專利名稱：一種鑒別牛及其早期胚胎性別的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的說，涉及一種牛及其早期胚胎性別的鑒定方法。
背景技術：
動物的某些生產(chǎn)性狀受性別限制或受性別影響，如奶牛只有母牛才表現(xiàn)產(chǎn)奶性 狀，而肉牛生產(chǎn)中公畜因為生長速度快而具有較高的經(jīng)濟價值，為充分發(fā)揮奶牛的繁殖能 力和公牛的生長優(yōu)勢，人為控制牛的性別一直是人們追求的目標，因此快速準確地鑒別家 畜早期胚胎性別并實施性別控制技術，是提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益的重要措施。以往的PCR性別鑒定均采用持家基因作為內(nèi)標引物，利用性別特異的Sry基因設 計引物進行雙重PCR擴增分析，并且多采用巢式PCRfcested-PCR)或基因組預擴增的方法 對DNA模板進行富集，操作繁瑣，費時費力，易污染，技術難度較大，不便于現(xiàn)場操作。而單重PCR法由于僅擴增Y染色體特異引物，避免了多重PCR中常染色體弓I物對Y 染色體特異引物擴增的影響，方法簡便，但由于反應中沒有內(nèi)標引物作為內(nèi)部標記，就可能 將沒有發(fā)生反應的樣品誤判為雌性，從而增加了鑒別結果假陰性的幾率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種可檢測牛及其早期胚胎性別的特異PCR擴增引物。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種利用上述引物檢測牛及其早期胚胎性別的PCR方法。本發(fā)明對牛牙釉基因在X、Y染色體上的等位基因序列(GI :29126030和GI 29126032，序列報道長度分別為6451bp和6264bp)進行了序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因在Y 染色體上的等位基因序列存在缺失，針對缺失位點，在其上下游設計了一對引物AML395，其 核苷酸序列如表1所示(也見隨附的序列表SEQ ID NO. 1&2)表1引物AML395序列及相關信息 利用所述引物對存在于X、Y染色體的牙釉基因兩個等位基因進行擴增檢測，可以 得到長395bp的Y染色體等位基因特異產(chǎn)物和長458bp的X染色體等位基因特異產(chǎn)物。當 同時檢測到長度約為395bp的擴增產(chǎn)物和長度約為458bp的產(chǎn)物條帶時，表明被檢測個體 為雄性胚胎；當只檢測到長度為458bp的產(chǎn)物條帶時，表明被檢測個體為雌性胚胎。本發(fā)明通常采用20yL PCR反應體系，其中Taq酶1.5U，dNTP濃度為200μπιΟ1/L，引物濃度為 180pmol/L，各離子濃度分別為 20mmol/L Tris-HCl、20mmol/L KC1、1. 5mmol/ L MgCl2和10mmol/L(NH4) 2S04，擴增產(chǎn)物采用GoldViewnaTMI熒光染料(靈敏度比EB高10 倍左右)染色觀察。因為不論是雄性胚胎還是雌性胚胎樣品都能檢測到特異產(chǎn)物，所以不會產(chǎn)生假陽 性和假陰性，因此避免了由于使用內(nèi)標引物帶來的復雜雙重PCR，降低了檢測的技術難度， 檢測過程更加簡便，檢測結果也更加靈敏、可靠。本發(fā)明進一步提供一種用于上述PCR擴增的優(yōu)化PCR反應程序，該反應程序為 940C 3min ；然后 94°C 1S，55°C 1S，循環(huán) 29 次；72°C 3min。本發(fā)明同時通過改變傳統(tǒng)PCR反應的擴增條件，而實現(xiàn)30 40分鐘左右完成PCR 擴增。本發(fā)明所述的方法不涉及任何專有儀器，只利用現(xiàn)有常規(guī)儀器和國產(chǎn)化試劑即可 實現(xiàn)檢測目的，減少了應用中對專有生產(chǎn)廠商的依賴性，大大降低了鑒別成本，此外，本領 域的一般技術人員均可實施本發(fā)明。當然，本領域技術人員很容易將本發(fā)明的引物與相關的試劑制備成試劑盒，以方 便適用。本發(fā)明方法成本低廉、操作簡單、快速、準確、可靠、實用。


圖1為公牛和母牛血液DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，其中，bl_b8道為母牛血液 PCR擴增結果，檢測到了一條458bp的X染色體特異擴增條帶；al_a4為公牛血液PCR擴增 結果，除了檢測到一條458bp的X染色體特異擴增條帶外，還檢測到了一條395bp的Y染色 體特異條帶，檢測結果與預想的性別完全一致；ck為陰性對照，M為MarkerK以下各圖均采 用本分子量標記)，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp ；圖2為體外培養(yǎng)的已知性別魯西黃牛耳成纖維細胞的擴增結果，其中1 6道為 10個細胞樣品的PCR擴增結果；7 12道為5個細胞樣品的PCR擴增結果；M為DNA分子 量標準；13 18為1個細胞樣品的PCR擴增結果；19為陰性對照；泳道1 3、7 9、12、 13 15分別為公牛樣品，4 6、10、11、16 18分別為母牛樣品。所有樣品擴增結果均與 預期性別一致，并且從單個細胞中均檢測到了清晰的性別特異PCR產(chǎn)物條帶。圖3為胚胎的性別鑒定結果，其中，1道為空白對照；2 7、10 13道為胚胎樣 品擴增結果；8、9道為已知性別牛基因組DNA擴增結果；M道為DNA分子量標準。其中3、2 是來自于1號胚胎的兩個二分胚，4、5是2號胚胎的兩個二分胚，6、7是3號胚胎的兩個二 分胚，10、11是4號胚胎的兩個二分胚，12、13是5號胚胎的兩個二分胚。檢測結果，圖示的 5枚胚胎，1、4號胚胎為雄性胚胎，2、3、5號胚胎為雌性胚胎，各胚胎的兩個二分胚的擴增結 果均相同，都呈現(xiàn)出與已知陽性對照一樣清晰可辨的特異性擴增產(chǎn)物。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1 以牛血液DNA為模板進行PCR擴增各取公牛和母牛100 μ L抗凝血于1. 5mL高壓滅菌PCR管中，加Iml雙蒸水，充分混勻。冰浴5 10分鐘后12000rpm離心1分鐘，棄去上層液體；向血液細胞中加入100 μ 1 雙蒸水充分吸打混勻，煮沸5 10分鐘，然后立即冰浴3 5分鐘。以12000rpm離心5分 鐘，取上清于另一離心管中即可用于PCR檢測，或-20°C保存?zhèn)溆?。引物設計依據(jù)GenBank中收錄的性染色體上的牙釉基因序列(GI 29126030和GI 29126032，序列報道長度分別為6451bp和6264bp)，設計引物AML395，由上海英俊生物技術 有限公司合成，引物序列及相關的信息見表1。表1引物AML395序列及相關信息 PCR反應體系的建立取按上述方法制備的牛血液DNA樣品各1 μ L，采用20 μ L PCR擴增反應體系，其中 Taq酶1. 5U, dNTP濃度為200 μ mol/L,性別特異引物AML395濃度為180pmol/L。各離子濃 度分別為 20mmol/LTris-HCl、10mmol/L(NH4)2S04、20mmol/L KCl 禾Π 1. 5mmol/L MgCl20PCR 反應條件94°C 3min ；然后 94°C IS, 55°C IS,循環(huán) 29 次；72°C 3min。在120V電壓下，采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測分析，電泳時間約為 20min，采用GoldViewna 〗熒光染料(靈敏度比EB高10倍左右)進行染色，凝膠成像結果 如圖1所示。其中，bl-b8道為母牛血液PCR擴增結果，al_a4為公牛血液PCR擴增結果， ck為陰性對照，M為Marker I，從下至上的條帶依次為IOObp、200bp、300bp、400bp、500bp和 600bp。結果表明公牛血液PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)了 395bp及458bp兩條帶，母牛血液PCR結果則 僅有458bp條帶。陰性對照均不存在上述條帶。說明本發(fā)明方法可信度高，不存在非特異 性擴增。實施例2 培養(yǎng)細胞的性別鑒定將體外培養(yǎng)的魯西黃牛耳成纖維細胞(分別來源于母牛和公牛)，用胰酶消化后 在體視顯微鏡下按照1細胞、5細胞、10細胞梯度，分裝于0. 2ml PCR管中，然后分別加入 PCR反應所用試劑，其中Taq酶1. 5U，dNTP濃度為200 μ mol/L，引物AML395濃度為180pmol/ L,各離子濃度分別為 20mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L(NH4)2S04,20mmol/L KCl 禾Π 1. 5mmol/L MgCl2,最后用水補足體積至20 μ L。PCR 擴增程序94°C 3min ； (94°C IS, 55°C IS)循環(huán) 29 次；72°C 3min。全部反應時 間為40min。如實施例1那樣進行電泳檢測分析，PCR結果如圖2所示。其中1 6道為10個 細胞樣品的PCR擴增結果；7 12道為5個細胞樣品的PCR擴增結果；M為DNA分子量標 準；13 18為1個細胞樣品的PCR擴增結果；19為陰性對照；泳道1 3、7 9、12、13 15分別為公牛樣品，4 6、10、11、16 18分別為母牛樣品。不同的細胞均獲得了與預期 性別一致的擴增結果，并且清晰地檢測到了各單個細胞的性別特異PCR產(chǎn)物條帶，說明了本方法的性別特異性與靈敏度。實施例3 牛胚胎細胞樣品的性別鑒定將單個牛胚胎移入底部劃道的塑料平皿(直徑100mm)的切割液滴內(nèi)，用玻璃切割 針在體視顯微鏡下將胚胎置于淺道上。將胚胎進行二分胚切割。切割完成后，用移液器取 出切割樣品分別移到不同的滅菌PCR管中，標記好后置于-20°C冷藏待用或直接進行性別鑒定。向含有待測樣品的PCR反應管中分別加入PCR反應所用試劑，其中Taq酶 1. 5U, dNTP 濃度為 200 μ mol/L, AML395 濃度為 180pmol/L。各離子濃度分別為 20mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L (NH4) 2S04,20mmol/L KCl 禾Π 1. 5mmol/L MgCl2，最后用水定容至 20 μ L。PCR 擴增程序94°C 3min ； (94°C IS, 55°C IS)循環(huán) 29 次；72°C 3min。全部反應時 間為40min。如實施例1那樣進行電泳檢測分析，部分胚胎樣品PCR擴增產(chǎn)物電泳結果如圖3 所示。1道為空白對照；2 7、10 13道為胚胎樣品擴增結果；8、9道為已知性別?；?組DNA擴增結果；M道為DNA分子量標準。其中3、2是1號胚胎的兩個二分胚，4、5是2號 胚胎的兩個二分胚，6、7是3號胚胎的兩個二分胚，10、11是4號胚胎的兩個二分胚，12,13 是5號胚胎的兩個二分胚。檢測結果表明，在圖示的5枚胚胎中，有3枚雌性胚胎和2枚雄性胚胎，并且每個 胚胎的兩個二分胚的擴增結果均相同，都與已知的血液陽性對照一樣呈現(xiàn)出清晰可辨的特 異性擴增產(chǎn)物，證明了本方法的可靠性。
權利要求
一種進行?；蚺Ｔ缙谂咛バ詣e鑒定的引物，其包括SEQ IDNO.1和2所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述引物在胚胎性別鑒定中的應用。
3.含有權利要求1所述引物的鑒定?；蚺Ｔ缙谂咛バ詣e的PCR試劑盒。
4.一種進行胚胎性別鑒定的方法，其采用權利要求1所述引物或權利要求3所述試劑 盒對牛早期胚胎樣品進行PCR擴增，并對其擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，判斷被檢 測胚胎的性別。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，采用權利要求1所述引物進行擴增時，只具 有長度為458bp的擴增產(chǎn)物條帶的個體為雌性胚胎，具有長度為395bp和458bp兩條特異 產(chǎn)物條帶的個體為雄性胚胎。
6.如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為94°C3min ；然后94°C 1S，55°C 1S，循環(huán) 29 次；72°C 3min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測?；蚺Ｔ缙谂咛バ詣e的引物及其應用。利用牛牙釉基因在兩個性染色體上的等位基因存在序列長度多態(tài)特點，在相應位點上設計了一對引物，所述引物包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列，本發(fā)明利用上述引物采用快速PCR方法對牛早期胚胎進行擴增檢測，可在雄性胚胎中檢測到長約395bp的Y染色體特異產(chǎn)物條帶和長約458bp的X染色體特異產(chǎn)物條帶，但只能在雌性胚胎中檢測到長約458bp的X染色體特異產(chǎn)物條帶。本方法只通過一對引物的PCR擴增，在任意胚胎細胞中均能擴增出性別特異PCR產(chǎn)物，不需設計內(nèi)標引物，即可實現(xiàn)對被檢個體的性別鑒定，成本低廉，操作簡便且快速、準確，避免了傳統(tǒng)雙重PCR方法和巢式PCR方法的復雜操作和較復雜擴增條件的摸索。
文檔編號C12Q1/68GK101892309SQ20101018274
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權日2010年5月19日
發(fā)明者吳承疆, 朱化彬, 杜衛(wèi)華, 林博, 王棟, 程金華, 趙學明, 郝海生 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所