專利名稱：鑒定奶牛早期胚胎性別的多重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定奶牛早期胚胎性別的多重PCR方法，屬于動(dòng)物繁殖技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
奶牛是單胎動(dòng)物，由于妊娠期長(zhǎng)、繁殖率低和性別限制等因素的影響，其年增長(zhǎng)率 只有20%左右。因此性別控制技術(shù)與繁殖新技術(shù)的結(jié)合對(duì)奶牛業(yè)發(fā)展具有十分重要的意 義。19世紀(jì)70年代中期胚胎移植技術(shù)廣泛應(yīng)用以來，奶牛胚胎性別的早期鑒定成為研究的 熱點(diǎn)，很多方法被用于奶牛的胚胎性別鑒定中。而PCR技術(shù)因其高效、快速的特點(diǎn)得到快速 的發(fā)展。目前，多種基于PCR技術(shù)的家畜早期胚胎性別鑒定方法已經(jīng)建立，主要有巢式PCR 法，單重PCR法，兩步PCR法，LAMP法，多重PCR法等。巢式PCR法所需時(shí)間長(zhǎng)；兩步PCR法， 增加了鑒定所用的時(shí)間及污染的機(jī)會(huì)；單重PCR法只對(duì)Y-染色體特異片段進(jìn)行擴(kuò)增，沒有 內(nèi)部標(biāo)記，假陰性幾率高；LAMP法雖然具有簡(jiǎn)單、快速、特異性高、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但是由于其 成本較高使其推廣應(yīng)用受到了限制。因此，準(zhǔn)確、快速、實(shí)用的PCR性別鑒定技術(shù)仍是當(dāng)前 生產(chǎn)實(shí)踐中的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒定奶牛早期胚胎性別的多重PCR方法， 通過改善傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)體系中引入牛Y染色體特異性引物和牛常染色 體共有序列引物的組合，優(yōu)化反應(yīng)體系組份配比和反應(yīng)條件，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和 實(shí)用的奶牛早期胚胎性別鑒定技術(shù)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種鑒定奶牛早期胚胎性別的多重PCR方法，其特征在于其是將以下2對(duì)不同的引物 引入下述PCR反應(yīng)體系中在下述反應(yīng)條件下一次性擴(kuò)增出不同的目標(biāo)產(chǎn)物 牛Y染色體特異性引物序列
正向引物5，一CTGTCATTCTACTCTACTGTTTTCCCC—3，； 反向引物5，一GATGTTATTATCTCTTTTCAGGTTTT—3，； 內(nèi)標(biāo)引物序列
正向引物5’ 一TCGTCAGAAACCGCACACTG— 3，； 反向引物5’ 一TGGAAGCAAAGAACCCCGCT— 3，；
所述PCR反應(yīng)體系為總體積20 μ L，其中Mg2+濃度為1. 5mmol/L, dNTP濃度為 200ymol/L, Y-染色體特異引物濃度為150pmol/L，內(nèi)標(biāo)引物濃度為50pmol/L，模板量為 Γ10個(gè)胚胎細(xì)胞DNA, Taq酶1. 4U ；
所述反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行循環(huán)條件95°C變性30秒，55°C退火30 秒，72 °C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。所述Y染色體特異性引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物為344bp，所述內(nèi)標(biāo)引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物為216bp。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明中引入了牛常染色體共有片段引物作為內(nèi)標(biāo)引物， 避免了單重PCR法單一擴(kuò)增Y染色體特異引物可能因反應(yīng)失敗而造成的假陰性，進(jìn)而造成 誤判的現(xiàn)象，提高了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。利用本發(fā)明的方法，只需一次PCR反應(yīng)即可完成奶 牛早期胚胎的性別鑒定，操作簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。


圖1為常量牛血液基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖2為微量牛血液基因組DNA不同濃度梯度樣品和已知性別奶牛胚胎DNA樣品擴(kuò)增產(chǎn) 物的電泳圖3為奶牛體內(nèi)胚胎DNA樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1牛血液DNA的性別鑒定 1、血液模板DNA制備
取公、母牛各兩頭的血液樣品，ACD抗凝，采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA， TE溶解。用0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。將 DNA 樣品分別稀釋至 20ng/ μ L、50pg/ μ L、20pg/ μ L 和 IOpg/ μ L，用于 PCR 檢測(cè)，或-20°C
保存?zhèn)溆谩?、多重PCR反應(yīng)
按以上方法制備的牛血液基因組DNA各濃度樣品分別取1 μ L，作為反應(yīng)模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為總體積20 μ L，其中Mg2+濃度為1. 5mmol/L, dNTP濃度為 200ymol/L, Y-染色體特異引物濃度為150pmol/L，內(nèi)標(biāo)引物濃度為50pmol/L，Taq酶 1. 4U，模板DNA分別為上述牛血液基因組DNA各濃度樣品。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行循環(huán)條件95°C變性30秒，55°C退 火30秒，72 °C延伸30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。3、多重PCR產(chǎn)物的檢測(cè)
取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μ L 6 X Loading Buffer，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色， 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果如圖1和圖2所示。其中，圖1為血液基因組DNA模板為20ng的 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，M為分子量標(biāo)記，泳道1和2是模板為雄性血液樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3 和4是模板為雌性血液樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道5為空白對(duì)照。由圖1可見，泳道1和2中同 時(shí)出現(xiàn)344bp和216bp的兩條帶，鑒定為雄性，泳道3和4中只出現(xiàn)216bp的一條帶，鑒定 為雌性，檢測(cè)結(jié)果與血液樣品來源牛只性別一致。圖2中M為分子量標(biāo)記，泳道1為空白對(duì) 照，泳道2 5是模板為雄性血液樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6 8是模板為雌性血液樣品的擴(kuò) 增產(chǎn)物。泳道2和6為模板為10 pg/ μ L的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道3和7為模板為20 pg/ μ L的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道4和8為模板為50 pg/ μ L的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測(cè)結(jié)果與血 液樣品來源牛只性別一致。實(shí)施例2已知性別冷凍胚胎的性別鑒定 1、胚胎模板DNA制備將已知性別的冷凍胚胎解凍后，用倒置顯微鏡和分割刀切取中、晚期囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對(duì) 面的滋養(yǎng)層細(xì)胞5 10個(gè)，置于滅菌的PCR管中，瞬時(shí)離心后備用。2、多重PCR反應(yīng)
取按以上方法制備的胚胎DNA樣品作為模板，利用實(shí)施例1建立的多重PCR反應(yīng)體系 和反應(yīng)條件對(duì)已知性別胚胎模板DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。 3、胚胎性別鑒定
取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μ L 6 X Loading Buffer，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色， 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果見圖2。其中，M為分子量標(biāo)記，泳道1為空白對(duì)照，泳道5為雄性 胚胎樣品擴(kuò)增結(jié)果，泳道9為雌性胚胎樣品擴(kuò)增結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果與胚胎的已知性別一致。實(shí)施例3奶牛體內(nèi)胚胎的性別鑒定 1、胚胎模板DNA制備
供體奶牛超數(shù)排卵處理后，檢出可用胚胎6枚，分別在倒置顯微鏡下用電動(dòng)胚胎分割 儀取2 10個(gè)細(xì)胞，吸取至滅菌的PCR管內(nèi)(管內(nèi)預(yù)先加入8 μ L滅菌超純水)，瞬時(shí)離心后2、多重PCR反應(yīng)
取按以上方法制備的胚胎DNA樣品5 μ L，作為模板DNA，利用實(shí)施例1建立的多重PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)胚胎DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。3、胚胎性別鑒定
取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μ L 6 X Loading Buffer，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色， 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果見圖3。其中，M為分子量標(biāo)記，泳道1 一 6為胚胎樣品擴(kuò)增結(jié)果。 鑒定結(jié)果表明泳道1、2和6為雌性胚胎，泳道3、4和5為雄性胚胎。對(duì)鑒定后的胚胎進(jìn)行移植，產(chǎn)犢后對(duì)照驗(yàn)證表明，產(chǎn)犢結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果一致。
權(quán)利要求
1.一種鑒定奶牛早期胚胎性別的多重PCR方法，其特征在于其是將以下2對(duì)不同的引 物引入下述PCR反應(yīng)體系中，在下述反應(yīng)條件下一次性擴(kuò)增出不同的目標(biāo)產(chǎn)物牛Y染色體特異性引物序列正向引物5，一CTGTCATTCTACTCTACTGTTTTCCCC—3，； 反向引物5，一GATGTTATTATCTCTTTTCAGGTTTT—3，； 內(nèi)標(biāo)引物序列正向引物5’ 一TCGTCAGAAACCGCACACTG— 3，； 反向引物5’ 一TGGAAGCAAAGAACCCCGCT— 3，；所述PCR反應(yīng)體系為總體積20 μ L，其中Mg2+濃度為1. 5mmol/L, dNTP濃度為 200 μ mol/L，Y-染色體特異性引物濃度為150pmol/ L，內(nèi)標(biāo)引物濃度為50pmol/ L，模板量 為Γ10個(gè)胚胎細(xì)胞DNA, Taq酶1. 4U ；所述反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行循環(huán)條件95°C變性30秒，55°C退火30 秒，72 °C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定奶牛早期胚胎性別的多重PCR方法，其特征在于所 述Y染色體特異性引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物為344bp，所述內(nèi)標(biāo)引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物為216bp。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒別奶牛早期胚胎性別的多重PCR方法，即在PCR反應(yīng)體系中引入牛Y染色體特異性引物和牛常染色體共有序列引物的組合，并優(yōu)化反應(yīng)體系組份配比和反應(yīng)條件，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和實(shí)用的奶牛早期胚胎性別鑒定技術(shù)。利用本發(fā)明的方法，只需一次PCR反應(yīng)即可完成牛早期胚胎的性別鑒定，且操作簡(jiǎn)便快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102061339SQ201010580929
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者吳占軍, 張峰, 張新同, 李魁英, 王學(xué)清, 王昆, 王棟 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所