. 5)，ρΗ穩(wěn)定性在中性ρΗ內(nèi)最佳，最適溫度較低(45°C)且在較低溫度(10°C ) 具有活性，熱穩(wěn)定性較差(<50°C但都能在37°C穩(wěn)定)。這些共同特征可能與天牛生存環(huán) 境(體溫隨自然環(huán)境溫度而變，但不低于0°C、不高于40°C)及腸道生理環(huán)境(腸道內(nèi)容物 PH為6. 5)密切相關(guān)。多種蛋白酶抗性(胰蛋白酶、膠原蛋白酶和α-糜蛋白酶)，可以有效 地水解角豆膠、瓜爾膠和豆粕，表明GalA17在食品和飼料添加劑方面具一定的應(yīng)用潛力。


圖1在大腸桿菌中表達(dá)的重組α -半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分 子量蛋白質(zhì)Marker ;1 含有α _半乳糖苷酶基因的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；2 純化的重組 α -半乳糖苷酶3 含有空載體的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；圖2重組α -半乳糖苷酶的最適ρΗ。圖3重組α -半乳糖苷酶的ρΗ穩(wěn)定性。圖4重組α -半乳糖苷酶的最適溫度。圖5重組α _半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性。黃桿菌Flavobacterium sp. i7，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏 號(hào)為CGMCC No. 4009。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體黃桿菌Flavobacterium sp. i7，保存于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)， 其保藏號(hào)為CGMCC No. 4009。大腸桿菌表達(dá)載體pET22b (+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3)購于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(1)產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌篩選培養(yǎng)基=Peptone 10g, NaCl 5g, Yeast extract 0. 5g, CMC 5g，剛果紅 0. 2g，MnS04 ·5Η20 0. 02g，MgSO4 · 7H20 0. 4g，ZnSO4 · 7H20 0. Olg，CuSO4 · 5H20 0. Olg, FeSO4 · 7H20 0. lg，CaCl2 · 2H20 0. lg，K2HPO4O. 5g，瓊脂 20g，加蒸餾水至 1000ml，ρΗ 自然(約為7)。(2) LB 培養(yǎng)基 ^ptone 10g，Yeast extract 5g, NaCl IOg,力口蒸餾水至 1000ml，PH自然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。實(shí)施例1 黃桿菌 Flavobacterium sp. TN17 的篩選利用剛果紅法對(duì)天牛胃腸道內(nèi)的共生微生物進(jìn)行纖維素酶及半纖維素酶的產(chǎn)酶 活性初篩。產(chǎn)酶越多或酶活越高，水解圈越大；產(chǎn)酶越快，水解圈出現(xiàn)越早。平板上一共隨 機(jī)挑取了 100株細(xì)菌。提取該100株細(xì)菌的基因組并擴(kuò)增得到了 16S rDNA。經(jīng)BLASTn比 對(duì)后，菌株TW7屬于黃桿菌屬，定名為黃桿菌Flavobacterium sp. TN170實(shí)施例2黃桿菌Flavobacterium sp. TN17 α -半乳糖苷酶編碼基因galA17克隆提取Flavobacterium sp. TN17 基因組 DNA 將液體培養(yǎng)Id的菌體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min， 然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇， 于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真 空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。 根據(jù)第36家族α -半乳糖苷酶基因的保守([F/L/V] -[L/V] -[L/M/V] -D-D-G-ff-F 和 E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E])序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物 GH36F，GH36RGH36F 5' -GACATGTTCGTGATGGACGAYGGNTGGTT-3‘；GH36R 5' -CGGACTCTGGGTTCACCATYTCNGGYTC-3‘)。以Flavobacterium sp. TN 17總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C 變性5min ；然后94°C變性30seC，44°C退火30seC，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后72°C保溫 IOmin0得到一約193bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術(shù)有限 公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各二條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì) 方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒 有嚴(yán)格規(guī)定，引物長(zhǎng)度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl， usp2(上游特異性引物)，dspl, dsp2(下游特異性引物)見表1。表1. α -半乳糖苷酶GalA17TAIL_PCR特異性引物
引物名稱引物序列(5'-3')引物長(zhǎng)度(bp)usplTACCAAAGTACCGATTCCGTTT22usp2AGAGCTGCGTCGTCATTGTTA21dsplAATGACGACGCAGCTCTTGG20dsp2ACGGAATCGGTACTTTGGTAAA22
通過TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博生物 技術(shù)有限公司測(cè)序，經(jīng)拼接后得α “半乳糖苷酶編碼基因galA17的序列如SEQ IDN0. 4所示。實(shí)施例3重組α -半乳糖苷酶的制備。將表達(dá)載體pET22b⑴進(jìn)行雙酶切(BamHI+HindlII)，同時(shí)將編碼α -半乳糖苷酶 的基因galA17雙酶切(BamHI+Hindlll)，切出編碼成熟α -半乳糖苷酶的基因片段與表達(dá) 載體pET22b (+)連接，獲得含有Flavobacterium sp. TN17 α -半乳糖苷酶的基因galA17的 重組質(zhì)粒pET-galA17并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21/galA17。取含有重組質(zhì)粒pET-galA17的E. coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET_22b (+)空 質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以0. 1 %的接種量接種于LB (含100 μ g/mLAmp)培養(yǎng)液中， 37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以接種量接種到新鮮的LB (含100μ g/mLAmp) 培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3h (OD600達(dá)到0. 6-1. 0)后，加入終濃度0. 7mM的IPTG誘導(dǎo)， 于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h或26°C振蕩培養(yǎng)約8h。12000rpm離心5min，收集培養(yǎng)基上 清。依次利用中空纖維超濾膜和超濾膜包(分子篩原理)對(duì)該初酶液進(jìn)行濃縮。以上胞外 濃縮的初酶液經(jīng)13，OOOrpm離心IOmin后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose純化目的蛋 白。SDS-PAGE結(jié)果(圖1)表明，重組α-半乳糖苷酶在大腸桿菌中得到了表達(dá)。所表達(dá)的 α-半乳糖苷酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的90%以上。實(shí)施例4重組α -半乳糖苷酶的活性分析酶活性測(cè)定方法采用pNPG法。將pNPG溶于0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 中，使其終濃度為2mmol/L。反應(yīng)體系含20 μ L適量酶液，230 μ L的IOOmM緩沖液和250 μ L 的2mmol/L底物。底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液再反應(yīng)5min，然后加1. 5mL IM Na2CO3終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在405nm波長(zhǎng)下測(cè)定釋放出的pNP。1個(gè)酶活單位⑶定義 為每分鐘分解PNP類化合物產(chǎn)生1 μ moIpNP所需的酶量。實(shí)施例5重組α -半乳糖苷酶GalA17的性質(zhì)測(cè)定1、重組α -半乳糖苷酶GalA17的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法如下酶的最適pH測(cè)定將實(shí)施例4純化的重組α-半乳糖苷酶GalA17在37°C和 PHI. 0-12. 0的緩沖液下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定將純化的酶液置于pHl. 0-12. 0 的緩沖液中，在37°C下處理Ih以上，然后在pH5. 5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶 液作為對(duì)照。緩沖液為0. IM KCl-HCl (pHl. 0-2. 0)，McIlvaine buffer (pH2. 0-8. 0)，0· IM Tris-HCl (ρΗ8. 0-9. 0)和 0. IM glycine-Na0H(pH9. 0-12. 0)。以 pNPGal 為底物，在 37°C下反 應(yīng)5min，測(cè)定純化的GalA17的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明GalA17的最適pH為5. 5，在pH5. 0-7. 0 之間，酶活> 55% (圖2)；經(jīng)pH5. 0-9.0的緩沖液37°C處理Ih后，剩余活性> 80% (圖 3)。2、重組α -半乳糖苷酶GalA17的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下酶的最適溫度測(cè)定在pH5. 5的緩沖液中，于0-80°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn) 定性測(cè)定將同樣酶量的酶液置于設(shè)定的溫度中(37°C，50°C或60°C )處理0-60min后，在 PH5. 5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。在45°C時(shí)，GalA17的酶活最高， 在30-50°C間具有> 55%的酶活(圖4)；經(jīng)37°C處理Ih后，GalA17仍較穩(wěn)定，而60°C處理 5min后，GalA17完全變性(圖5)。
3、重組α -半乳糖苷酶GalA17的Km值測(cè)定方法如下酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定一級(jí)反應(yīng)時(shí)間在pH5. 5及45°C下，以IM pNP類化合物作為 底物，依次在酶促反應(yīng)的2-30min內(nèi)終止反應(yīng)并測(cè)定酶活性，計(jì)算出酶活性與反應(yīng)時(shí)間的 比值，若在一定時(shí)間內(nèi)該比值保持穩(wěn)定，則此時(shí)間為一級(jí)反應(yīng)時(shí)間。用0. 05-1ΜρΝΡ化合物 作為底物，在pH5. 5、45°C和一級(jí)反應(yīng)時(shí)間下，根據(jù)Lineweaver-Burk方法測(cè)定Km、Vmax和 kcat。在 450C ρΗ5· 5 條件下，GalA17 對(duì) pNPGal 的 Km、Vmax 和 kcat 分別為 2. 47mM、476. 19 μ mol mirTW1 和 654. 62s-1。4、不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)GalA17酶活的影響測(cè)定方法如下在酶促反應(yīng)體系中加入IOmM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性的影響。在 37°C、ρΗ5· 5條件下測(cè)定酶活性。結(jié)果表明，IOmM的Ag+、Hg2+和SDS可完全抑制GalA17 ； Fe2+對(duì)GalA17的抑制較強(qiáng)(剩余酶活 30% )，Cr3+對(duì)GalA17的抑制較弱(剩余酶活 75% ) ；Mn2+、β -mercaptoethanol、Zn2+ 和 EDTA 可使 GalA17 的酶活提高 0. 2 倍；其余金 屬離子和化學(xué)試劑對(duì)GalA17的影響很小。5、α-半乳糖苷酶GalA17的抗蛋白酶能力酶的蛋白酶抗性用相當(dāng)于重組酶1/10 (w/w)的胰蛋白酶(ρΗ7.0)、α-糜蛋白酶 (ρΗ7. 0)或膠原蛋白酶(ρΗ7. 5)在37 °C對(duì)重組酶處理Ih，然后在pH5. 5及37 °C下進(jìn)行酶促 反應(yīng)，以在蛋白酶對(duì)應(yīng)PH緩沖液中但未加蛋白酶的酶液作為對(duì)照。經(jīng)胰蛋白酶、膠原蛋白 酶和α -糜蛋白酶處理Ih后，GalA17仍能分別保持98. 56%,95. 64%和92. 79%的酶活。 從以上結(jié)果可以看出GalA17對(duì)這三種蛋白酶都有良好的抵抗能力。5、α -半乳糖苷酶GalA17的底物特異性在37°C PH5. 5條件下，GalA17對(duì)pNPGal、水蘇糖、蜜二糖、棉籽糖、豆粕、角豆膠 和瓜爾膠的比活分別為 92. 95士4. 14,51. 22士0. 85,2. 52士0. 06,0. 84士0. 26,0. 87士0. 16、 0. 49 士 0. 07 和 0. 20 士 0. 04U mg-1。
權(quán)利要求
一種低溫α 半乳糖苷酶GalA17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的低溫α-半乳糖苷酶GalA17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.—種低溫α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，其編碼權(quán)利要求1或2所述的 低溫α-半乳糖苷酶GalA17。
4.如權(quán)利要求3所述的低溫α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 4。
5.如權(quán)利要求3所述的低溫α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，所述α_半乳 糖苷酶基因galA17的信號(hào)序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.包含權(quán)利要求3或4所述低溫α-半乳糖苷酶基因galA17的重組載體。
7.包含權(quán)利要求3或4所述低溫α-半乳糖苷酶基因galA17的重組菌株。
8.如權(quán)利要求7的重組菌株，其特征在于，其所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌 或乳酸桿菌。
9.一種黃桿菌 Flavobacterium sp. Tm7，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4009。
10.權(quán)利要求1或2所述低溫α-半乳糖苷酶GalA17的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種低溫α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于天牛胃腸道共生細(xì)菌Flavobacterium sp.TN17的α-半乳糖苷酶GalA17，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述α-半乳糖苷酶的編碼基因galA17。本發(fā)明的α-半乳糖苷酶具有以下性質(zhì)最適pH5.5，最適溫度45℃，在30-50℃間具有＞55％的酶活；良好的pH穩(wěn)定性；良好的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力；可作為一種飼料或食品添加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101892207SQ20101023853
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者周峻沛, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬君, 羅會(huì)穎, 袁鐵錚, 趙珩, 黃火清 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所