專利名稱：對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及蘇云金芽孢桿菌對鱗翅目害蟲高毒力的新 的殺蟲基因cryX及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蟲害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，減少蟲害的損失是增加糧食與飼料作物 產(chǎn)量的重要途徑。據(jù)統(tǒng)計全球糧食與飼料作物總產(chǎn)量每年因蟲害造成的損失達(dá)14%，直接 給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元。我國每年因蟲害造成的損失水稻減產(chǎn)10%、 小麥減產(chǎn)20%、棉花減產(chǎn)30%以上[夏啟中，張明菊，抗植物蟲害基因及其應(yīng)用，鄂州大學(xué) 學(xué)報，2005，(5) :56-60.]。采用噴施化學(xué)農(nóng)藥和生物殺蟲劑等防治手段固然可以減輕害 蟲對農(nóng)作物的為害，但化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，生物殺蟲劑成本較高。長期以來，大量噴施 化學(xué)殺蟲劑，不僅會增強(qiáng)害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴(yán)重污染環(huán) 境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。因此，減少殺蟲劑使用量，發(fā)展現(xiàn)代植物保護(hù)技術(shù)，已成 為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中必須正視的課題之一。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭 氏陽性細(xì)菌，是一種對害蟲毒力強(qiáng)且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人 無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種 害蟲有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, I CPs)，也稱 8 -內(nèi)毒素(delta-endotoxin) [Bravo. A.，Gill S. S.，Soberon M. Bacillus thuringiensis Mechanisms and Use. Comprehensive Molecular Insect Science Elsevier, 2005,175 206.]，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系[Schn印f. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D. R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998. 62(3) :775_806.]。從 1981 年，Schn印f 和 Whiteley 克隆 了第一個編碼 6 -內(nèi)毒素的crylAal基因，截止2008年6月已發(fā)現(xiàn)和克隆了 412種ICPs基因。蘇云金芽 胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、對人畜無害[De Maagd R. A.，Bravo A.，Crickmore N. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize the insect world. Trends Genet, 2001,17 :193 199.]，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防 治中得到了最廣泛的應(yīng)用。1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在美國獲準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來自Bt crylAc。在接下來的幾年里，轉(zhuǎn)crylAb基因的抗蟲玉米，轉(zhuǎn)cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距 問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/crylA基因的抗蟲棉以來，已經(jīng)被普遍 種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個12年(1996-2007)中，由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益， 農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年增加。2009年有25個國家的1400萬小農(nóng)戶和大農(nóng)場主種植了 1.34億公頃(3.3億英畝)的轉(zhuǎn)基因作物，比2008年增長了 7%，即900萬公頃(2200萬英 畝)，達(dá)到歷史最高點(diǎn)；相應(yīng)的“性狀或?qū)嶋H面積”增長了 8%，即相比2008年的1. 66億公頃，增長了 1400萬公頃，達(dá)到2009年的1. 8億公頃。1996年至2009年間轉(zhuǎn)基因作物種植 面積空前地增長了 80倍，使轉(zhuǎn)基因成為農(nóng)業(yè)近代史上利用最快的作物技術(shù)。 由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基 因組合來避免害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可以豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基 因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲效果，并且可以降低害蟲 對Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的對小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲等鱗翅目害蟲具有高毒力的蘇云 金芽孢桿菌晶體殺蟲蛋白基因序列，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性， 并克服、延緩害蟲對工程菌的抗藥性產(chǎn)生。對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID N02所示的第31 位-601位氨基酸序列。對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID N02所示的氨基酸序 列。對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX，其核苷酸序列編碼上述殺蟲基因蛋白 CryX0對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX，其具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX，其具有如SEQ ID N03所示的核苷酸序列。一種表達(dá)載體，其含有上述殺蟲基因cryX。所述表達(dá)載體為pUX，其結(jié)構(gòu)如圖4中所示。對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX在防治鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將上述殺蟲基因蛋白CryX制成殺蟲劑用于防治鱗翅目害蟲，或者將 上述殺蟲基因cryX轉(zhuǎn)入植物或微生物中表達(dá)抗鱗翅目害蟲的特性。所述植物為玉米。本發(fā)明是從菌株T03B001 (保藏號BGSC No. 4AP1，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植 物保護(hù)研究所取得)克隆得到的一個新基因，全長為1.8Kb，其核苷酸序列為SEQ ID N01, 其編碼的氨基酸序列為600個見SEQ ID N02所示，通過分析比例，該蛋白氨基酸序列的31 位至601位氨基酸是該蛋白的殺蟲活性區(qū)域。經(jīng)過殺蟲活性測定，該基因蛋白對小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲有高毒力。針對上述殺蟲活性區(qū)氨基酸序列，本發(fā)明設(shè)計合成了用于轉(zhuǎn)基因植物開發(fā)的DNA 序列，如SEQ ID N03所示。該合成序列導(dǎo)入到玉米中，對玉米螟有較好的抗蟲活性。


圖IcryX陽性克隆PCR鑒定其中1,1. 9kb PCR 產(chǎn)物 Μ，λ /Ecol30I圖2CryX在大腸肝菌中的表達(dá)
圖3序列比對圖Query 為 SEQ ID N03Sbjct 為原有 cryX 序列，即 SEQ ID N01圖4表達(dá)載體pUX構(gòu)建流程5植物表達(dá)載pUlAi的酶切鑒定其中M A DNA/Ecol30I, 1 :pUlAi/SacI+BamHI, 2 :pT8A/SacI+BamHI, 3 p3300-Ubi/Sac I+BamH I圖6抗性植株P(guān)CR檢測M :DM2000P :pUX CK 陰性對照1 9 部分轉(zhuǎn)基因植株圖7PCR陽性植株中CryX蛋白占可溶性蛋白比例圖8T0代轉(zhuǎn)基因植株的玉米螟生物活性測定A，B 未轉(zhuǎn)化植株C 轉(zhuǎn)基因植株
具體實(shí)施例方式菌株T03B001 (保藏號BGSC No. 4AP1，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究 所取得)殺蟲活性測定將菌株接種到LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72小時，至芽孢與晶體釋放。將芽孢與晶體 用滅菌水洗下來，懸浮起來，稀釋到1億芽孢每毫升的濃度用于殺蟲活性測定。以小菜蛾、 玉米螟、棉鈴蟲，測定對鱗翅目害蟲的殺蟲活性。結(jié)果顯示該濃度的芽孢晶體混合物對小菜 蛾、玉米螟、棉鈴蟲具有高活性。三種試蟲的死亡率都為100%。設(shè)計引物擴(kuò)增cryX全長基因用solexa方法對T03B001基因組測序。利用已經(jīng)報道的Bt殺蟲基因作為比對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因篩選。結(jié)果如下表所示，其 中contig00361編碼的基因與crylCa最為相似，但是得分(score)也只有174，說明這是一 個新基因。 根據(jù)COntig00361編碼的基因設(shè)計了一對引物(LIU5/LIU3)，序列如下LIU5-ATGAATTCAAAGGAACATGATTATCT
LIU3-TTCAACAGGAATAAATTCAATTTTATCC通過PCR擴(kuò)增的方法，以T03B001的基因組為模版，克隆cryX基因全長，見圖1，連 接PEB表達(dá)載體得到陽性克隆。獲得的重組表達(dá)載體質(zhì)粒命名為pEBs6。用pfuDNA聚合酶，用如下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。。 超純水補(bǔ)至50 u L，混勻離心，加石蠟油30 u L。擴(kuò)增循環(huán)94°C變性1分鐘，54 °C退火1分鐘，72°C延伸4分鐘，25個循環(huán)，最后 72°C延伸10分鐘。如圖1所示。cryX全長基因序列分析對陽性克隆進(jìn)行測序，得到基因全長序列。連接方案載體0. 1-0. 2u g目的片段 DNA0. 5-1. 0u g5 X Ligation Buffer 2 u LT4DNALigase1 u L用超純水補(bǔ)足體積到10 u L，充分混勻，16°C連接4h或4°C連接過夜。轉(zhuǎn)化方案1.挑取單菌落于5ml LB震蕩培養(yǎng)過夜；2.按接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C，230rpm培養(yǎng)2-2. 5hr，(OD600 = 0. 5-0.6)；3. 4°C,4, OOOrpm 離心 lOmin ；4.棄上清，加入預(yù)冷的0. 1M CaCl250ml懸浮細(xì)胞，置于冰上30min以上；5. 4°C，4，OOOrpm 離心 lOmin,回收細(xì)胞；6.用2_4ml冰預(yù)冷的0. 1M CaCl2重懸細(xì)胞，分裝成200 u 1/0. 5mL離心管中，于
4°C保存(可保存一周)。7.取200 ill感受態(tài)細(xì)胞與5 ii L連接產(chǎn)物充分混勻，冰浴30min。8. 42°C熱激 1. 5min,冰浴 3min。9.加入 800 u 1 LB 培養(yǎng)基 37°C培養(yǎng) 45min。10.取200iU涂板，加入相應(yīng)的抗生素，及IPTG，X_gal，37°C培養(yǎng)?；蛉L1.8kb，見SEQ ID N01，翻譯蛋白共601個氨基酸，見SEQ ID N02。通過 利用在線分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi)比對，使用蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫比對(Conserved Domain Database)分析，該蛋白氨基酸序列SEQ ID N02的31 至601位氨基酸是該蛋白的殺蟲活性區(qū)域。cryX 的表達(dá) 提取JMllO陽性克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Rosetta (λ DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)過程如下1)活化菌種(37°C、12hr)；2) 10%接種于 LB 培養(yǎng)基中(37°C、2hr)；3)加入誘導(dǎo)物 IPTG，150rpm, 18_22°C低溫誘導(dǎo) 4_20h ；4)離心收集菌體，加入IOmM Tris · Cl (pH 8. 0)懸浮；5)破碎菌體(超聲波破碎完全)；離心 12，OOOrpm 10min4°C ；收集上清及沉淀各10-15 μ L，分別電泳檢測。聚丙烯酰胺凝膠配置如下。分離膠8% (ml)堆積膠 5% (ml)Distilled water4.62.730% Degassed Acrylamide2.70. 671. 5M Tris (pH8. 8)2.51. OM Tris (pH6. 8)0.510% SDS0.10. 0410% APS0.10. 04TEMED0. 0060. 004上樣上樣10-15 μ 1，電泳:130-150V 恒壓。染色與脫色電泳后取出凝膠，用蒸餾水沖洗后，放入染色液中，60rpm振蕩染色 Ihr左右，脫色液中脫色2hr左右，脫色至凝膠背景透明，清水中漂洗至蛋白帶清晰。cryX 基因可以表達(dá)約66kD的蛋白(見圖2)。殺蟲活性測定以小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲為例測定蛋白對鱗翅目的殺蟲活性，見由表1、表2，3， 結(jié)果可知CryX蛋白對鱗翅目害蟲有高毒力。敏感小菜蛾的生物活性測定結(jié)果如表1，各濃度重復(fù)4次，每重復(fù)接蟲15頭。表1，CryX對敏感小菜蛾的生物活性測定 敏感小菜蛾的生物活性測定結(jié)果顯示CryX對敏感小菜蛾有高毒力。對敏感亞洲玉米螟的生物活性測定見表2，各濃度重復(fù)3次，每重復(fù)接蟲24頭表2，CryX敏感亞洲玉米螟的生物活性測定 對敏感亞洲玉米螟的生物活性測定結(jié)果顯示QrX敏感亞洲玉米螟有高毒力。對棉鈴蟲的生物活性測定見表3，各濃度重復(fù)3次，每重復(fù)接蟲24頭。表3CryX敏感棉鈴蟲的生物活性測定結(jié)果 對敏感棉鈴蟲的生物活性測定結(jié)果顯示，CryX敏感棉鈴蟲的生物活性表現(xiàn)為高效 抑制發(fā)育。CryX蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用根據(jù)CryX蛋白的殺蟲活性區(qū)氨基酸序列設(shè)計合成了可以用于轉(zhuǎn)基因植物開發(fā)的 DNA序列，如SEQ ID N03。去除了多聚腺苷酸化信號19個，GC含量提高了 15.2%。該序列 具有GC含量為50.4%的特征；含有利于植物表達(dá)的序列，具體見SEQ3。在基因上游添加了 Q序列序列，在基因3’端添加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號。該合成序列由組成型Ubiquitin啟動子驅(qū)動，導(dǎo)入到玉米中，對玉米螟螟有較好 的抗蟲活性。SEQ ID NO 3GGATCCAAGCTTTCTAGACCCGGGCCTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACATGAACTCAAAGGAGCACGACTACCTAAAGGTGTGTAATGACTTGAGCGATGCCAACATTAACATGGAGCGGTTTGACAAGAATGATGCGCTGGAAATCGGCATGTCCATCGTCTCCGAACTTATCGGTATGATTCCAGGCGGAACAGCCTTGCAGTTCGTGTTCAATCAGTTGTGGTCTCGTCTGGGTGACTCTGGCTGGAATGCGTTCATGGAACACGTGGAAGAGTTGATTGATACGAAGATCGAAGGGTATGCCAAGAACAAAGCCTTATCAGAACTCGCAGGCATTCAGAGAAACCTTGAGACCTACATCCAACTGCGCAACGAATGGGAGAACGACATCGAGAACTCCAAGGCTCAAGGCAAGGTAGCCAACTATTACGAGAGTCTTGAGCAGGCGGTTGAGAGGAGCATGCCTCAGTTTGCAGTGGAAAACTTTGAGGTACCACTTTTGACTGTCTACGTGCAAGCTGCCAATCTTCACTTGCTCCTCCTGAGGGATGTGTCAGTGTATGGCAAGTGCTGGGGTTGGTCGGAGCAGAAGATCAAGATCTACTACGACAAGCAGATCAAGTACACCCATGAGTACACCAATCACTGTGTCAACTGGTATAACAAAGGCCTTGAGAGACTCAAAAACAAAGGTTCCTCCTACCAAGACTGGTACAACTATAATCGCTTCCGCAGAGAGATGACTCTTACTGTTCTCGACATCGTTGCTCTCTTCCCGCACTATGATGTCCAGACGTATCCGATAACCACCGTTGCTCAGCTAACCAGGGAAGTGTACACGGATCCGCTGCTTAACTTCAACCCCAAACTCCACTCCGTGTCCCAACTGCCTAGCTTCAGCGACATGGAGAATGCGACCATCCGGACTCCACATCTGATGGAGTTCCTCCGGATGCT
AACCATCTACACAGATTGGTACAGTGTGGGCAGGAACTACTACTGGGGTGGACATCGCGTGACGTCCTACCATGTAGGTGGCGAGAATATACGATCACCTCTGTATGGTCGGGAGGCCAACCAAGAGGTTCCCAGAGACTTCTACTTCTATGGACCGGTCTTCAAGACGCTCTCAAAGCCGACTCTAAGACCACTGCAGCAGCCTGCACCAGCTCCTCCGTTCAATCTCCGTAGCCTGGAGGGAGTCGAGTTCCACACTCCCACAGGTAGCTTCATGTATCGCGAGAGAGGGTCGGTAGATTCCTTCAATGAGTTGCCCCCCTTCAATCCAGTTGGGTTACCTCACAAGGTCTACAGTCACCGTCTGTGTCATGCGACGTTTGTTCGCAAGTCTGGGACCCCCTATCTCACAACAGGAGCCATCTTTTCGTGGACACATCGCAGTGCTGAAGAGACCAACACCATAGAATCGAACATCATTACGCAGATCCCGTTAGTCAAAGCGTATCAGATTGGGTCAGGCACTACTGTCAGGAAAGGCCCAGGCTTCACAGGAGGGGACATACTTCGAAGGACAGGTCCTGGCACCTTTGGCGACATGAGGATAAACATCAATGCACCACTCTCTCAGAGGTACCGTGTCAGGATTCGCTACGCCTCTACGACAGATCTCCAGTTCGTCACGAGCATCAATGGGACCACCATCAACATTGGCAACTTCCCGAAGACGATCAACAATCTGAACACTCTGGGTTCTGAGGGCTACCGGACAGTCTCGTTTAGCACTCCCTTCAGCTTCTCGAATGCACAAAGTATCTTTCGACTGGGCATACAAGCGTTTTCTGGGGTTCAAGAAGTGTATGTGGACAAGATTGAGTTTATTCCGGTTGAA tTACCATAAGGAl) GAACTTTGATAAGGTACCCTCGAGGAGCTCT CCGAATTC下劃線為Q序列，邊框?yàn)镵EDL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號，上游添加了 BamH I、Hindlll、 XbaI、XmaI、SmaI、NcoI，下游添加了 SacI、EcoRI酶切位點(diǎn)，便于載體構(gòu)建。合成序列與原有核苷酸序列有83. 75%的相似性。比對情況見圖3。圖 3 中，Query :SEQ3Sbjct 原有 cryX 序列Alignment of query(upperline)and subject (lowerline)Identity = 83. 75% (1510/1803)Gap = 0. 00% (0/1803)植物表達(dá)載體構(gòu)建用BamH I和Sac I雙酶切中間載體p3300_Ubi，將回收的載體片段分別與用同樣 兩個限制性內(nèi)切酶消化的cryX片段相連，構(gòu)建流程見圖4，酶切鑒定(圖5)證明植物表達(dá) 載體PUX構(gòu)建成功，該載體含有由組成型啟動子Ubiquitin驅(qū)動的cryX基因，篩選標(biāo)記為 bar基因。玉米遺傳轉(zhuǎn)化玉米的控制授粉(1)玉米抽雄后，用大口袋套住雄穗，下面用別針別住，收集花粉；(2)雌穗花絲未抽出前，用小口袋將其套住，并用大頭針別好；(3)在授粉的前一天，當(dāng)花絲伸出約2cm長時，用剪刀剪去花絲的頂部，促進(jìn)其伸 長；(4)第二天，當(dāng)花絲伸長后，依下列組合進(jìn)行授粉(前為母本，后為父本)齊31X 綜31 ；(5)授粉后系上小牌，寫上授粉的品種和日期，10 12天后收獲；幼胚的剝離和培養(yǎng)(1)將新收獲的玉米雌穗去掉苞葉、花絲，花絲一定要去干凈，可用酒精燈將未除 凈的花絲燒去；用小刀去掉雌穗的頭尾部分；
(2)將雌穗浸在70%乙醇中滅菌30sec ； (3)將雌穗取出，浸在2. 5%的次氯酸納中滅菌10 15min，可以在溶液中加幾滴 Tween20 ；(4)用滅菌水清洗3次，用濾紙擦去殘留的水珠，置于無菌的環(huán)境中備用；(5)將一只槍式鑷子從頂部插入雌穗，用左手持住鑷子，右手用裝有#21刀片的手 術(shù)刀切去籽粒的上半部分；(6)換上#10刀片，將刀尖插入籽粒下部的果皮與胚乳之間，將胚乳挑出；(7)用刀尖將粘在胚乳頂部或頂部果皮內(nèi)的幼胚轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，操作要小 心，不要損傷幼胚。放置時注意胚軸(較平的一面)向下，盾片向上，每皿約放置20 30 個；(8) 27 28°C暗培養(yǎng)3 4周，使之開始脫分化，形成愈傷組織；此后，選擇生長迅 速、質(zhì)地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養(yǎng)，每2 3周繼代一次，選擇生長良好的愈傷準(zhǔn) 備基因槍轉(zhuǎn)化；(9)在射擊前4hr，將切成小塊的愈傷轉(zhuǎn)移到含0.4M甘露醇的高滲培養(yǎng)基上；(10)射擊后，使愈傷在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，恢
復(fù)培養(yǎng)一周。用基因槍進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化(1)打開超凈臺，用70%乙醇擦拭超凈臺內(nèi)部和基因槍的表面及內(nèi)部；(2)打開紫外燈，滅菌30min ；(3)按前述步驟準(zhǔn)備微彈；(4)易裂片、微彈載體、阻攔網(wǎng)滅菌(置于70%乙醇中l(wèi).Omin，放在濾紙上自然風(fēng) 干)；(5)打開氣瓶，調(diào)節(jié)壓力至2，OOOpsi ；(6)按前述方法安裝微彈載體和微彈；(7)將易裂片、阻攔網(wǎng)和微彈載體安裝進(jìn)固定裝置中；射擊參數(shù)為Gap distance :20mm ；微彈載體飛行距離(Macroprojectile flight distance) :10mm;微彈飛 ^fS&m (Particle flight distance) :7cm ;J￡力:1, 350psi ；^2SiS :25inches Hg.；(8)把培養(yǎng)皿放在托盤上，使愈傷都集中在托盤中間的圓圈內(nèi)，將托盤插入倒數(shù)第 二檔；(9)打開基因槍的電源；(10)打開真空泵；(11)關(guān)閉基因槍的門，按下“抽真空”鍵(Vac)，當(dāng)真空表讀數(shù)達(dá)到25incheS Hg.時，使鍵置于“保持(Hold) ”檔；(12)按下“射擊(Fire) ”健直到射擊結(jié)束；(13)按下“放氣”健，使真空表讀數(shù)歸零；(14)打開基因槍門，取出培養(yǎng)皿，蓋好蓋子并用封口膜封好；(15)重復(fù)上述步驟，直至完成轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化愈傷組織的篩選和植株的再生(1)將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織置于黑暗中，28°C培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)移到N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 7天；(2)將愈傷轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上(含PPT20mg/L)，兩周繼代一次，選擇色澤正常、 分化良好的愈傷，棄去衰老死亡的愈傷。每皿的培養(yǎng)物不宜過多，愈傷塊應(yīng)盡量小些，并使 愈傷緊貼培養(yǎng)基；(3)繼代3 4次后，將愈傷移至N6分化培養(yǎng)基上，在光周期為亮/暗=16/8， 28°C條件下培養(yǎng)，每兩周繼代一次；(4)將發(fā)生綠芽的愈傷組織切分；(5)當(dāng)小植株長到1 2cm高時，轉(zhuǎn)移進(jìn)三角瓶中(含MS生根培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)；(6)3 4葉期且根系較發(fā)達(dá)時，將小苗移入小花盆中，移入溫室培養(yǎng)；二周后移入 大花盆，直至開花結(jié)實(shí)。轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA的提取-SDS法1.稱取0. 2g的葉片放入1. 5ml離心管，用液氮充分研磨成粉末。2.加入 500ii 1 SDS-Buffer(100mM Tris,50mM EDTA, 500mM NaCl，pH 8.0)，混勻。再加入20iU 20% SDS，輕輕混勻后置于65°C水浴10分鐘。3.加入250 u 1 5M KAC，混勻，冰上放置30分鐘。4. 4°C離心，12000rpm, 10 分鐘。5.取上清，移入新的離心管中，加入等體積的異丙醇中，冰浴5分鐘。6. 4°C離心，12000rpm, 10 分鐘。7.棄上清，70%乙醇洗滌兩次，真空干燥DNA后，加入40 ill無菌雙蒸水溶 解，-20°C保存?zhèn)溆?。PCR檢測
反應(yīng)體系40 u 1
10XPCR buffer4u 1
dNTPs(2. 5mM)3. 2u 1
引物對(10 uM)各 1. 6iil
模板1 u 1
Taq 聚合酶(5U/u 1)0. 4u 1
超純水補(bǔ)至40 u 1
PCR反應(yīng)條件
94°C預(yù)變性5min
72°C 延伸 lOmin
16 °C lmin終止反應(yīng)
檢測引物12
JclXF AAAGCCTTATCAGAACTCGCJclXR GACATCATAGTGCGGGAAGA經(jīng)過抗性篩選得到9株抗性植株，提取抗性植株基因組，以其做模板，進(jìn)行PCR檢 測，共得到5株P(guān)CR陽性植株(圖6)。提取PCR陽性植株可溶性蛋白，3號植株CryX蛋白 的含量最高可占總可溶蛋白的0.21%。(見圖7)PCR陽性植株的生物活性測定將PCR陽性植株移栽，當(dāng)植株生長到6 8葉時，將玉米螟初孵幼蟲接于心葉中， 以未轉(zhuǎn)化植株作為陰性對照，接蟲2周后調(diào)查食葉級別。結(jié)果顯示，人工接蟲玉米螟后，轉(zhuǎn) 基因植株單株間的抗蟲性表現(xiàn)有一定差異轉(zhuǎn)基因植株對玉米螟表現(xiàn)為抗性，沒有或只有 很小的玉米螟危害的蟲孔(圖8)，未轉(zhuǎn)化植株被玉米螟咬食嚴(yán)重，葉片蟲孔大且蟲孔數(shù)目 多，已影響到植株的正常生長。表4Tq代轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性統(tǒng)計
權(quán)利要求
對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的第31位-601位氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因蛋白CryX，其具有如SEQID N02所示的氨基酸序列。
3.對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX，其核苷酸序列編碼權(quán)利要求1或2所述的殺 蟲基因蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX其具有如SEQID N01所 示的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求3所述的對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX，其具有如SEQID N03 所示的核苷酸序列。
6.一種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求3、4、5任一所述的殺蟲基因cryX。
7.如權(quán)利要求6所述的表述載體，其為pUX，結(jié)構(gòu)如圖4中所示。
8.對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX在殺害鱗翅目害蟲中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，為將權(quán)利要求1或2所述的殺蟲基因蛋白CryX制成殺蟲 劑用于殺害鱗翅目害蟲，或者將權(quán)利要求5所述的殺蟲基因cryX轉(zhuǎn)入植物或微生物中，表 達(dá)抗鱗翅目害蟲的特性。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明涉及“對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因cryX及其應(yīng)用”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。對鱗翅目害蟲高毒力的殺蟲基因蛋白CryX，其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。編碼該蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO1所示。該基因表現(xiàn)出鱗翅目害蟲的高毒力，將其改造序列SEQ ID NO3應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物或植物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌的抗藥性產(chǎn)生。
文檔編號C12N1/15GK101870979SQ20101019638
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者劉東明, 宋福平, 張 杰, 束長龍, 耿麗麗, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所